專利名稱：一種腸道病毒檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，具體涉及一種一種腸道病毒檢測試劑盒，尤其涉及一步法四重?zé)晒舛縍T-PCR在同一個反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測患者糞便或者咽拭子標(biāo)本中CoxBl、CoxB2、CoxB3和腸道病毒核酸檢測方法，可應(yīng)用于CoxBl、 CoxB2、CoxB3和腸道病毒引起的暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急診斷及臨床診斷。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒(Coxsackievirus, CV)是由 Dalldoff 和 Sickles 于 1948 年首次從紐約市柯薩奇鎮(zhèn)的一名類脊髓灰質(zhì)炎患者的糞便中分離得到。它屬小RNA病毒科的腸道病毒屬(enteroviruses),對乳鼠的敏感性很高,根據(jù)它們感染乳鼠產(chǎn)生的病灶不同,柯薩奇病毒可以分為A、B兩組。其中A組有23型病毒，B組有6型病毒。1956年Javett首次報(bào)道病毒性心肌炎(viral myocardit, VMC)主要由柯薩奇病毒引起。心肌炎是一種心肌局灶性或彌漫性病變，其特征為間質(zhì)性炎性細(xì)胞浸潤， 心肌壞死及變性。心肌炎與多種病毒及發(fā)病因素有關(guān)。病毒的直接作用和機(jī)體的免疫反應(yīng)是病毒性心肌炎的主要發(fā)病機(jī)制，臨床上以病毒性心肌炎最多見。臨床上病毒性心肌炎最常見的發(fā)病方式為一般型，發(fā)病前1-2周常有腸道或呼吸道感染史，如腹瀉、感冒等，然后出現(xiàn)乏力、面色蒼白、精神不振、胸悶氣短等癥狀，檢查可發(fā)現(xiàn)心臟擴(kuò)大，心律不齊或早搏等心臟異常體征。另外暴發(fā)型和隱匿型對患兒的威脅最大，必須引起重視。目前對病毒性心肌炎的臨床診斷，主要依靠臨床癥狀及常規(guī)生化檢查和心電圖，血生化檢查中最常用的指標(biāo)是心肌酶譜和心肌肌鈣蛋白。但是由于病毒性心肌炎發(fā)病初期的癥狀不典型，往往出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已經(jīng)累及心肌，引起心肌不可逆的損傷，造成嚴(yán)重后果。另外，醫(yī)院內(nèi)感染越來越受到重視，一巳發(fā)生院內(nèi)感染的爆發(fā)，后果無疑是非常嚴(yán)重的。因此，早期、及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷病原刻不容緩。傳統(tǒng)的診斷病毒感染的方法主要是病毒分離和血清學(xué)方法。病毒分離操作復(fù)雜， 耗費(fèi)時(shí)間長，容易導(dǎo)致污染，不便于臨床應(yīng)用。在臨床病原學(xué)診斷上，常規(guī)的血清學(xué)方法檢測抗體僅是一個反映感染的間接指標(biāo)，不能替代直接的病原學(xué)檢測，無法明確診斷感染病毒的種類。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有全封閉單管擴(kuò)增、簡便快捷、重復(fù)性好、可以實(shí)時(shí)定量，并且有效解決了擴(kuò)增產(chǎn)物污染等優(yōu)勢，克服了以往臨床傳統(tǒng)診斷的缺陷，具有高度的特異性和敏感性，為臨床病原診斷提供了一種有效、快速的檢測手段。隨著技術(shù)的改進(jìn)及方法的不斷完善，此技術(shù)已越來越多地應(yīng)用于臨床各科室，為臨床診斷提供了準(zhǔn)確、及時(shí)、高效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。但是單管實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測一種病原，不僅耗時(shí)耗力，也浪費(fèi)試劑耗材，因而建立可同時(shí)檢測多種病原的多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR診斷方法與診斷試劑尤其重要。本發(fā)明采用的單管一步法四重?zé)晒舛縍T-PCR，不僅能夠同時(shí)檢測CoxBI、CoxB2、 CoxB3以及其他腸道病毒，同樣具備較高的特異性和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種腸道病毒檢測試劑盒，是一種一步法四重?zé)晒舛?RT-PCR檢測試劑盒。本試劑盒包含定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、弓I物探針混合液、標(biāo)準(zhǔn)品 (CoxBU CoxB2、CoxB3、腸道病毒)、陽性對照品(CoxBl、CoxB2、CoxB3、腸道病毒)、陰性對照品，盒體設(shè)有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應(yīng)液管、酶混合液管、引物探針混合液管、標(biāo)準(zhǔn)品管(CoxBl、CoxB2、CoxB3、腸道病毒)、陽性對照品管(CoxBl、CoxB2、CoxB3、腸道病毒)、 陰性對照品管。其中定量RT-PCR反應(yīng)液含有PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等、引物探針混合液含四種病毒的特異性引物和相應(yīng)的四種不同熒光標(biāo)記的探針，且引物探針混合液管為棕色管，陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照為CoxBl、CoxB2、 CoxB3及腸道病毒的陽性質(zhì)粒樣品。
測用上游引物_下》引《3隊(duì)具相fi的特異性擇針評列如下=
上翻tt Co^l-F: 5、CACTCACGGTCCGAiffCRTCCA-y
CoxEUR y-TTTYTGAGTTRTTRGTGTATGT<3GCJff-3，
持異性探針 Co54Bl-P 5' -FAM-TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT-BHQ1-3’
上勝引物 G :B2-F' S1-GATCAGCATGTGTGTTrTACACGA^r
下齡引_ Coy32-R: 5*-GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA-3*
ft 昇性探針 C xB21. 5\CY5-TACACCAACAGCAAAAJffGCAGCCAA-BHQ2-3'
上—引CoxBS-F^ St-CCAGTAMCAGATAAAGTCGiffTCRTA-S1 了勝引W CokB3-R: S-AGGAARGGTATEGACATGCGTd
浦性腿 CoxBB-P S^HEX-CCAAGTGTCTTCTCtGACAGACtGGTAATGC-BHQ I- J J游引_RiI婦毒-F: 5'- CCCTGAATGCGGCTAAtCC-T 下—■丐陳藤道病釋-Rj 5’，.ATTGTCACCiffAAGCAfiOU 待異性探針I(yè)SiI病莓-P: .1DX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC.BHQ2.上述標(biāo)準(zhǔn)品包括CoxBl、CoxB2、CoxB3及腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)品，其保守區(qū)基因序列如下CGGTCCGAiff
CTATGCCACA
TGTCTGTHT
GAAGTTTGCG
ATAAAGTGGA
TGGACAGAGG
TGG
fXGCmMVC
TCGTAACGGG
TCCTTTTATC
CGTCCiaTGA
TACACCAATA
ACACGACATA
ACATGGAAGG
TfCKTKTGlA
GTAMGCACC
CAACTGCGGA TAACTCTGCA TTTStATTG G
AAATTTCCTG
ACTCAGAAAA
CACCAACAGC
TGAGTGTTAG
TGGCAAACTT
ACCACGCATG
GCACACc3CCC
GCGGAACCGA
CTGCTTMOG
CoxBl 序列 ACGTGAAAAA CTACCACTCA TGCCGGTCTG CCTGTGTiffA GGGGTTTGCA G AG 了 GG<JTTA 標(biāo)Itfi序列為s ATTTCCTTGC ACGMCAGCA AAAAATGCAG CCAJJtGAAAA ACAGGCTGCA CAACTGA CoxBS標(biāo)*SS序/_丨為I ACCAGGGGGT CCAGTACCAG CCACGAACCC AAGTGTGTTC TCC 織 CCTT TCCTGAGCiff . 痛脅標(biāo)権Sff.列為-AGTCCTCCGG CCCCTGAATG ACAACfCCAGC GCiOTACtTGTG CTACTTTGGG TGTCCGTGTT TGACAATTAA AGAATT
本發(fā)明提供的熒光定量試劑盒需于_20°C儲存，盡量減少反復(fù)凍融；引物探針混合液需避光條件保存。本發(fā)明的另一個目的是提供上述的一種腸道病毒檢測試劑盒在檢測CoxBl、 CoxB2、CoxB3以及其他腸道病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒的使用方法在每次標(biāo)本檢測中均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品用高溫高壓滅菌的DEPC水稀釋為IXIO3-IXiO8 Copies/ml O糞便樣品核酸的提取取0. 2g或200 便樣本加到EP管中，加入1.5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10s，然后室溫靜置lOmin，以SOOOiVmin離心5min。吸取200 0上清加入到 EP 管中，米用 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid extraction Kit II 或 QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini KU，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取，取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。核酸的檢測取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。反應(yīng)總體積為25吣其中定量RT-PCR反應(yīng)液12 5|11，酶混合液I 4，引物探針混合液(20umol/l，包含四種病毒的特異性引物和相應(yīng)的四種種熒光探針)共6 0，模板5 0，加水補(bǔ)足至25 M^lo在ABI7500熒光定量PCR儀(或者其他四色熒光以上的PCR儀)上進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為反轉(zhuǎn)錄50°C， 30min ；95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進(jìn)行四重?zé)晒鈾z測，共進(jìn)行40 個循環(huán)。熒光定量結(jié)果報(bào)告①CoxBl、CoxB2. CoxB3及腸道病毒檢測的各自Ct值對應(yīng)相應(yīng)的熒光標(biāo)記的病毒，檢測樣本Ct值為40、0和無數(shù)值時(shí)，報(bào)告為陰性。②檢測樣本Ct值 < 35時(shí)若腸道病毒Ct值< 35，同時(shí)CoxBl或CoxB2或CoxB3病毒的Ct值< 35，報(bào)告為 CoxBl或CoxB2或CoxB3陽性；單獨(dú)腸道病毒Ct值< 35，報(bào)告為腸道病毒陽性。③檢測樣本Ct值> 35且小于40的樣本，建議復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果Ct值< 37者，依據(jù)②的判斷標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告為相應(yīng)病毒陽性。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測標(biāo)本各種病毒的量(Copies/ml)。
本發(fā)明的有益之處是運(yùn)用一步法四重?zé)晒舛縍T-PCR技術(shù)，采用CoxBl、CoxB2、 CoxB3和腸道病毒高度特異的引物和熒光標(biāo)記探針，開發(fā)研制用于CoxBl、CoxB2、CoxB3和腸道病毒四重?zé)晒舛縍T-PCR檢測試劑盒。該發(fā)明是通過一個PCR反應(yīng)，可以從標(biāo)本中同時(shí)檢測出CoxBl、CoxB2、CoxB3和其他腸道病毒的存在，比傳統(tǒng)的普通PCR和單重?zé)晒舛?PCR方法更簡便、快速；尤其對屬于腸道病毒屬的CoxBl、CoxB2、CoxB3進(jìn)行雙重驗(yàn)證，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。同時(shí)，對檢測的病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量，對臨床上疑似腸道病毒感染的患兒，特別是小兒病毒性心肌炎患兒提供早期明確診斷，區(qū)分病毒感染的種類及滴度，為臨床治療方案的制定提供參考依據(jù)。


圖I為本試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本試劑盒同時(shí)檢測四種病毒陽性的實(shí)例。圖3為本試劑盒檢測CoxBl病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為IO8UO7UO6, 105、104、103 Copies/ml。圖4為本試劑盒CoxBl病毒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Copies/ml)的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為Ct值。圖5為本試劑盒檢測CoxB2病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、107、106、 105、104、103 Copies/ml。圖6為本試劑盒CoxB2病毒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Copies/ml)的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為Ct值。圖7為本試劑盒檢測CoxB3病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、107、106、 105、104、103 Copies/ml。圖8為本試劑盒CoxB3病毒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Copies/ml)的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為Ct值。圖9為本試劑盒檢測腸道病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、107、106、105、 104、103 Copies/ml。圖10為本試劑盒腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Copies/ml)的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為Ct值。
具體實(shí)施例方式下面具體實(shí)施例結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I
參見圖I，一種腸道病毒檢測試劑盒，包含定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物探針混合液、標(biāo)準(zhǔn)品(CoxBl、CoxB2、CoxB3、腸道病毒)、陽性對照品(CoxBl、CoxB2、CoxB3、腸道病毒)、陰性對照品，盒體7設(shè)有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應(yīng)液管I、酶混合液管2、引物探針混合液管3、陰性對照品管4、標(biāo)準(zhǔn)品管5 (包括CoxBl、CoxB2、CoxB3、腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)品， 共4管)、陽性對照品管6 (包括CoxBl、CoxB2、CoxB3、腸道病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品，共4管)。其中定量RT-PCR反應(yīng)液含有PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等、引物探針混合液含四種病毒的特異性引物和相應(yīng)的四種不同熒光標(biāo)記的探針，且引物探針混合液管為棕色管，陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照為CoxBl、CoxB2、 CoxB3及腸道病毒的陽性質(zhì)粒樣品。本發(fā)明提供的熒光定量試劑盒需于_20°C儲存，盡量減少反復(fù)凍融；引物探針混合液需避光條件保存。實(shí)施例2
I.材料與方法
I.I臨床標(biāo)本與病毒核酸
CoxBU CoxB2、CoxB3和腸道病毒的臨床樣本來源于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院、湖州市中心醫(yī)院以及浙江省內(nèi)其他幾家醫(yī)院近期患者的糞便或咽拭子標(biāo)本，樣本采集后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。陽性核酸均通過基因測序確認(rèn)。I. 2引物與探針
從美國的NCBI基因庫下載了涵蓋國內(nèi)外CoxBl、CoxB2、CoxB3以及腸道病毒的多條基因序列。利用DNAMAN軟件對其進(jìn)行了同源性比較，確定以上病毒基因組的保守區(qū)。使用 Primer Express 3. 0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)高度特異性的引物與Taqman探針、引物和探針序列均通過Blast驗(yàn)證，具有較好特異性。引物和探針序列如下，
上游獅 CosBl-F 5' - CACTCACGGTCCGAiffCRTCCA-B*
下網(wǎng) _ Crnm -Ri 5 * - mYTGACiTTR.TTRGTtiTATGTGGCiff-3*
待異性探針 CoxBl-P 5*-FAM-TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT-BHQ1-3*
Jlll弓 Bi C&A2-F. 5LGATC；AGCATGTGTGTTrTACACGAl TI#猶 cokB2-r. Si-Gcctgtctaacactcaccttcca-S*
待異性擇針 € :B2^P. 5' -CY5^TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCiy^BHQ2冊3*
上游引物 Co B3.F 5' -CCAGTAMCAGAmAAGTGGiTTClTA-3f 下+游弓 Cc.a3-R 5-AGGAARGGTATRG農(nóng)CATGCGTG-y
待異性探針 CosB3-P| y-HE3C-CCAA<3TGTGTTCTCIGACAGAG03mATGC%BHQl-3’
上游弓_臟講*F 5'. CCCTGAATGCGGCTAATCC-3'
不游引廳澧鑕霉-R y- ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3'
待異性Ii針I(yè)iiI綉毒-P. 5*-ROX-AACCGACTACTTTGGCTGTCCGTGTTTC--BHQ2-3*
以上引物和探針委托上海輝睿生物科技有限公司和上海生工生物工程有限公司合成。I. 3病毒核酸的提取與標(biāo)準(zhǔn)品定量標(biāo)準(zhǔn)
取0. 2g或200叫糞便樣本加到EP管中，加入I. 5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次 10s，然后室溫靜置IOmin,以8000r/min離心5min。吸取200叫上清加入到EP管中，采用 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid extraction Kit II 或 QIAGEN 公司的 QIAamp DNA Stool Mini KU，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取，取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。合成各病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品片段，將其連接到質(zhì)粒載體pMD19-T Simple Vector (TaKaRa公司)。轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)。鑒定后提取質(zhì)粒DNA，利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer測量質(zhì)粒DNA的濃度，確定DNA的拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品定量母液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將標(biāo)準(zhǔn)品定量母液稀釋至所需最高濃度，并做十倍稀釋至最低濃度，低溫保存?zhèn)溆?。I. 4四重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化
反應(yīng)總體積為25叫，其中定量RT-PCR反應(yīng)液12. 5 |ll，酶混合液I叫，引物探針混合液(20i!mOl/l，包含四種病毒的特異性引物和相應(yīng)的四種種熒光探針)共6屮，模板5叫， DEPC水補(bǔ)足至25 |11。在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為反轉(zhuǎn)錄50°C， 30min ；95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進(jìn)行四重?zé)晒鈾z測，共進(jìn)行40 個循環(huán)。結(jié)果判斷選擇熒光檢測模式FAM、HEX、ROX、CY5熒光基線選取3_15個循環(huán)時(shí)的熒光信號，以閾值線稍高于陰性對照品的最高點(diǎn)作為閾值，若樣本呈典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陽性；若無典型的擴(kuò)增曲線，則判斷為陰性。體系的優(yōu)化試驗(yàn)，在以同一濃度陽性核酸作為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從I 20ii mol/1,探針濃度從I 20ii mol/1,采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增加值(△ Rn)選擇最佳引物和探針濃度。I. 5四重?zé)晒舛縍T-PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)
選擇CoxBl、CoxB2、CoxB3和腸道病毒的陽性核酸(均通過基因測序鑒定)和近期來源于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院、湖州市中心醫(yī)院以及浙江省內(nèi)其他幾家醫(yī)院的臨床樣本提取核酸，用CoxBl、CoxB2、CoxB3和腸道病毒四重?zé)晒舛縍T-PCR方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證方法的特異性；對已標(biāo)定拷貝數(shù)(Copies/ml)的CoxBl (IO8 Copies/ml)、CoxB2 (IO8 Copies/ml)、CoxB3 (IO8 Copies/ml)和腸道病毒(IO8 Copies/ml) 分別稀釋后，平行進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，比較其靈敏度。此外，對每一個濃度的陽性核酸稀釋液作6次重復(fù)檢測，得到的Ct值計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。2 結(jié)果
2.I四重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系及條件
該方法的反應(yīng)總體積為25叫，其中其中定量RT-PCR反應(yīng)液12.5叫，酶混合液I 0 引物探針混合液(20i!mOl/l，包含四種病毒的特異性引物和相應(yīng)的四種熒光探針)共bpl ，模板5 M-IjDEPC水補(bǔ)足至25叫。在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為反轉(zhuǎn)錄50°C，30min ;95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進(jìn)行四重?zé)晒鈾z測， 共進(jìn)行40個循環(huán)?？色@得最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度。2. 2特異性試驗(yàn)
本發(fā)明建立的一步法四重?zé)晒舛縍T-PCR方法對CoxBl、CoxB2、CoxB3和腸道病毒具有較好的特異性，近期采集的臨床標(biāo)本也檢測出陽性反應(yīng)。CoxBl、CoxB2、CoxB3引物探針與其他病毒如輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、腺病毒、EV71、CoxA16、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等均無交叉反應(yīng)，腸道病毒通用引物探針與以上除EV71、CoxAie腸道病毒的其他病毒均無交叉反應(yīng)。該方法同時(shí)檢測四種病毒陽性的結(jié)果參見圖2，其中I為腸道病毒，2為 CoxB2，3 為 CoxBl,4 為 CoxB3。2. 3敏感性試驗(yàn)
對CoxBl、CoxB2、CoxB3和腸道病毒敏感性檢測試驗(yàn),將已標(biāo)定拷貝數(shù)(Copies/ml) 的 CoxBl (IO8 Copies/ml )、CoxB2 (IO8 Copies/ml )、CoxB3 (IO8 Copies/ml)和腸道病毒 (IO8 Copies/ml)分別十倍梯度稀釋后，用本試劑盒進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示該方法檢測CoxBl 病毒敏感性為IO3 Copies/ml，結(jié)果參見圖3，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖4 ;CoxB2病毒敏感性為IO3Copies/ml，結(jié)果參見圖5，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖6 ;CoxB3病毒敏感性為IO3 Copies/ml，結(jié)果參見圖7，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖8;腸道病毒敏感性為IO3 Copies/ml，結(jié)果參見圖9，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖10。2. 4重復(fù)性試驗(yàn)
分別取 CoxBl (終濃度為 IO6 Copies/ml )、CoxB2 (IO6 Copies/ml )、CoxB3 (IO6 Copies/ ml)和腸道病毒(IO6 Copies/ml),按10倍梯度稀釋成3個不同的濃度,對每一個濃度的樣本作6個重復(fù)檢測，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0. 09 0. 28之間，變異系數(shù)均低于I. 0%，具有較好的重復(fù)性(結(jié)果見表I)。
表I BI熒曼定畺FX^PCR檢測痛粵核性
權(quán)利要求
1. 一種腸道病毒檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合 液、引物探針混合液、CoxBl標(biāo)準(zhǔn)品、CoxB2標(biāo)準(zhǔn)品、CoxB3標(biāo)準(zhǔn)品、腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)品、CoxBl 陽性對照品、CoxB2陽性對照品、CoxB3陽性對照品、腸道病毒陽性對照品、陰性對照品，盒 體(7)設(shè)有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應(yīng)液管(1)、酶混合液管0)、引物探針混合液 管(3)、陰性對照品管(4)、標(biāo)準(zhǔn)品管(5)、陽性對照品管(6)，標(biāo)準(zhǔn)品管(5)有4管，分別放 置CoxBl標(biāo)準(zhǔn)品、CoxB2標(biāo)準(zhǔn)品、CoxB3標(biāo)準(zhǔn)品、腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)品，陽性對照品管(6)有4管， 分別放置CoxBl陽性對照品、CoxB2陽性對照品、CoxB3陽性對照品、腸道病毒陽性對照品； 其中定量RT-PCR反應(yīng)液含有PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合 物，酶混合液含耐熱iTaq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，引物探針混合液含四 種病毒的特異性引物和相應(yīng)的四種不同熒光標(biāo)記的探針，引物探針混合液管需為棕色管， 陰性對照為高溫高壓滅菌的焦碳酸ニ乙酯處理水，陽性對照為CoxBl、CoxB2、CoxB3及腸道 病毒的陽性質(zhì)粒樣品；檢測用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性探針序列為上游引物 CoxBl-F :5，-CACTCACGGTCCGAATCRTCCA-3，下游引物 CoxBl-R :5’ -TTTYTGAGTTRTTRGTGTATGTGGCAT-3，特異性探針 CoxBl-P :5’ -FAM-TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT-BHQ1-3，上游引物 CoxB2-F :5’ -GATCAGCATGTGTGTTTTACACGA-3’下游引物 CoxB2-R :5，-GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA-3，特異性探針 CoxB2-P :5，-CY5-TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCAA-BHQ2-3，上游引物 CoxB3-F :5，-CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRTA-3，下游引物 CoxB3-R 5-AGGAARGGTATRGACATGCGTG-3 ‘特異性探針 CoxB3-P :5’ -HEX-CCAAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC-BHQ1-3’上游引物腸道病毒-F :5，-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3，下游引物腸道病毒 :5，-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’特異性探針腸道病毒-P :5’ -R0X-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3，CoxBl標(biāo)準(zhǔn)品序列為ACGTGAAAAA CTACCACTCA CGGTCCGAAT CGTCCATTGA AAATTTCCTG TGCCGGTCTG CCTGTGTATA CTATGCCACA TACACCAATA ACTCAGAAAA GGGGTTTGCA GAGTGGGTTA CoxB2標(biāo)準(zhǔn)品序列為ATTTCCTTGC ACGATCAGCA TGTGTGTTTT ACACGACATA CACCAACAGC AAAAATGCAG CCAAAGAAAA GAAGTTTGCG ACATGGAAGG TGAGTGTTAG ACAGGCTGCA CAACTGA CoxB3標(biāo)準(zhǔn)品序列為ACCAGGGGGT CCAGTAGCAG ATAAAGTGGA TTCATATGTA TGGCAAACTT CCACGAACCC AAGTGTGTTC TGGACAGAGG GTAATGCACC ACCACGCATG TCCATACCTT TCCTGAGCAT TGG 腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為AGTCCTCCGG CCCCTGAATG CGGCTAATCC CAACTGCGGA GCACACGCCCACAAGCCAGC GGGTAGTGTG TCGTAACGGG TAACTCTGCA GCGGAACCGA CTACTTTGGG TGTCCGTGTT TCCTTTTATC TTTATATTGG CTGCTTATGG TGACAATTAA AGAATT。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種腸道病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒保存于-20°C，引物探針混合液需避光條件保存。
3.權(quán)利要求I所述的一種腸道病毒檢測試劑盒在檢測CoxBl、CoxB2、CoxB3以及其他腸道病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腸道病毒檢測試劑盒，包含定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物探針混合液、標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品。本發(fā)明根據(jù)CoxB1、CoxB2、CoxB3和腸道病毒的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，采用一步法四重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，可快速、準(zhǔn)確的從標(biāo)本中同時(shí)檢測出CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他腸道病毒，并實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量，尤其對屬于腸道病毒屬的CoxB1、CoxB2、CoxB3進(jìn)行雙重驗(yàn)證，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。
文檔編號C12Q1/68GK102534051SQ20121004794
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者崔大偉, 李蘭娟, 謝國良, 陳瑜 申請人:浙江大學(xué)