專利名稱：一種增加讀長的測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種增加讀長的測序方法。
背景技術(shù)：
新一代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)主要包括焦磷酸測序法 (sequencing by pyrosequencing),合成法測序(sequencing by synthesis, SBS)禾口連接法測序(sequencing by ligation, SBL)。其中，連接法測序具有準(zhǔn)確率高，成本低的優(yōu)點(diǎn)，適用于轉(zhuǎn)錄本及比較基因組學(xué)研究，特別是單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)的檢測。現(xiàn)有的一種連接測序法是基于在特定位置帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的， 該寡核苷酸探針帶有η個(gè)堿基，分為h(h ^ η)組，同一組寡核苷酸探針的不同熒光標(biāo)記對應(yīng)同一特定位置的不同堿基序列，不同組之間的區(qū)別在于不同熒光標(biāo)記對應(yīng)的特定位置不同，因?yàn)樵摴押塑账崽结樀?’端進(jìn)行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接。每次連接反應(yīng)，用于錨定的引物anchor通過互補(bǔ)配對結(jié)合于待測核酸片段的接頭序列上，然后在T4連接酶的作用下，每個(gè)anchor后連接一個(gè)寡核苷酸探針，測得相應(yīng)位置的堿基序列；一次連接之后將之前的anchor及寡核苷酸探針洗脫，重連anchor及更換另一組寡核苷酸探針進(jìn)行連接，檢測該組寡核苷酸探針對應(yīng)位置的堿基；重復(fù)連接-檢測-洗脫-連
接的步驟，即可測得待測核酸片段接頭序列的3’末端后第1、2.......h位的堿基序列信
肩、ο此外，在上述連接測序法中，若將寡核苷酸探針的3’端活化并在其后繼續(xù)連接片段時(shí)經(jīng)常無法得到連接產(chǎn)物或得到的連接產(chǎn)物很少。通過實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)這是由于連接酶的保真度會隨著與連接點(diǎn)的距離增大而降低導(dǎo)致，因此在上述連接測序法中讀長h是受限的。不同的連接酶的保真度是不同的。以T4連接酶為例，經(jīng)過驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)T4連接酶最大限度能保證6個(gè)堿基正確互補(bǔ)配對，也即高質(zhì)量的讀長h < 6，讀長過短。從第7位堿基開始，T4連接酶無法保證寡核苷酸探針與待測核酸片段之間堿基的正確匹配，因此寡核苷酸探針連接到anchor上時(shí)，第6位之后的堿基會產(chǎn)生錯(cuò)配。若經(jīng)過處理，直接將寡核苷酸探針的熒光信號淬滅且活化其3’端，而在其后繼續(xù)連接新的寡核苷酸探針，用以讀取新的核苷酸序列信息，則只有堿基正確配對的寡核苷酸探針后面才能連接，而有錯(cuò)配存在的寡核苷酸探針后面無法連接。相比第一次連接上的寡核苷酸探針，此時(shí)連接上的新的寡核苷酸探針數(shù)量急劇下降，檢測得到的熒光信號極其微弱，導(dǎo)致核苷酸的讀取準(zhǔn)確率降低。因此，迫切需要一種新的連接測序法，能夠增加讀長，同時(shí)還能保證增加的核苷酸序列信息的讀取準(zhǔn)確率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種增加讀長的測序方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中連接測序法讀長過短的問題，并能進(jìn)一步避免增加讀長時(shí)出現(xiàn)核苷酸序列信息讀取準(zhǔn)確率低的問題。為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，所述增加讀長的測序方法包括以下步驟A.將第一 anchor結(jié)合于待測核酸片段的接頭上，該第一 anchor帶有酶切識別位
點(diǎn)；B.在第一 anchor延伸末端連接熒光探針，檢測其熒光信號，更換熒光探針并重復(fù)連接和檢測操作，得到延伸末端后M個(gè)核苷酸序列信息；C.利用酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得到在第一 anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物；D.將酶切產(chǎn)物與熒光探針連接，檢測其熒光信號，更換熒光探針并重復(fù)連接和檢測操作，得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息。其中，所述第一 anchor上帶有至少一個(gè)dU堿基。其中，所述第一 anchor的一端是封閉的。其中，所述步驟C包括以下步驟Cl.將熒光探針與第一 anchor洗脫，錨定第二 anchor并在其延伸末端連接自由探針，得到自由探針復(fù)合物；C2.利用自由探針復(fù)合物所帶酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶酶切，得到在第一 anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物。步驟C也可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)直接利用切刻內(nèi)切酶識別第一 anchor所帶的酶切識別位點(diǎn)，并在第一 anchor延伸末端方向進(jìn)行酶切，將熒光探針中帶有熒光標(biāo)記的片段部分切掉，保留N個(gè)核苷酸，從而得到在第一 anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物。一 anchor 禾口 二 anchor t匿同同，當(dāng)H一 anchor 禾口 二 anchor 不同時(shí)，第二 anchor在延伸末端較第一 anchor少L個(gè)核苷酸。其中，步驟Cl中所述第一 anchor上帶有至少一個(gè)dU堿基。進(jìn)一步的，步驟Cl中所述熒光探針與第一 anchor的洗脫采用UDG酶識別并切除 dU堿基形成短片段，然后利用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。其中，所述第二 anchor上帶有至少一個(gè)dU堿基。其中，上述切刻內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)位于酶切識別位點(diǎn)所在anchor的延伸末端方向，酶切位點(diǎn)與酶切識別位點(diǎn)之間的核苷酸個(gè)數(shù)隨切刻內(nèi)切酶的不同而不同。其中，所述步驟D可以通過現(xiàn)有技術(shù)中重復(fù)類似雜交-連接-采集熒光信號-洗脫-雜交的步驟實(shí)現(xiàn)，也可以通過以下步驟實(shí)現(xiàn)Dl.將酶切產(chǎn)物與熒光探針連接，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息；D2.將熒光探針去除，連接標(biāo)記位置不同的熒光探針，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息；D3.重復(fù)步驟D2的操作，直至得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息。進(jìn)一步，步驟D2包括以下步驟D21.利用酶切產(chǎn)物所帶酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶切掉熒光探針與酶切產(chǎn)物之間的連接，并將熒光探針洗脫；
D22.將標(biāo)記位置不同的熒光探針與酶切產(chǎn)物連接，檢測該熒光探針的熒光信號， 得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息。進(jìn)一步的，步驟D2包括以下步驟D21’ .將酶切產(chǎn)物中的anchor與保留的核苷酸以及連接的熒光探針通過解離進(jìn)行洗脫；D22’.利用雜交anchor-連接探針-切刻內(nèi)切酶酶切的步驟，重新制備酶切產(chǎn)物；D23’.將標(biāo)記位置不同的熒光探針與酶切產(chǎn)物連接，檢測該熒光探針的熒光信號， 得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息。由上述可知，本發(fā)明所述增加讀長的測序方法，首先使用連接測序法讀取anchor 延伸末端后的M個(gè)核苷酸序列信息，然后利用切刻內(nèi)切酶識別anchor所帶的酶切識別位點(diǎn)并進(jìn)行酶切，在anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸，將之前已經(jīng)讀取過的相應(yīng)數(shù)量的核苷酸位置封閉，然后在保留的核苷酸之后再連接檢測用的熒光探針，讀取第M+1位及之后的核苷酸序列信息，從而實(shí)現(xiàn)增加讀長的目的。同時(shí)，利用切刻內(nèi)切酶控制酶切之后所保留的核苷酸個(gè)數(shù)，能夠保證連接酶的高保真度，進(jìn)而保證后續(xù)核苷酸序列信息的讀取準(zhǔn)確率。


圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中增加讀長的測序方法的方法流程圖；圖2是本發(fā)明所用anchor的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中得到在anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物的方法流程圖；圖4是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中第二 anchor與第一 anchor不同時(shí)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中通過更換熒光探針并檢測相應(yīng)熒光信號，得到第M+1 至N+K位核苷酸序列信息的方法流程圖；圖6是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中通過更換熒光探針獲得相應(yīng)位置的核苷酸序列信息的方法流程圖；圖7是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中通過更換熒光探針獲得相應(yīng)位置的核苷酸序列信息的方法流程圖；圖8是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中通過更換熒光探針并檢測相應(yīng)熒光信號，得到第 M+1至N+K位核苷酸序列信息的方法示意圖；圖9是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中增加讀長的測序方法示意圖；圖10是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中驗(yàn)證連接酶在前一片段出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí)無法繼續(xù)連接的電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明提供了一種增加讀長的測序方法，包括以下步驟首先按照常規(guī)連接測序法的步驟，利用錨定引物anchor以及檢測所用的不同種類熒光探針，重復(fù)雜交錨定 anchor、連接熒光探針、采集熒光信號、洗脫anchor及熒光探針的步驟，根據(jù)所連接的熒光探針種類的不同，讀取待測核酸片段中anchor延伸末端后M位的核苷酸序列信息。其中， 所述anchor上帶有切刻內(nèi)切酶識別位點(diǎn)；所述anchor延伸末端，是指在anchor上能夠繼續(xù)連接并進(jìn)行核苷酸鏈延伸的末端，可以是anchor的5’端，也可以是anchor的3’端；與此相對應(yīng)的是非延伸末端，是指在anchor上不能繼續(xù)連接并進(jìn)行核苷酸鏈延伸的末端，可通過對anchor的3’或5’末端進(jìn)行封閉處理來實(shí)現(xiàn)。然后利用anchor延伸末端的酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶進(jìn)行酶切形成切刻，將切刻之后出現(xiàn)的未與anchor連接的短片段部分洗脫，在anchor延伸末端保留數(shù)個(gè)核苷酸，然后在保留的核苷酸后面再連接熒光探針， 通過更換熒光探針的種類，讀取后續(xù)的核苷酸序列信息，從而實(shí)現(xiàn)增加連接測序法中讀長的目的。同時(shí)，通過切刻內(nèi)切酶，控制在anchor延伸末端后保留的核苷酸個(gè)數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)不同個(gè)數(shù)的核苷酸讀長增加，而且可以保證連接酶的高保真性，避免增加讀長時(shí)核苷酸序列信息讀取準(zhǔn)確率降低的問題。圖1示出了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中增加讀長的測序方法流程，該方法包括Si.將第一 anchor結(jié)合于待測核酸片段的接頭上，該第一 anchor帶有酶切識別位占.
^ \\\ S2.在第一 anchor延伸末端連接熒光探針，檢測其熒光信號，更換熒光探針并重復(fù)連接和檢測操作，得到延伸末端后M個(gè)核苷酸序列信息；S3.利用酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得到在第一 anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物；S4.將酶切產(chǎn)物與熒光探針連接，檢測其熒光信號，更換熒光探針并重復(fù)連接和檢測操作，得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息。本技術(shù)方案的優(yōu)勢在于，能夠在利用普通連接測序法讀取M個(gè)核苷酸序列信息的基礎(chǔ)上，通過切刻內(nèi)切酶的酶切保留第一 anchor延伸末端后正確配對的N個(gè)核苷酸，然后在連接酶的作用下，在所保留的N個(gè)核苷酸之后再連接熒光探針，繼續(xù)向下讀取核苷酸序列，從而實(shí)現(xiàn)讀長增加的目的；而通過切刻內(nèi)切酶控制住保留的核苷酸個(gè)數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)不同個(gè)數(shù)的核苷酸讀長增加，而且可以保證連接酶的高保真性，避免增加讀長時(shí)核苷酸序列信息讀取準(zhǔn)確率降低的問題。需要說明的是本發(fā)明中所述第一 anchor為錨定引物，用于與待測核酸片段的接頭進(jìn)行錨定結(jié)
I=I O其中，步驟Sl中所述的待測核酸片段，其上至少帶有一個(gè)接頭，包括但不限于兩端中至少有一端帶有接頭、或兩端都帶有接頭、或除兩端之外的其余位置帶有接頭。當(dāng)待測核酸片段只有兩端位置帶有接頭時(shí)，后續(xù)的anchor可不做封閉處理；若待測核酸片段除兩端之外的其余位置帶有接頭，為了控制后續(xù)連接的方向，優(yōu)選將anchor的一端將進(jìn)行封閉處理，以避免連接的無序。步驟Sl中，第一 anchor通過堿基互補(bǔ)配對與待測核酸片段的接頭結(jié)合，其基本結(jié)構(gòu)如圖2所示，第一 anchor上帶有酶切識別位點(diǎn)1。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所用到的第一 anchor的序列為SEQ NO :1。在實(shí)際應(yīng)用過程中，為實(shí)現(xiàn)不同的目的，還可以在基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加入更多的特殊設(shè)計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施例中，除了第一 anchor的延伸末端帶有酶切識別位點(diǎn)外，在第一 anchor的其余核苷酸序列中，引入了 dU堿基，其序列為SEQ N0:2，該第一 anchor可以在后續(xù)的洗脫過程中直接切除dU堿基形成不同的短片段，便于洗脫的實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施例中，將第一 anchor的一端進(jìn)行封閉，可以是第一 anchor的3’端，也可以是5’端，經(jīng)過封閉處理既可以控制連接的方向，又可以避免第一 anchor之間相互連接。在本實(shí)施例的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，將第一 anchor的3’端進(jìn)行封閉，采用的方法包括但不限于雙脫氧、氨基化反應(yīng)、酰胺化，其無法繼續(xù)連接，控制第一 anchor的連接只發(fā)生在5’端；而在本實(shí)施例的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，將第一 anchor的 5’端進(jìn)行封閉，通過5’端進(jìn)行去磷酸化或酰胺化處理將其封閉，從而只保留3’端作為連接的末端。此外，由于堿基的互補(bǔ)配對關(guān)系，因此在構(gòu)建待測核酸片段或以待測核酸片段形成測序文庫時(shí)，所用的接頭中與第一 anchor酶切識別位點(diǎn)對應(yīng)的核苷酸也是特定的。步驟S2中，經(jīng)過一輪測序操作后，可以得到第一 anchor延伸末端后的M個(gè)核苷酸的序列信息。其中，M為正整數(shù)。根據(jù)在連接測序過程中所使用的連接酶及連接酶的保真度，M的數(shù)值范圍優(yōu)選為1 9。 步驟S2中，所述第一 anchor延伸末端是指第一 anchor能夠用于連接并進(jìn)行核苷酸鏈延伸的末端，與此相對應(yīng)的是非延伸末端，也即經(jīng)過一定封閉處理后無法再進(jìn)行連接的末端。本發(fā)明中所用的熒光探針分為不同組別類型，同組類型中不同熒光標(biāo)記對應(yīng)同一特定位置的不同核苷酸序列，而不同組類型的熒光探針熒光標(biāo)記對應(yīng)的特定位置不同。每次連接反應(yīng)中，加入同一組類型的熒光探針，根據(jù)所采集的熒光信號，可以讀取該組熒光探針標(biāo)記特定位置對應(yīng)的核苷酸序列信息；而通過雜交-連接-采集熒光信號-洗脫這些操作的重復(fù)，可以準(zhǔn)確的讀取第一 anchor延伸末端后M個(gè)核苷酸序列信息。步驟S3中所述N為正整數(shù)，其數(shù)值范圍優(yōu)選為1 9，而且為了保證測序的連續(xù)性與準(zhǔn)確性，在數(shù)值上應(yīng)保證N < M。步驟S3中所述切刻內(nèi)切酶，能夠識別雙鏈中的一條單鏈所帶的酶切識別位點(diǎn)，并對該單鏈進(jìn)行酶切，其酶切位點(diǎn)位于酶切識別位點(diǎn)所在第一 anchor延伸末端的下游方向， 酶切位點(diǎn)與酶切識別位點(diǎn)之間的核苷酸個(gè)數(shù)隨所用的切刻內(nèi)切酶不同而不同。為了保證連接酶的連接保真度，避免出現(xiàn)錯(cuò)配，切刻內(nèi)切酶進(jìn)行酶切之后，在第一 anchor延伸末端保留的核苷酸個(gè)數(shù)N的范圍為1 9，為盡可能增加讀長，N的數(shù)值優(yōu)選為 3 9，更優(yōu)選為5 9。上述切刻內(nèi)切酶，包括但不限于Nt. Alw I內(nèi)切酶、Nt.BsmA I內(nèi)切酶、Nt. BspQ I內(nèi)切酶、Nt. BstNB I內(nèi)切酶。步驟S3可以有多種實(shí)現(xiàn)方式，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，直接利用能夠識別第一 anchor上所帶的酶切識別位點(diǎn)的切刻內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，使得連接在第一 anchor延伸末端后的熒光探針形成切刻，從而使帶有熒光標(biāo)記的部分形成短片段，然后以洗脫液將短片段洗脫，得到在第一 anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物。該實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)在于可以簡化操作，節(jié)省時(shí)間。而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，如圖3所示，步驟S3可通過以下步驟實(shí)現(xiàn)S31.將熒光探針與第一 anehor洗脫，錨定第二 anehor并在其延伸末端連接自由探針，得到自由探針復(fù)合物；
S32.利用自由探針復(fù)合物所帶酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶酶切，得到在第一 anchor延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物。該實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)在于，將原有的第一 anchor與熒光探針洗脫之后，錨定第二 anchor,在其延伸末端后連接簡便易得且成本低的自由探針，通過提高自由探針的濃度而使待測核酸片段都能與之連接，彌補(bǔ)了之前熒光探針因?yàn)槌杀靖?、濃度低以及空間位阻效應(yīng)不能保證與所有待測核酸片段連接的缺陷，從而可以保證后續(xù)進(jìn)行步驟S4的操作時(shí)，讀取到的熒光信號足夠多，能夠準(zhǔn)確的判斷所讀取的核苷酸序列。對于本實(shí)施方案需要說明的是本方案中，第一 anchor與第二 anchor皆為錨定引物，用于與待測核酸片段的接頭進(jìn)行錨定結(jié)合。步驟S31中所述第一 anchor與第二 anchor可以是相同的，此時(shí)相當(dāng)于將第一 anchor洗脫之后重置，其優(yōu)點(diǎn)在于使用同一種anchor，可以簡化反應(yīng)試劑。第二 anchor也可以與第一 anchor不相同。在本步驟的一個(gè)具體實(shí)施例中，第二 anchor與第一 anchor的酶切識別位點(diǎn)不同。在本步驟的另一個(gè)具體實(shí)施例中，第二 anchor帶有數(shù)個(gè)dU堿基，而第一 anchor 并無dU堿基。在本步驟的另一個(gè)具體實(shí)施例中，第二 anchor與第一 anchor相比，在延伸末端少了 L個(gè)核苷酸序列，其中L為正整數(shù)，其數(shù)值范圍優(yōu)選為1 8 ；如圖4所示，在此實(shí)施例中，第二 anchor本身并無酶切識別位點(diǎn)，通過與后續(xù)連接上的自由探針組合形成酶切識別位點(diǎn)。步驟S31中熒光探針與第一 anchor的洗脫，可利用現(xiàn)有技術(shù)中多種方式實(shí)現(xiàn)。在本步驟的一個(gè)具體實(shí)施例中，待測核酸片段是與微珠固定結(jié)合的，采集熒光信號結(jié)束之后，直接利用NaOH對測序反應(yīng)體系進(jìn)行處理，使得連接在待測核酸片段上的第一 anchor與熒光探針解離，然后以洗脫緩沖液直接將解離的第一 anchor與熒光探針清洗掉。在本步驟的另一個(gè)具體實(shí)施例中，第一 anchor在設(shè)計(jì)合成時(shí)加入dU堿基，因此直接利用特異性識別酶切dU堿基的尿嘧啶-DNA糖基化酶⑴racil-DNA Glycocasylase,UDG 酶)對第一 anchor進(jìn)行酶切，形成短片段，升溫即可將這些由第一 anchor和熒光探針形成的短片段洗脫。在本步驟的另一個(gè)具體實(shí)施例中，在第一 anchor設(shè)計(jì)合成時(shí)，利用幾個(gè)硫代磷酸鍵(P-幻代替原有的P-O鍵，因此可以直接利用帶有Ag、Hg、CU、Mn、ai或Cd離子的化合物切刻P-S鍵將第一 anchor和熒光探針洗脫。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步說明的是，上述實(shí)施例只是步驟S31中用于洗脫第一 anchor和熒光探針的一些具體實(shí)施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，步驟S31中所述自由探針為單鏈寡核苷酸，其核苷酸個(gè)數(shù)優(yōu)選為5 15，更優(yōu)選為5 10，其核苷酸組成數(shù)目自由可變，合成時(shí)采用隨機(jī)合成方式即可，簡便易得，成本低。步驟S4中，N、K均為正整數(shù)。根據(jù)所選用的連接酶，K的取值范圍優(yōu)選為1 9。得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息通過如圖5所示的方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟
S41.將酶切產(chǎn)物與熒光探針連接，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息；S42.將熒光探針去除，連接標(biāo)記位置不同的熒光探針，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息；S43.重復(fù)步驟S42的操作，直至得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息。上述技術(shù)方案利用標(biāo)記位置不同的熒光探針之間的更換連接，實(shí)現(xiàn)對M+1至N+K 位核苷酸序列信息的讀取。其中，步驟S42可以有多種實(shí)現(xiàn)方式。在本步驟的一個(gè)具體實(shí)施例中，步驟S42通過如圖6所示的方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟S421.利用酶切產(chǎn)物所帶酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶切掉熒光探針與酶切產(chǎn)物之間的連接，并將熒光探針洗脫；S422.將標(biāo)記位置不同的熒光探針與酶切產(chǎn)物連接，檢測該熒光探針的熒光信號， 得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息。該方案的優(yōu)勢在于，利用酶切產(chǎn)物本身所帶的酶切識別位點(diǎn)，利用切刻內(nèi)切酶直接將連接在保留核苷酸之后的熒光探針切除，然后換用檢測其他位置核苷酸的熒光探針進(jìn)行連接，而不需要將酶切產(chǎn)物上的anchor以及保留的核苷酸洗脫之后再次重連，既簡化了操作，又節(jié)省了試劑，降低了成本。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，步驟S42通過如圖7所示的方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟S421’.將酶切產(chǎn)物中的anchor與保留的核苷酸以及連接的熒光探針通過解離進(jìn)行洗脫；S422’ .利用雜交anchor-連接探針-切刻內(nèi)切酶酶切的步驟，重新制備酶切產(chǎn)物；S423’ .將標(biāo)記位置不同的熒光探針與酶切產(chǎn)物連接，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息。其中，步驟S422’中所述的雜交anchor-連接探針-切刻內(nèi)切酶酶切，是指在步驟 S421’的基礎(chǔ)上，重新在待測核酸片段上雜交帶有酶切識別位點(diǎn)的anchor，然后在anchor 延伸末端連接自由探針，并以切刻內(nèi)切酶識別和酶切，得到在anchor延伸末端保留有N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物的操作。其中，此處所述anchor，泛指能夠滿足本發(fā)明要求的錨定引物， 可以是前面所述的第一 anchor，也可以是前面所述的第二 anchor，其上帶有酶切識別位點(diǎn)ο該實(shí)施方案通過將anchor、保留的核苷酸及熒光探針洗脫，之后重復(fù)雜交 anchor-連接自由探針-切刻內(nèi)切酶酶切_連接熒光探針_采集熒光信號_洗脫_雜交的操作，即可得到第M+1位直至第N+K位的核苷酸序列信息。圖8為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中利用T4連接酶得到第M+1至N+K位核苷酸序列信息的方法示意圖，該圖直觀的展現(xiàn)了得到第M+1至N+K位核苷酸序列信息的過程步驟51.讀取第6位核苷酸序列信息在之前的步驟中，首先利用常用的連接測序法，在T4連接酶的作用下，更換連接的熒光探針，讀取1 5位的核苷酸序列信息，即M = 5 ； 然后利用Nt. BstNB I酶對連接在微珠上并固定于固相載體表面的自由探針復(fù)合物進(jìn)行酶切，所述Nt. BstNB I酶的酶切位點(diǎn)在其識別位點(diǎn)后四位核苷酸之后進(jìn)行酶切，得到anchor 延伸末端保留4位核苷酸的酶切產(chǎn)物，即此時(shí)N = 4 ；在該4位核苷酸后連接用于檢測的一組共4種6號位熒光探針，在熒光顯微鏡下采集熒光信號，根據(jù)熒光信號的種類判斷讀取第 6位的核苷酸序列信息；步驟52.讀取第7位核苷酸序列信息利用Nt. BstNB I再次進(jìn)行酶切，將6號位熒光探針與保留的核苷酸之間的連接切除，利用洗脫緩沖液將其洗掉，然后在T4連接酶的作用下，連接用于檢測的一組共四種7號位熒光探針，并通過熒光顯微鏡采集熒光信號，讀取第7位核苷酸序列信息；步驟53.讀取后續(xù)核苷酸序列信息重復(fù)步驟52的操作，在T4連接酶的作用下， 換用標(biāo)記位置不同的熒光探針讀取相應(yīng)位置核苷酸序列信息，直至得到第9位核苷酸序列 fn息ο上述實(shí)施方案中，在T4連接酶的作用下，利用酶切位點(diǎn)在酶切識別位點(diǎn)之后四位進(jìn)行酶切的切刻內(nèi)切酶Nt. BstNB I對自由探針進(jìn)行酶切，實(shí)現(xiàn)在原有讀長的基礎(chǔ)上增加4 位的目的。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步說明的是，上述實(shí)施例僅是實(shí)現(xiàn)步驟S4中讀取第M+1至N+K位核苷酸序列信息的一些具體實(shí)施方案，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。例如改變M、N的數(shù)值，同樣可以實(shí)現(xiàn)讀長的增加。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，在T4連接酶的作用下，利用常用的連接測序法讀取anchor延伸末端之后共4位(即M = 4)核苷酸序列信息，然后換用 Nt. BsmA I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切可以得到在anchor后保留1位(即N = 1)核苷酸的酶切產(chǎn)物， 利用圖8所示方法可以在原讀長為4位核苷酸的基礎(chǔ)上，增加1位讀長。圖9為本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施例中增加讀長的測序方法示意圖，該圖直觀的展現(xiàn)了在測序中實(shí)現(xiàn)讀長增加的過程步驟1.讀取第1至5位核苷酸序列信息將第一 anchor通過堿基互補(bǔ)配對雜交結(jié)合于待測核酸片段的接頭上，其中待測核酸片段的一端通過連接固定于磁珠表面，第一 anchor的延伸末端帶有切刻內(nèi)切酶Nt. Alw I的酶切識別位點(diǎn)，且第一 anchor的核苷酸序列中帶有dU堿基；在T4連接酶作用下，在第一 anchor的延伸末端連接用于檢測的熒光探針，通過重連第一 anchor以及標(biāo)記位置從1至5號位的不同組別熒光探針的更換連接，采集相應(yīng)探針的熒光信號圖，讀取第1至5位的核苷酸序列信息；步驟2.洗脫當(dāng)?shù)?號位核苷酸序列信息被讀取之后，利用UDG酶特異性識別并酶切第一 anchor中所攜帶的dU堿基，將第一 anchor與熒光探針連接的核苷酸鏈切割成小片段，通過洗脫緩沖液以及溫度的控制，將第一 anchor和熒光探針清洗掉；步驟3.連接自由探針在待測核酸片段通過堿基互補(bǔ)配對重新連接第一 anchor， 然后在連接酶的作用下，在第一 anchor延伸末端連接一個(gè)九聚寡核苷酸自由探針，得到待測核酸片段、第一 anchor與自由探針三者組成的自由探針復(fù)合物；步驟4.切刻內(nèi)切酶酶切利用Nt. Alw I酶識別第一 anchor所攜帶的酶切識別位點(diǎn)并進(jìn)行酶切，然后對切出來的小片段寡核苷酸鏈進(jìn)行洗脫，得到在第一 anchor延伸末端保留4位核苷酸的酶切產(chǎn)物；步驟5.讀取第5位后的核苷酸序列信息在T4連接酶的作用下，在步驟4中得到的酶切產(chǎn)物上保留的4位核苷酸之后連接特定位置標(biāo)記的熒光探針，采用如圖8所示的方法，利用第一 anchor上攜帶的酶切識別位點(diǎn)，通過酶切的方式更換標(biāo)記位置不同的熒光探針進(jìn)行連接檢測，采集相應(yīng)位置的熒光信號，然后讀取5號位后的第6至9位的核苷酸序列 fn息ο通過上述對本發(fā)明所記載技術(shù)方案的進(jìn)一步闡述和舉例說明，可以知道，利用本發(fā)明所記載的技術(shù)方案進(jìn)行連接測序時(shí)，其讀長由所選用的連接酶的保真度與切刻內(nèi)切酶的酶切能力決定，其讀長最長可達(dá)到連接酶的保真度所能保證正確連接的核苷酸個(gè)數(shù)，再加上切刻內(nèi)切酶酶切之后能保留的核苷酸個(gè)數(shù)之和，即前述M與N的取值范圍之和。根據(jù)之前所述M與N的優(yōu)選取值范圍，本發(fā)明所記載的技術(shù)方案在待測核酸片段的一端能達(dá)到的讀長范圍優(yōu)選為1 18，也即在待測核酸片段單端的讀長可達(dá)到18個(gè)核苷酸的長度，因此通過兩端分別進(jìn)行測序的讀長可以達(dá)到36個(gè)核苷酸的長度。本發(fā)明在實(shí)現(xiàn)讀長增加的基礎(chǔ)上，通過控制切刻內(nèi)切酶酶切保留的核苷酸個(gè)數(shù)， 能夠在增加讀長同時(shí)保證連接酶的保真度，避免出現(xiàn)因?yàn)榍懊婧塑账岬腻e(cuò)配而影響后續(xù)熒光探針的連接，進(jìn)而影響讀長增加時(shí)的核苷酸序列信息讀取準(zhǔn)確率。為了驗(yàn)證所述優(yōu)勢，本發(fā)明給出了一個(gè)具體實(shí)施例，用以證明當(dāng)連接核苷酸個(gè)數(shù)超過連接酶的保真度范圍時(shí)，容易出現(xiàn)因?yàn)榍懊婧塑账岬腻e(cuò)配影響后續(xù)熒光探針連接的數(shù)量，進(jìn)而影響核苷酸序列信息讀取準(zhǔn)確率。該實(shí)施例以T4連接酶為例，所包括的步驟及具體操作如下所示步驟一、錨定anchor雜交結(jié)合于待測模板序列片段的接頭上設(shè)計(jì)序列已知的待測模板(SEQ ID NO :3)，利用接頭(SEQ ID NO 4)將待測模板制備成測序片段文庫，其中測序片段連接于磁珠上，磁珠被固定于玻片表面；然后通過堿基互補(bǔ)配對將錨定anchor (SEQ ID NO 5)雜交結(jié)合到測序片段的接頭上，雜交的反應(yīng)過程及體系為28°C,400y L 2XSSPE(saline sodium phosphate EDTA)緩沖液對固定于玻片表面的測序片段進(jìn)行潤洗；加入anchor (15 μ Μ)，2 X SSPE 環(huán)境下升溫至 65°C，維持 30s ；降溫至42 °C，Imin 雜交；30°C，900y L 清洗緩沖液[50mM KCl，IOmM Tris-HCl (pH7. 4),0. ImM EDTA,0. 01% Triton X-100]進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的錨定anchor分離清除。步驟二、連接自由探針設(shè)計(jì)4種由7個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸片段作為非熒光標(biāo)記自由探針，分別是 Pl (SEQ ID N0:6)、P2(SEQ ID N0:7)、P3(SEQ ID NO :8)禾口 P4(SEQ ID NO :9)，其中 Pl 的核苷酸能完全與測序片段互補(bǔ)，而其余三種則是最后一位核苷酸與測序片段不能互補(bǔ)；在T4 連接酶的作用下，將自由探針連接到測序片段上錨定anchor的延伸末端，形成自由探針復(fù)合物，設(shè)置五個(gè)連接體系，其中連接體系中相對應(yīng)的試劑是等量的，分別是連接體系1 :P1與測序片段連接，得到自由探針復(fù)合物1 ；連接體系2 :P2與測序片段連接，得到自由探針復(fù)合物2 ；連接體系3 :P3與測序片段連接，得到自由探針復(fù)合物3 ；連接體系4 :P4與測序片段連接，得到自由探針復(fù)合物4 ；連接體系5 :P1、P2、P3和P4等量混合后與測序片段連接，得到自由探針復(fù)合物5 ；
上述連接體系進(jìn)行連接反應(yīng)的體系為30°C，連接緩沖液[50mM Tris-HCl (pH7. 5), IOmM MgCl2, IOmM dithiothreitol, ImM ATP]對雜交分離的產(chǎn)物進(jìn)行潤洗；加入T4連接酶，自由探針(3口11)，連接緩沖液中，301，201^11反應(yīng);連接反應(yīng)結(jié)束之后，30°C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的自由探針與連接產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到自由探針復(fù)合物。步驟三、連接熒光探針設(shè)計(jì)帶熒光標(biāo)記的九聚核苷酸作為熒光探針，其連接端第一位核苷酸是特定的C， 與測序片段中錨定anchor延伸末端后第6位的核苷酸正好互補(bǔ)。在T4連接酶的作用下， 熒光探針分別與上一步驟中的自由探針復(fù)合物進(jìn)行連接，得到相應(yīng)的連接產(chǎn)物1、連接產(chǎn)物 2、連接產(chǎn)物3、連接產(chǎn)物4和連接產(chǎn)物5，連接反應(yīng)的體系為加入T4連接酶，熒光探針(311|1)，連接緩沖液中，301，201^11反應(yīng)；連接反應(yīng)結(jié)束之后，30°C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的熒光探針與連接產(chǎn)物進(jìn)行分離。步驟四、變性解離利用NaOH直接對上述連接產(chǎn)物分別進(jìn)行變性解離，采用同樣量洗脫液進(jìn)行洗脫， 收集上清液得到五種上清單鏈DNA液，變性反應(yīng)體系為連接產(chǎn)物中加入NaOH(0. 05Μ)，變性^iiin ；30°C，少量洗脫緩沖液[50mM KCl, IOmM Tris-HCl (pH7. 4),0. ImM EDTA]進(jìn)行清洗，收集上清液，得到上清單鏈DNA液。步驟五、瓊脂糖凝膠電泳檢測上清單鏈DNA液以核苷酸數(shù)目為25的寡核苷酸片段作為參照物，20%瓊脂糖凝膠對收集得到上清單鏈DNA液進(jìn)行檢測，點(diǎn)樣時(shí)，不同泳道之間點(diǎn)樣的量保持一致，電泳結(jié)束之后得到如圖 9所示的電泳結(jié)果圖。圖中泳道1為連接產(chǎn)物1中得到的上清液樣品，泳道2為連接產(chǎn)物2 中得到的上清液樣品，后續(xù)泳道以此類推，最右邊泳道為參照物電泳結(jié)果。從圖9的結(jié)果可以看出只有泳道1的電泳結(jié)果恰好是錨定anchor (Ilnt)+自由探針(7nt) +熒光探針(9nt)的長度值；泳道2、3、4的電泳結(jié)果長度值只有18nt，說明泳道 2、3、4的樣品只是錨定anchor與自由探針連接得到的自由探針復(fù)合物，后續(xù)熒光探針沒有連接成功；而泳道5中，只有少量27nt的電泳條帶，從條帶推斷其產(chǎn)物量約為泳道1中條帶的1/4，正好與四種自由探針混合中Pl自由探針的量相當(dāng)。除此之外，本發(fā)明還分別設(shè)計(jì)了 6號位核苷酸與測序片段相應(yīng)位置互補(bǔ)但7號位不互補(bǔ)的自由探針實(shí)施例進(jìn)行驗(yàn)證，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證明，當(dāng)錨定anchor后連接的自由探針沒有完全與測序片段之間互補(bǔ)時(shí)，后續(xù)的熒光探針無法連接上去。綜合上述實(shí)施例的結(jié)果，若所連接的自由探針核苷酸數(shù)量超過T4連接酶的保真度限值6時(shí)，完全可以預(yù)見自由探針在錨定anchor延伸末端連接時(shí)會出現(xiàn)錯(cuò)配，導(dǎo)致后面的熒光探針無法連接，只有少部分正確配對的自由探針后面才能繼續(xù)連接熒光探針，因此導(dǎo)致熒光信號在采集時(shí)會較弱，從而導(dǎo)致后續(xù)核苷酸序列信息的讀取準(zhǔn)確率降低。而本發(fā)明通過控制切刻內(nèi)切酶酶切保留的核苷酸個(gè)數(shù)，使其數(shù)值控制在連接酶的保真度范圍以內(nèi)，能夠在增加讀長同時(shí)保證連接酶的保真度，不會出現(xiàn)因?yàn)殄e(cuò)配而導(dǎo)致熒光探針無法連接的情況，從而保證了核苷酸序列信息讀取的準(zhǔn)確率。針對上述各技術(shù)方案，為進(jìn)一步說明，本發(fā)明以T4連接酶為例，給出具體的操作實(shí)施例一、讀取第1至5位核苷酸序列信息1、anchor與待測核酸片段的雜交結(jié)合anchor (SEQ ID NO :10)與待測核酸片段的接頭之間通過堿基互補(bǔ)配對雜交結(jié)合， 其中待測核酸片段通過鏈霉親和生物素的作用被固定于磁珠上，而磁珠本身被固定于玻片表面，anchor延伸末端上帶有Nt. Alw I酶的酶切識別位點(diǎn)，該反應(yīng)過程及體系為28°C,400y L 2XSSPE(saline sodium phosphate EDTA)緩沖液對固定于玻片表面的待測核酸片段進(jìn)行潤洗；加入anchor (15 μ Μ)，2 X SSPE 環(huán)境下升溫至 65°C，維持 30s ；降溫至42 °C，Imin 雜交；300C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的anchor分離清除。2、連接熒光探針在T4連接酶的作用下，將熒光探針(3μΜ)連接到anchor延伸末端之后，連接反應(yīng)過程及體系為30°C，連接緩沖液對雜交分離的產(chǎn)物進(jìn)行潤洗；加入T4連接酶，熒光探針(311|1)，連接緩沖液中，301，201^11反應(yīng)；連接反應(yīng)結(jié)束之后，30°C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的熒光探針與連接產(chǎn)物進(jìn)行分離。3、采集熒光信號，讀取核苷酸序列信息將連接有熒光探針的連接產(chǎn)物放入測序儀，在熒光顯微鏡下進(jìn)行激發(fā)，采集熒光信號，根據(jù)熒光信號判斷讀取該位置的核苷酸序列信息。4、洗脫anchor及熒光探針在讀取一個(gè)位置的核苷酸序列信息之后，可以利用不同的方法進(jìn)行洗脫。在一個(gè)實(shí)施例中，利用NaOH直接變性解離，反應(yīng)過程及體系為測序反應(yīng)體系中加入NaOH(0. 05M)，變性Imin ；300C，900 μ L洗脫緩沖液進(jìn)行清洗，將變性解離的anchor及熒光探針以及NaOH進(jìn)行清洗分離。在另一個(gè)實(shí)施例中，利用UDG酶對anchor中的dU堿基進(jìn)行切割形成小片段，然后將小片段直接洗脫，反應(yīng)過程及體系為酶切緩沖液，20 μ L ；UDG酶，10 μ L ；洗脫緩沖液加至200 μ L ；37°C，5min 進(jìn)行酶切；酶切結(jié)束后，加入900 μ L洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫分離，得到未接anchor的待測核酸片段。5、重復(fù)上述步驟，通過更換不同標(biāo)記位置的熒光探針進(jìn)行連接，從而讀取第1至5 位的核苷酸序列信息。二、洗脫anchor及熒光探針讀取完第5位核苷酸序列信息時(shí)，將結(jié)合于待測核酸片段上的anchor和熒光探針洗脫分離，洗脫方式參照之前所述的洗脫方式及步驟。三、連接自由探針1、重新雜交 anchor加入anchor (15 μ Μ)，2 X SSPE 環(huán)境下升溫至 65°C，維持 30s ；降溫至42 °C，Imin 雜交；300C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的anchor分離清除。2、自由探針的連接T4連接酶的作用下，在雜交結(jié)合于待測核酸片段上的anchor延伸末端連接一個(gè)由九聚寡核苷酸形成的非熒光標(biāo)記自由探針，連接反應(yīng)過程及體系為30°C，連接反應(yīng)緩沖液對雜交分離的產(chǎn)物進(jìn)行潤洗；加入T4連接酶，自由探針(311|1)，連接緩沖液中，301，201^11反應(yīng)；連接反應(yīng)結(jié)束之后，30°C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的自由探針與連接產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到自由探針復(fù)合物。四、切刻內(nèi)切酶酶切利用自由探針復(fù)合物中，anchor延伸末端攜帶的酶切識別位點(diǎn)，以Nt. AlwI酶進(jìn)行識別并酶切，然后得到在anchor延伸末端帶有4位核苷酸的酶切產(chǎn)物，酶切反應(yīng)過程及體系為400 μ L NEB buffer 2，30°C 清洗；加入Nt. Alw I 酶(0. IU/μ L，NEB)，NEB buffer2 中，37°C 酶切 Ih ；酶切反應(yīng)結(jié)束后，30°C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，清除未反應(yīng)的酶以及由酶切形成的小片段，得到在anchor延伸末端帶有4位核苷酸的酶切產(chǎn)物。五、連接熒光探針，讀取后續(xù)第6至9位的核苷酸序列信息1、連接第6號位熒光探針并讀取第6位核苷酸序列信息T4連接酶作用下，在酶切產(chǎn)物上保留的4位核苷酸之后連接用于檢測第6號位核苷酸的熒光探針，連接反應(yīng)過程及體系為30°C，連接緩沖液對雜交分離的產(chǎn)物進(jìn)行潤洗；加入T4連接酶，第6號位熒光探針(3 4 11)，連接緩沖液環(huán)境下，301，201^11反應(yīng)；連接反應(yīng)結(jié)束之后，30°C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，將未反應(yīng)的熒光探針與連接產(chǎn)物進(jìn)行分離。將經(jīng)過清洗分離之后的連接產(chǎn)物放入測序儀中，采集熒光信號，根據(jù)熒光信號讀取第6位的核苷酸序列信息。2、洗脫對已經(jīng)讀取第6位核苷酸序列信息的連接產(chǎn)物進(jìn)行洗脫，以便于連接用于檢測下一位核苷酸的熒光探針，此步驟可采用多種方式進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，利用NaOH直接變性解離，反應(yīng)過程及體系為測序反應(yīng)體系中加入NaOH(0. 05Μ)，變性Imin ；300C，900 μ L洗脫緩沖液進(jìn)行清洗，將變性解離的anchor及熒光探針以及NaOH進(jìn)行清洗分離。在另一個(gè)實(shí)施例中，利用UDG酶對anchor中的dU堿基進(jìn)行切割形成小片段，然后將小片段直接洗脫，反應(yīng)過程及體系為酶切緩沖液，20 μ L ；UDG酶，10 μ L ；洗脫緩沖液加至200 μ L ；37°C，5min 進(jìn)行酶切；酶切結(jié)束后，加入900 μ L洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫分離，得到未接anchor的待測核酸片段。以上兩個(gè)實(shí)施例都是將連接在待測核酸片段上的anchor和保留的核苷酸以及熒光探針完全洗脫，因此讀取后續(xù)其他位置的核苷酸序列信息，需要重新雜交anchor到待測核酸片段，在anchor延伸末端重新連接自由探針并進(jìn)行酶切得到酶切產(chǎn)物，然后再連接熒光探針進(jìn)行檢測，過程太過于復(fù)雜，耗費(fèi)的試劑量也大，成本高，不利于推廣。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，直接利用切刻內(nèi)切酶對熒光探針進(jìn)行切除，而 anchor以及原來酶切保留的4位核苷酸則不需要再進(jìn)行重新連接的操作，本實(shí)施例的實(shí)現(xiàn)過程及體系為400 μ LNEB buffer 2，30°C 清洗；加入Nt. Alw I 酶(0. IU/ μ L, NEB)，NEB buffer 2 中，37°C 酶切 Ih ；酶切反應(yīng)結(jié)束后，30°C，900 μ L清洗緩沖液進(jìn)行清洗，清除未反應(yīng)的酶以及由酶切形成的熒光探針小片段。3、更換熒光探針，讀取后續(xù)位置的核苷酸序列信息利用優(yōu)選實(shí)施例中的洗脫方式，以Nt. Alw I酶對測序后的反應(yīng)體系進(jìn)行酶切，洗脫之后換用標(biāo)記位置不同的熒光探針進(jìn)行連接，采集相應(yīng)的熒光信號，根據(jù)熒光信號進(jìn)行不同位置核苷酸序列信息的讀取，直到讀取第9位核苷酸序列信息。 該實(shí)施例以Τ4連接酶進(jìn)行連接測序，通過常規(guī)連接測序方法讀取第1至5位的核苷酸序列信息，然后在anchor延伸末端連接九聚物自由探針，利用Nt. Alw I酶識別anchor 延伸末端所帶的識別位點(diǎn)并進(jìn)行酶切，得到anchor延伸末端后保留4位核苷酸的酶切產(chǎn)物，然后再進(jìn)行熒光探針的連接，采集熒光信號，從而可以在待測核酸片段的單端實(shí)現(xiàn)在原有5位核苷酸讀長的基礎(chǔ)上增加4位核苷酸的目的。若換用保真度為9的Tth連接酶以類似該實(shí)施例的操作進(jìn)行連接測序，切刻內(nèi)切酶同樣選用Nt. Alw I酶，則可以在待測核酸片段的單端實(shí)現(xiàn)讀長為9加上4 一共13位核苷酸的長度，通過在待測核苷酸的雙端進(jìn)行測序，則讀長可為26位核苷酸。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明對增加讀長的測序方法典型的應(yīng)用但不限于核苷酸測序中，任何其他類似的應(yīng)用均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種增加讀長的測序方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.將第一anchor結(jié)合于待測核酸片段的接頭上，該第一 anchor帶有酶切識別位點(diǎn)；B.在第一anchor延伸末端連接熒光探針，檢測其熒光信號，更換熒光探針并重復(fù)連接和檢測操作，得到延伸末端后M個(gè)核苷酸序列信息；C.利用酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得到在第一anchor延伸末端后保留N 個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物；D.將酶切產(chǎn)物與熒光探針連接，檢測其熒光信號，更換熒光探針并重復(fù)連接和檢測操作，得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息；其中，M、N、K均為正整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，所述第一anchor上帶有至少一個(gè)dU堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，所述第一anchor的一端是封閉的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟C包括以下步驟Cl.將熒光探針與第一 anchor洗脫，錨定第二 anchor并在其延伸末端連接自由探針， 得到自由探針復(fù)合物；C2.利用自由探針復(fù)合物所帶酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶酶切，得到在第一 anchor 延伸末端后保留N個(gè)核苷酸的酶切產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，所述第一anchor和第二 anchor t匿同$$同，當(dāng)H一 anchor 禾口 二 anchor $同0^， 二 anchor ￠$￠#7^ ^ !!一 anchor少L個(gè)核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，步驟Cl中所述第一 anchor上帶有至少一個(gè)dU堿基。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，所述第二anchor上帶有至少一個(gè)dU堿基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟D 通過以下步驟實(shí)現(xiàn)Dl.將酶切產(chǎn)物與熒光探針連接，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息；D2.將熒光探針去除，連接標(biāo)記位置不同的熒光探針，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息；D3.重復(fù)步驟D2的操作，直至得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，步驟D2包括以下步驟 D21.利用酶切產(chǎn)物所帶酶切識別位點(diǎn)，以切刻內(nèi)切酶切掉熒光探針與酶切產(chǎn)物之間的連接，并將熒光探針洗脫；D22.將標(biāo)記位置不同的熒光探針與酶切產(chǎn)物連接，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的增加讀長的測序方法，其特征在于，步驟D2包括以下步驟D21’ .將酶切產(chǎn)物中的anchor與保留的核苷酸以及連接的熒光探針通過解離進(jìn)行洗脫；D22’ .利用雜交anchor-連接探針-切刻內(nèi)切酶酶切的步驟，重新制備酶切產(chǎn)物； D23’.將標(biāo)記位置不同的熒光探針與酶切產(chǎn)物連接，檢測該熒光探針的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，提供了一種增加讀長的測序方法。本發(fā)明所述增加讀長的測序方法，首先使用連接測序法讀取帶有酶切識別位點(diǎn)的anchor延伸末端后M個(gè)以內(nèi)的核苷酸序列信息，巧妙利用切刻內(nèi)切酶識別anchor所帶的酶切識別位點(diǎn)并進(jìn)行酶切，在anchor延伸末端后保留N個(gè)以內(nèi)的核苷酸，將之前已經(jīng)讀取過的相應(yīng)數(shù)量的核苷酸位置封閉，然后在保留的核苷酸之后再連接檢測用的熒光探針，讀取后續(xù)位置的核苷酸序列信息，從而實(shí)現(xiàn)增加讀長的目的。同時(shí)，利用切刻內(nèi)切酶控制酶切之后所保留的核苷酸個(gè)數(shù)，能夠保證連接酶的高保真度，進(jìn)而保證后續(xù)核苷酸序列信息的讀取準(zhǔn)確率。
文檔編號C12Q1/68GK102534040SQ201210047879
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼