專利名稱：一種ebv病毒豚鼠動物模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物模型的建立方法，特別涉及一種豚鼠EB病毒動物模型的建立方法，屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
EBV病毒的全稱為Epstein-Barr virus,是由epstein和barr于1964年首次成功地使用burkitt非洲兒童的淋巴瘤細(xì)胞，通過體外懸浮培養(yǎng)而建立的病毒株。EBV在人群中具有普遍感染性，在全球范圍內(nèi)，有90%以上的人被EBV感染過。EBV主要通過唾液傳播，也可經(jīng)血液傳染。感染多發(fā)生在幼兒時期，一般不伴隨或只伴隨較弱的臨床癥狀。EBV的感染能夠誘導(dǎo)多種惡性腫瘤的產(chǎn)生，包括伯基特淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤等， 并常與其他病毒感染相關(guān)聯(lián)，如HIV。目前還沒有有效治療EBV感染的藥物，對因EBV感染而引起的致癌，目前還得不到有效地防治或治療。而為了治療EBV相關(guān)疾病，必須更深入地研究EBV，這就需要建立一種便于研究EBV的動物模型。自EBV被發(fā)現(xiàn)至今，在已公開的EBV動物模型中，只有少數(shù)的幾種靈長類動物對EBV最為易感，但隨著靈長類動物數(shù)量的急劇減少，以及靈長類動物價格的不斷飆升，昂貴的靈長類動物模型實(shí)驗(yàn)已不能再繼續(xù)，嚴(yán)重制約著人們對EBV的進(jìn)一步深入研究。因此，有必要研發(fā)新的、實(shí)用的、有效的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以對EBV進(jìn)行更加深入的研究，最終獲得能夠治療EBV感染的藥物，防治因EBV感染而引起的各種癌癥。豚鼠是一種常見的實(shí)驗(yàn)動物，已廣泛應(yīng)用于傳染病研究，且對多種病毒易感，同時容易飼養(yǎng)、性格溫順、體積小巧，很適合實(shí)驗(yàn)操作。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有EBV病毒動物模型只對少數(shù)幾種靈長類動物易感，而靈長類動物又因數(shù)量少、價格昂貴以及維系生態(tài)平衡等諸多因素，不再繼續(xù)使用，從而制約著人們對EBV的深入研究，進(jìn)而難于獲得治療EBV感染的藥物，不能防治由EBV感染而引起的各種癌癥，等諸多問題，本發(fā)明提供一種對EBV最為易感，并能用豚鼠取代靈長類動物的EBV病毒動物模型及其建立方法。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成一種EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟
A、將O.Iml病毒滴度為I. OX IO6 I. OX IO7的EBV病毒液經(jīng)豚鼠鼻腔滴鼻，進(jìn)行EBV病毒接種；
B、接種后I周，取5ml豚鼠血液與5mlRPMI 1640培養(yǎng)基混勻，加于IOml豚鼠淋巴細(xì)胞分離液之上，2000r/min離心20min,使細(xì)胞分為四層；
C、收集第二層細(xì)胞并放入5ml含RPMI1640培養(yǎng)基中，混勻，1500r/min離心20min，分離出的沉淀用RPMI 1640培養(yǎng)基反復(fù)重懸洗2次后收集；
D、在步驟C收集的淋巴細(xì)胞上加入ImlTRIZOL，常溫靜置lh，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色無分相，室溫靜置5min,4°C 13500r/min離心15min,取上層液并加入等體積異丙醇，混勻，靜置IOmin, 4°C 13500r/min離心IOmin,去上清，向沉淀物中加入Iml -201^ 冷的質(zhì)量濃度為75%的乙醇，清洗，4°C，13500r/min離心5min，去上清，室溫放置干燥后用RNase free dH20 溶解，得到總 RNA ;
E、采用20μ L反應(yīng)體系對步驟D得到的總RNA進(jìn)行RT逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
F、以cDNA為模板用Nested-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀察并攝片；
G、回收步驟F的目的DNA片段，經(jīng)純化后，將目的DNA片段連接在pGEM_T載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定后，測序，建立起EBV病毒豚鼠動物模型。所述步驟E 的反應(yīng)體系包括MgCl2, 4 μ I ;Reverse Transcription IOX Buffer,2 μ I ；dNTP Mixture,2 μ I ；Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor,0. 5 μ I ；AMV Reverse Transcriptase, 15u ；01igo (dT) 15 Primer, 0. 5 μ g ；total RNA ,lug；Nuclease-Free Water 補(bǔ)至 20 μ I ;反應(yīng)條件為42。C 15 minutes, 95。C 5 minutes,,4° C 5 minutes ;使用β-Actin基因做內(nèi)參用于評價提取的RNA質(zhì)量。所述步驟F的Nested-PCR擴(kuò)增為取2 μ L cDNA加入到48 μ L PCR反應(yīng)體系中。EBNAl第一輪PCR程序94°C預(yù)變性2min，94°C熱變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，72°C延伸5min。第二輪PCR程序94°C預(yù)變性2min，94°C熱變性30s，53°C退火30s，72 °C延伸30s，35個循環(huán)，72 °C延伸5min ；BcLFl第一輪PCR程序94°C預(yù)變性 2min，94°C 熱變性 lmin，64°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min，40 個循環(huán)，72°C 延伸 5min。第二輪PCR程序94°C預(yù)變性Imin，94°C熱變性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，35個循環(huán)，72°C延伸5min。經(jīng)Nested-PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀察并攝片。所述步驟F的Nested-PCR擴(kuò)增中的引物核酸序列為
目的基因?yàn)镋BNAl的引物序列
Fl :5’ -TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，
Rl :5’ -CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’ ；
F2 :5， -ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3，，
R2 :5’ -GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’ ； 目的基因?yàn)锽cLFl的引物序列
Fl :5’ -TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，
Rl :5’ -TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’
F2 :5， -ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3，，
R2 :5’ -TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’
目的基因?yàn)棣?Actin的引物序列
F :5’ -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’
R :5’ -GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’。本發(fā)明對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下技術(shù)效果豚鼠在接種EBV病毒后，其抗EBV病毒IgG抗體水平明顯增高，并能在數(shù)月內(nèi)維持較高水平；經(jīng)RT-PCR、NeSted-PCR檢測到豚鼠體內(nèi)有EB病毒相關(guān)抗原表達(dá)。此模型的建立能在病毒學(xué)及免疫學(xué)基礎(chǔ)上，對EBV病毒包括病原學(xué)、免疫學(xué)、發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究，以在相關(guān)藥物的篩選、疫苗評價等應(yīng)用方面起到重要作用。


圖I為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，圖中上部為BcLFl的檢測結(jié)果，目的片段長度為181 bp ;圖中下部為EBNAl的檢測結(jié)果，目的片段長度為178 bp ;1 Γ 0#為10只實(shí)驗(yàn)組豚鼠，10只對照組豚鼠檢測結(jié)果全為陰性未在圖上列出；Μ代表DL2000 Marker.圖2、圖3為肺病理分析結(jié)果，圖2 (A)為實(shí)驗(yàn)組1#豚鼠肺，出現(xiàn)肺間質(zhì)充血水腫，炎癥細(xì)胞侵潤，肺泡壁增厚，支氣管見少量分泌物；圖3 (B)為對照組肺，正常。圖4、圖5為脾臟病理分析結(jié)果，圖2 (A)為實(shí)驗(yàn)組2#豚鼠脾，出現(xiàn)脾小體增生；圖5 (B)為對照組脾，正常。 圖6、圖7為腮腺病理分析結(jié)果，圖6 (A)為實(shí)驗(yàn)組6#豚鼠的腮腺，出現(xiàn)大面積細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞侵潤；圖7 (B)為對照組腮腺，正常。圖8、圖9、圖10、圖11、圖12為肝臟病理分析結(jié)果，圖8 (A)為實(shí)驗(yàn)組2#豚鼠肝臟，圖9 (B)為實(shí)驗(yàn)組4#豚鼠肝臟，圖10 (C)為實(shí)驗(yàn)組6#豚鼠肝臟，圖11 (D)為實(shí)驗(yàn)組7#豚鼠肝臟，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞侵潤；圖12 (E)為對照組肝臟，正常。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。I動物選擇
選擇4周齡，雄性，體重16(Γ 200 g的Hartley SPF級豚鼠20只，接種前經(jīng)血清學(xué)檢測EBV抗體呈陰性。2毒種制備
毒種由B95-8細(xì)胞制得，B95-8細(xì)胞為中國科學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所疫苗研究室保存。3病毒接種
20只豚鼠，分兩組，實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組豚鼠由鼻腔滴鼻接種O. Iml EBV病毒液，病毒滴度為I. OX IO6 I. OX IO7 ;對照組豚鼠鼻腔滴鼻O. Iml PBS。4豚鼠一般特征觀察
每天觀察精神狀態(tài)、活動力、飲食、體重、毛順滑度。5特異性指標(biāo)檢測
5.I豚鼠外周血淋巴細(xì)胞分離采用心臟采血方式，采取豚鼠5ml血液于肝素鈉采血管中，與5ml RPMI 1640培養(yǎng)基混勻，加于IOml豚鼠淋巴細(xì)胞分離液之上，2000r/min離心分離20min，此時離心管中由上至下細(xì)胞分四層，收集第二層細(xì)胞放入含RPMI 1640培養(yǎng)基5ml的試管中，充分混勻后1500r/min離心分離20min，分離出的沉淀用RPMI 1640培養(yǎng)基反復(fù)重懸洗2次后收集。5.2 RNA提取向分離制得的淋巴細(xì)胞加入Iml TRIZOL常溫靜置lh。加入O. 2ml氯仿，上下顛倒至乳白色無分相現(xiàn)象。室溫靜置5min,4°C 13500r/min離心15min,取出離心管，取上層于新管中加等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置lOmin。4°C 13500r/min離心lOmin。去上清，向含有沉淀的離心管加入Iml -20°C預(yù)冷的75%乙醇，輕輕顛倒清洗。4°C,13500r/min離心5min。去上清,打開離心管蓋,室溫放置干燥后用RNase free dH20溶解。5. 3 RT-PCR :采用20 μ L反應(yīng)體系進(jìn)行RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，體系包 MgCl2, 4 μ I ；Reverse Transcription IOX Buffer, 2 μ I ; dNTP Mixture,2 μ I; Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor, 0. 5 μ I;AMV ReverseTranscriptase, 15u;Oligo(dT) 15 Primer, 0. 5 μ g; total RNA , I μ g;Nuclease-FreeWater 補(bǔ)至 20 μ I。反應(yīng)條件42。C 15 minutes, 95。C 5 minutes, 4。C 5 minutes。使用β -Actin基因做內(nèi)參用于評價提取的RNA質(zhì)量。5.4 Nested-PCR :以 cDNA 為模板采用 Nested-PCR 擴(kuò)增，取2 μ L cDNA 加入到 48yLPCR反應(yīng)體系中。EBNAl第一輪PCR程序94°C預(yù)變性2min，94°C熱變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸 lmin, 35 個循環(huán)，72°C延伸 5min。第二輪 PCR 程序94°C預(yù)變性 2min，94°C熱變性30s，53。。退火30s，72。。延伸30s，35個循環(huán)，72°C延伸5min ；BcLFl第一輪PCR程序941預(yù)變性21^11，941熱變性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸2min，40個循環(huán)，72 °C延 伸5min。第二輪PCR程序94°C預(yù)變性lmin，94°C熱變性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸
I.5min，35個循環(huán)，72°C延伸5min。經(jīng)Nested-PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀察并攝片。PCR結(jié)束后EBNAl目的片段大小應(yīng)為178 bp，BcLFl目的片段大小應(yīng)為181 bp。Nested-PCR擴(kuò)增中的引物核酸序列為
目的基因?yàn)镋BNAl的引物序列
Fl :5’ -TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，
Rl :5’ -CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’ ；
F2 :5， -ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3，，
R2 :5’ -GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’ ；
目的基因?yàn)锽cLFl的引物序列
Fl :5’ -TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，
Rl :5’ -TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’
F2 :5， -ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3，，
R2 :5’ -TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’
目的基因?yàn)棣?Actin的引物序列
F :5’ -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’
R :5’ -GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’
5.5目的片段測序鑒定目的片段與DNA marker DL2000作比較確認(rèn)大小正確后對目的DNA片段進(jìn)行回收，純化后的DNA連接在pGEM-T載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定確認(rèn)無誤后送至測序公司測序。5. 6抗EBV IgG抗體水平檢測每只豚鼠在接種病毒后，分別于1、2、3、4、6、8、10、12、14、18、22、26、30周對豚鼠心臟采血，取0. 5ml血樣于I. 5ml離心管中。37°C放置Ih,4°C過夜后分離血清。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測特異性VCA-IgG與EBNA-IgG的水平。每孔包被抗原IOOng，血清稀釋200倍。將IOug加入IOml包被液中混勻，向酶標(biāo)板中每孔加入lOOul，置于封閉濕盒4°C過夜。回收包被液，拍干酶標(biāo)板，加入BSA稀釋液每孔200ul，置于封閉濕盒，37°C封閉2h。棄廢液，拍干酶標(biāo)板。取5ul血清樣品加入995ulBSA稀釋液混勻，混勻后取IOOul加入酶標(biāo)板，每個樣加三個孔。置于封閉濕盒，37°C孵育lh。棄廢液，拍干酶標(biāo)板，加洗液潤洗，共4次，每次7min，拍干酶標(biāo)板。取25ul羊抗豚鼠二抗于IOmlBSA稀釋液中混勻，混勻后每孔加入lOOul，置于封閉濕盒，37°C孵育lh。棄廢液，拍干酶標(biāo)板，加洗液潤洗，共4次，每次7min，拍干酶標(biāo)板。每孔加入IOOul顯色液，顯色l(T20min，每孔加入IOOul加終止液。顯色結(jié)果使用酶標(biāo)儀在450nm和655nm雙波長下讀取OD值。5. 7病理檢測將實(shí)驗(yàn)動物處死后取淋巴結(jié)、脾臟、肺、肝臟、腮腺組織用10%福爾馬林固定，制作組織切片，染色，在顯微鏡下觀察。6檢測結(jié)果
6.I PCR結(jié)果PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示10只實(shí)驗(yàn)組豚鼠中有6只檢測到BcLFl的表達(dá)1#、2#、3#、4#、5#、6#為陽性，其中4只檢測到了 EBNAl的表達(dá)1#、3#、 5#、6#為陽性，對照組的10只豚鼠PCR檢測均為陰性，參見圖I。6. 2 ELISA檢測結(jié)果實(shí)驗(yàn)組豚鼠在接種EBV后30周內(nèi)VCA-IgG、EBNA-IgG抗體水平均有所升高，明顯高對照組，其中VCA-IgG抗體水平變化比較明顯。6. 3病理分析結(jié)果病理切片分析結(jié)果顯示10只實(shí)驗(yàn)組豚鼠中有5只豚鼠的腮腺，肺，脾臟，肝臟等器官組織發(fā)生不同程度的病變。其中1#豚鼠出現(xiàn)肺間質(zhì)充血水腫，炎癥細(xì)胞侵潤，肺泡壁增厚，參見圖2 ；2#豚鼠出現(xiàn)脾小體增生，參見圖3 ；6#豚鼠腮腺發(fā)生炎癥細(xì)胞侵潤、大面積細(xì)胞壞死，參見圖4 ；2#豚鼠、4#豚鼠、6#豚鼠、7#豚鼠的肝臟出現(xiàn)炎癥細(xì)胞侵潤，參見圖5 ；10只對照組豚鼠的器官均為正常未發(fā)生病變。實(shí)施例I
20只豚鼠，分兩組，實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組豚鼠由鼻腔滴鼻接種0. Iml EB病毒液，病毒滴度為I. OX IO6 ;對照組豚鼠鼻腔滴鼻0. Iml PBS0應(yīng)用特異性檢測指標(biāo)檢測。實(shí)施例2
20只豚鼠，分兩組，實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組豚鼠由鼻腔滴鼻接種0. Iml EB病毒液，病毒滴度為5. OX IO6 ;對照組豚鼠鼻腔滴鼻0. Iml PBS0應(yīng)用特異性檢測指標(biāo)檢測。實(shí)施例3
20只豚鼠，分兩組，實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組豚鼠由鼻腔滴鼻接種0. Iml EB病毒液，病毒滴度為I. OX IO7 ;對照組豚鼠鼻腔滴鼻0. Iml PBS0應(yīng)用特異性檢測指標(biāo)檢測。表I為接種病毒后30周內(nèi)豚鼠血漿中VCA-IgG、EBNA_IgG水平變化，數(shù)值為OD值，以X ± s表不。表I
權(quán)利要求
1.一種EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟 A、將O.Iml病毒滴度為I. OX IO6 I. OX IO7的EBV病毒液經(jīng)豚鼠鼻腔滴鼻，進(jìn)行EBV病毒接種； B、接種后I周，取5ml豚鼠血液與5mlRPMI 1640培養(yǎng)基混勻，加于IOml豚鼠淋巴細(xì)胞分離液之上，2000r/min離心20min,使細(xì)胞分為四層； C、收集第二層細(xì)胞并放入5ml含RPMI1640培養(yǎng)基中，混勻，1500r/min離心20min，分離出的沉淀用RPMI 1640培養(yǎng)基反復(fù)重懸洗2次后收集； D、在步驟C收集的淋巴細(xì)胞上加入ImlTRIZOL，常溫靜置lh，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色無分相，室溫靜置5min,4°C 13500r/min離心15min,取上層液并加入等體積異丙醇，混勻，靜置IOmin, 4°C 13500r/min離心IOmin,去上清，向沉淀物中加入Iml -201^ 冷的質(zhì)量濃度為75%的乙醇，清洗，4°C，13500r/min離心5min，去上清，室溫放置干燥后用RNase free dH20 溶解，得到總 RNA ; E、采用20μ L反應(yīng)體系對步驟D得到的總RNA進(jìn)行RT逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ； F、以cDNA為模板用Nested-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀察并攝片； G、回收步驟F的目的DNA片段，經(jīng)純化后，將目的DNA片段連接在pGEM_T載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定后，測序，建立起EBV病毒豚鼠動物模型。
2.如權(quán)利要求I所述的EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于所述步驟 E 的反應(yīng)體系包括MgCl2, 4 μ I ；Reverse Transcription IOX Buffer, 2 μ I ；dNTPMixture,2 μ I ；Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor,0.5 μ I ；AMV ReverseTranscriptase,15u ；01igo(dT) 15 Primer,0. 5 μ g ；total RNA , I μg;Nuclease-FreeWater 補(bǔ)至 20 μ I ;反應(yīng)條件為42。C 15 minutes, 95。C 5 minutes, ,4。C 5 minutes ；使用β -Actin基因做內(nèi)參用于評價提取的RNA質(zhì)量。
3.如權(quán)利要求I所述的EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于所述步驟F的Nested-PCR擴(kuò)增為取2 μ L cDNA加入到48 μ L PCR反應(yīng)體系中，EBNAl第一輪PCR程序94°C預(yù)變性2min，94°C熱變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸Imin, 35個循環(huán)，72 °C延伸5min ;第二輪 PCR 程序94°C預(yù)變性 2min，94°C熱變性 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 30s，35個循環(huán)，72°C延伸5min ;BcLFl第一輪PCR程序94°C預(yù)變性2min，94°C熱變性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸2min，40個循環(huán)，72°C延伸5min ;第二輪PCR程序94°C預(yù)變性lmin，94°C熱變性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 I. 5min, 35 個循環(huán)，72°C延伸 5min，經(jīng) Nested-PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀察并攝片。
4.如權(quán)利要求I所述的EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，其特征在于所述步驟F的Nested-PCR擴(kuò)增中的引物核酸序列為 目的基因?yàn)镋BNAl的引物序列Fl :5’ -TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，Rl :5’ -CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’ ；F2 :5， -ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3，，R2 :5’ -GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’ ； 目的基因?yàn)锽cLFl的引物序列Fl :5’ -TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，Rl :5’ -TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’F2 :5， -ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3，，R2 :5’ -TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’目的基因?yàn)棣?Actin的引物序列F :5’ -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’R :5’ -GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種EBV病毒豚鼠動物模型的建立方法，經(jīng)過對豚鼠進(jìn)行EBV病毒接種；豚鼠外周血淋巴細(xì)胞分離；RNA提取；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄；Nested-PCR擴(kuò)增；對目的DNA片段進(jìn)行回收、純化后，將DNA連接在pGEM-T載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定后，送至測序公司測序，建立起EBV病毒豚鼠動物模型，以便對EBV病毒包括病原學(xué)、免疫學(xué)、發(fā)病機(jī)理等進(jìn)行研究，以在相關(guān)藥物的篩選、疫苗評價等應(yīng)用方面起到重要作用。
文檔編號C12Q1/70GK102812924SQ201210047649
公開日2012年12月12日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者劉國超, 胡云章, 胡凝珠, 王海漩 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所