本發(fā)明涉及對環(huán)境中的遺傳毒性物質檢測的技術領域，具體為利用攜帶報告基因的重組大腸桿菌檢測環(huán)境中的遺傳毒性物質。

背景技術：

近年來，遺傳毒性污染物在我國環(huán)境中分布較廣，種類及數(shù)量較大，在環(huán)境污染物中有一定代表性，對人體危害較大。食品、藥品、環(huán)境等中的因素引起的對DNA損傷、染色體畸變等癌變越來越多，對這些脅迫因子的檢測也越來越有必要。DNA損傷一般通過遺傳毒性試驗檢測，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，各種遺傳毒性試驗方法也在不斷的改進。

遺傳毒性檢測是指用于檢測可以直接或間接誘導細胞發(fā)生遺傳學損傷的試驗，而DNA的損傷是惡性腫瘤發(fā)展過程的環(huán)節(jié)之一。近年來建立了一些短期快速的體外遺傳毒性試驗方法來檢測DNA的損傷。目前已建立的遺傳毒性短期檢測法已超過200種。其中研究和應用較多的方法有姐妹染色單體交換(sister chromatid exchange,SCE)、程序為NDA合成(unscheduled DNA synthesis)、彗星實驗(coment assay)，又稱單細胞凝膠電泳試驗(single cell gel electrophoresis)、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(reverse mutation test of salmonella typhi munine，又稱Ames試驗)、SOS顯色試驗、原噬菌體誘導試驗方法等。這些檢測方法通常具有操作繁雜、檢測時間長、需要嚴格的無菌操作等不利于推廣的因素。并且由于專利保護等原因，個別檢測方法并不利于國內推廣，限制了其廣泛使用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種可快速響應環(huán)境中可致DNA損傷的基因元件，并將該元件應用于環(huán)境遺傳毒性物質的快速檢測。該檢測方法操作便利、耗時短、無需額外添加化學試劑、不受色素干擾，易于實現(xiàn)高通量樣品檢測。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種DNA損傷檢測響應元件，其基因序列如SEQ ID 1所示。

所述的DNA損傷檢測響應元件在遺傳毒性物質快速檢測方面的應用。

將該元件插入到大腸桿菌表達載體，構建DNA損傷檢測重組載體，并將該重組載體轉入到大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，再將該重組大腸桿菌應用于遺傳毒性物質快速檢測，即將重組菌與遺傳毒性物質孵育，大腸桿菌細胞裂解。

所述重組載體，自5′至3′端依次為DNA損傷檢測響應元件、噬菌體裂解基因和終止子。

所述的噬菌體裂解基因，可為任意一種噬菌體裂解基因，優(yōu)選為lambda噬菌體的裂解基因SRRz，其基因序列為SEQ ID2。

所述的大腸桿菌終止子可為任意一種大腸桿菌終止子，優(yōu)選為T7終止子。

本發(fā)明所提供的遺傳毒性物質快速檢測的方法，包括以下步驟：

(1)利用所述的重組大腸桿菌制備大腸桿菌檢測液；

(2)將待測樣品與大腸桿菌檢測液混合，同時添加同體積純溶劑的大腸桿菌檢測液作對照；兩組樣品均繼續(xù)培養(yǎng)15-60min；

(3)將與待測樣品混合的大腸桿菌檢測液與對照組的大腸桿菌檢測液分別測得OD₆₀₀；

(4)計算裂解效率，根據(jù)裂解效率標準曲線計算待測樣品中遺傳毒性物質濃度。

所述大腸桿菌檢測液的制備：

(1)將重組大腸桿菌儲藏物用LB固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，使其復蘇活化；

(2)將得到的活化大腸桿菌單菌落接入到LB液體培養(yǎng)基中進行震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期；

(3)將得到的飽和菌液以1:100體積比接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.15-0.25，得到大腸桿菌檢測液。

所述大腸桿菌表達載體可為任意一種大腸桿菌載體，如pBluescript,pUC18,pUC19,pET系列載體(如pET30a)等。以pUC18為出發(fā)載體，構建的大腸桿菌裂解載體為pRST。

所述的大腸桿菌，為E.coli BL21，E.coli DH5a，E.coli XL1-blue或E.coli HB101。

所述的遺傳毒性物質可以是Cr⁶⁺、甲磺酸甲酯(MMS)和4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)。

含有所述大腸桿菌遺傳毒性物質響應載體的重組大腸桿菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：

(1)操作對象為大腸桿菌，無致病風險，操作簡便易行。

(2)測試周期短，2h內可檢測完成。

(3)檢測過程無需添加額外試劑(如酶底物等)，成本低廉。

(4)檢測靈敏度高，對Cr⁶⁺、4-NQO、MMS的敏感濃度范圍分別為在0.01-0.1、1-5、40-100mg/L條件下敏感。

附圖說明

圖1載體構建示意圖。

圖2重組大腸桿菌(E.coli BL21/pRST)對Cr⁶⁺(a)、4-NQO(b)、MMS(c)不同遺傳毒性物質的裂解響應圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1

遺傳毒性響應載體的構建

以pUC18為出發(fā)載體，構建遺傳毒性響應載體pRST。具體構建方法如下：

1.合成DNA損傷響應元件P_rec(Seq ID 1)和T7終止子序列，分別在P_rec和T7終止子上游添加EcoRI和XbaI位點，下游添加SpeI和PstI酶切位點。

2.以lambda噬菌體基因組DNA為模板，擴增SRRz基因。在SRRz基因的上下游也分別添加EcoRI和XbaI、SpeI和PstI酶切位點。

3.采用生物積木(Biobricks)方法，采用酶切、連接方法將各元件按照啟動子-裂解基因-終止子順序連接，插入到pUC18載體中，得到遺傳毒性響應載體pRST。

4.將載體pRST轉入到E.coli BL21感受態(tài)細胞，獲得遺傳毒性物質檢測用的重組大腸桿菌E.coli BL21/pRST。

實施例2

裂解效率的計算

大腸桿菌檢測液接觸待測樣品后20min，分別測定各測試菌液在600nm處的光吸收值(OD₆₀₀)。

裂解率(％)＝(A-B)/A*100％

其中，A—添加甲醇的菌液OD₆₀₀

B—添加測試樣的菌液OD₆₀₀。

實施例3

遺傳毒性物質檢測

1.重組大腸桿菌的復蘇活化

將重組大腸桿菌從-80°冰箱中劃線于LB平板培養(yǎng)基中，在37°條件下恢復培養(yǎng)14h。挑取單菌落，接種至LB培養(yǎng)基中，在37°、250rpm條件下培養(yǎng)12-16h。

2.大腸桿菌檢測液制備

將復蘇活化的菌液以1:100體積比例接種至新鮮LB培養(yǎng)基，以190μl體積量加入到96孔培養(yǎng)板中，在35-38℃，600-1000rpm條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀到0.15-0.2(用時約1-1.5h)。

3.與受試樣品接觸

將受試樣品10μl加入到96孔板內，在35-38℃，800rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘，設置3個平行組。同時設置添加相同體積的純溶劑(甲醇)，和添加飽和濃度(Cr⁶⁺、4-NQO、MMS的飽和濃度分別為0.1、100、25mg/L)至野生型E.coli BL21菌株作為陰性對照。

4.實驗結果表明，在該飽和濃度條件下，不含遺傳毒性響應載體的野生型E.coli BL21菌株生長正常，未發(fā)生菌體裂解。本實施例中檢測結果如圖2所示，各遺傳毒性物質檢測的標準曲線對應為：

Cr⁶⁺,Y＝3.685+601.6X,R²＝0.99 (0.01<X<0.1)

4-NQO,Y＝-4.532+12.58X,R²＝0.99 (1<X<5)

MMS,Y＝-31.14+0.9355X,R²＝0.97 (40<X<100)

其中，X表示遺傳毒性物質的濃度(mg/L)，Y表示菌體裂解效率(％)，R²表示曲線擬合相關系數(shù)。

該結果表明，在檢測濃度范圍內，樣品濃度與菌體裂解效率成線性相關。因此，可以用該菌株E.coli BL21/pRST對樣品是否含有遺傳毒性物質進行檢測。

實施例4

不同水樣遺傳毒性檢測

本實施例擬針對不同來源的水樣進行遺傳毒性物質檢測，以Cr⁶⁺為標準毒性物質，對應的檢測樣品的遺傳毒性物質濃度，根據(jù)裂解效率換算為Cr⁶⁺當量濃度。

1.按照實施例3步驟1-2制備E.coli BL21/pRST檢測菌液。

2.取待測水樣，以40mL/min的速度用活化的樹脂吸附，然后乙酸乙酯洗脫。洗脫液采用離心凍干方法去除乙酸乙酯，再以一定體積的蒸餾水溶解樣品至所需體積。將待測水樣與大腸桿菌檢測液混合，同時添加同體積純溶劑的大腸桿菌檢測液做對照；兩組樣品均繼續(xù)培養(yǎng)20min。所述待測水樣分別取日常城市用水(實驗室水龍頭放出)、城市水廠水源、某化工廠廢水和珠江某入水口水樣B。

3.將與待測水樣混合的大腸桿菌檢測液與對照組的大腸桿菌檢測液分別測得OD₆₀₀。

4.計算裂解效率，根據(jù)裂解效率標準曲線計算待測樣品中遺傳毒性物質Cr⁶⁺當量濃度。所得結果如表1所示。

表1結果表明，日常城市用水和城市水廠水源的遺傳毒性物質Cr⁶⁺的當量濃度低于2.5ng/L，而化工廠廢水水樣Cr⁶⁺的當量濃度約為9.3ng/L，珠江某入水口水樣Cr⁶⁺的當量濃度約為4.8ng/L。

上述檢測結果表明，包含有本發(fā)明所述遺傳毒性物質快速響應元件的基因工程菌，在響應濃度范圍內對待測物進行檢測，最終以Cr⁶⁺當量濃度表示待測樣品的遺傳毒性含量。該方法無致病風險，操作簡單、檢測靈敏度高、耗時短、易于推廣。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學

<120> 一種DNA損傷檢測響應元件及其應用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

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<210> 2

<211> 1320

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