專(zhuān)利名稱(chēng)：陣列元件的檢測(cè)、解析及識(shí)別的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及陣列元件的光學(xué)檢測(cè)、解析及識(shí)別，特別是用在光學(xué)薄膜表面上的陣列元件的光學(xué)檢測(cè)、解析及識(shí)別。
背景技術(shù)：
下面簡(jiǎn)單地提供了關(guān)于本發(fā)明背景的描述以幫助理解本發(fā)明，但是不能認(rèn)為這些描述公開(kāi)了本發(fā)明，或者構(gòu)成了本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
在半導(dǎo)體領(lǐng)域，通過(guò)真空揮發(fā)、氣相沉積、旋涂或者浸涂形成的膜一般被用于半導(dǎo)體制造過(guò)程的各個(gè)階段。對(duì)于采用這種技術(shù)制造的設(shè)備的功能而言，監(jiān)控薄膜層的實(shí)際厚度和物理性質(zhì)是絕對(duì)必要的。在制造過(guò)程中以及制造過(guò)程之后，必須經(jīng)常監(jiān)測(cè)這些特性?！肮鈱W(xué)薄膜檢測(cè)”是指確定在襯底表面形成的一個(gè)或多個(gè)薄層的厚度的方法。這種“薄膜”的厚度為約1nm-100μm。
一般地，光學(xué)薄膜測(cè)量依賴(lài)于從一個(gè)包括“光學(xué)薄膜測(cè)試表面”的襯底上反射回來(lái)的光線(xiàn)的一種或多種性質(zhì)的變化。這種意味著，該表面可將入射光反射回去，并且可以通過(guò)對(duì)折射率(n)和吸收系數(shù)(k)的選擇來(lái)配置和調(diào)整該表面，以產(chǎn)生某種因表面質(zhì)量和厚度變化直接導(dǎo)致的信號(hào)。這個(gè)信號(hào)是通過(guò)用光照射表面得到的；光從該表面反射回來(lái)或者透射過(guò)該表面，然而由于干擾效應(yīng)，該表面上的任何一個(gè)薄膜都會(huì)改變反射光或者透射光中一種或多種波長(zhǎng)的顏色、橢圓率或者強(qiáng)度。這種改變的程度，以及由此可獲得的信號(hào)，取決于所有表面膜的質(zhì)量或厚度。
用于對(duì)薄膜進(jìn)行光學(xué)測(cè)量的設(shè)備一般分成兩種儀器類(lèi)型反射儀和橢圓儀。反射儀是基于測(cè)量從光學(xué)薄膜測(cè)試表面反射出來(lái)的光的顏色或者強(qiáng)度的改變；橢圓儀是基于測(cè)量從光學(xué)薄膜測(cè)試表面反射出來(lái)的光的偏振度的改變。這些方法在本領(lǐng)域中是公知的。例如參見(jiàn)，Tompkins and McGahan，Spectroscopic Ellipsometry and ReflectometryAUser’s Guide，John Wiley and Sons，1999，其中討論了材料的各種光學(xué)常數(shù)的性質(zhì)、反射儀的儀器方面知識(shí)、橢圓光譜以及單波長(zhǎng)橢圓光度法，以及收集和分析橢圓光度法和反射法數(shù)據(jù)的分析方法。
由于這種方法和設(shè)備能夠靈敏地在分子級(jí)別上檢測(cè)膜厚度，光學(xué)薄膜測(cè)量在生物系統(tǒng)中的應(yīng)用已經(jīng)被完善地建立起來(lái)了。例如，直接檢測(cè)結(jié)合反應(yīng)的方法和設(shè)備(如，在免疫分析，核酸雜交等中)已經(jīng)被描述過(guò)，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,483,585、6,335,429、6,287,783、6,060,237、5,955,377、5,639,671、5,631，171、5,629,214、5,552,272、5，550,063、5,494,829。雖然這類(lèi)方法不依賴(lài)于信號(hào)產(chǎn)生元件(例如一種熒光、冷光或者色度結(jié)構(gòu)(moiety))來(lái)產(chǎn)生信號(hào)，但是增強(qiáng)對(duì)結(jié)合反應(yīng)的檢測(cè)，也采用提供額外質(zhì)量或者光學(xué)厚度的放大方法(例如沉淀物的催化制造，或者，諸如膠乳、金等顆粒的結(jié)合)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及制造和使用高處理量(high-throughput)薄膜光學(xué)分析裝置的設(shè)備、組合物和方法。下面的章節(jié)將描述光學(xué)薄膜測(cè)試表面陣列分析所要求的軟硬件條件，這類(lèi)分析用于下列醫(yī)學(xué)或研究應(yīng)用中，例如基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、過(guò)敏原篩檢、藥物開(kāi)發(fā)、高處理量篩選、醫(yī)藥基因組學(xué)、毒素基因組學(xué)，ADME(吸收分布代謝排泄)篩選、傳染病篩檢，針對(duì)特定疾病或者狀態(tài)的SNP(單核苷酸多肽性)分析等。
第一方面，本發(fā)明涉及包括單個(gè)光學(xué)薄膜測(cè)試表面的獨(dú)立陣列，其中單個(gè)光學(xué)薄膜測(cè)試表面提供有多個(gè)離散尋址位置，而每個(gè)位置包括一種針對(duì)感興趣分析物的、固定化捕捉試劑。本文將其稱(chēng)為“陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面”。優(yōu)選地，一個(gè)獨(dú)立陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面所包括的離散尋址位置的數(shù)目為至少4個(gè)，更優(yōu)選的是至少16個(gè)，更更優(yōu)選的是至少32個(gè)，更加優(yōu)選的是64個(gè)，最優(yōu)選的是128個(gè)或者更多。一個(gè)或多個(gè)離散尋址位置可以提供控制信號(hào)(例如用于標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)或者進(jìn)行正/負(fù)控制)或者基準(zhǔn)信號(hào)(即，用來(lái)確定設(shè)備內(nèi)陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面的相對(duì)對(duì)準(zhǔn)信息)。
在一個(gè)相關(guān)方面中，陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面被包含在一個(gè)更大的“測(cè)試表面載體”中，該測(cè)試表面載體在單個(gè)空腔中提供了一個(gè)“陣列的陣列”，從而進(jìn)一步增加了通量。優(yōu)選地，一個(gè)獨(dú)立的測(cè)試表面載體在單個(gè)空腔中所包括的離散陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面的數(shù)目為至少一個(gè)，更優(yōu)選的是至少兩個(gè)，更更優(yōu)選的是至少5個(gè)，更加優(yōu)選的是至少10個(gè)，再更加優(yōu)選的是至少20個(gè)，再更加更加優(yōu)選的是至少50個(gè)，最優(yōu)選的是至少90個(gè)或者更多。像陣列一樣，一個(gè)測(cè)試表面載體可以具有基準(zhǔn)位置，這些基準(zhǔn)位置被用來(lái)提供用于確定測(cè)試表面載體內(nèi)的光學(xué)薄膜測(cè)試表面的相對(duì)對(duì)準(zhǔn)信息。
這里針對(duì)獨(dú)立陣列所用的術(shù)語(yǔ)“離散”是指兩個(gè)或者多個(gè)具有不連續(xù)表面的陣列。這里針對(duì)單個(gè)陣列上的獨(dú)立位置所用的術(shù)語(yǔ)“離散尋址”是指一個(gè)表面的不連續(xù)區(qū)域，從該表面中可獲得某種特定信號(hào)。
來(lái)自陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面上離散尋址位置的信號(hào)是因膜厚度或質(zhì)量發(fā)生變化而產(chǎn)生的，而膜厚度或質(zhì)量的變化又是由于目標(biāo)分子在該陣列內(nèi)的某個(gè)位置處與相應(yīng)的捕捉試劑發(fā)生特異反應(yīng)而造成的。隨著膜厚度或質(zhì)量的變化，從該表面反射的光在偏振狀態(tài)、相位或干涉色方面也會(huì)發(fā)生改變。捕捉試劑可以是小分子、多肽、蛋白質(zhì)、環(huán)化多肽、肽類(lèi)似物(peptidomimetic)、寡聚核苷酸適配子(aptamer)、抗體、單鏈抗體(scFv)、多糖、受體、多聚核苷酸，和/或多聚核苷酸類(lèi)似物；同樣地，目標(biāo)分子可以是小分子、多肽、蛋白質(zhì)、環(huán)化多肽、肽類(lèi)似物、寡聚核苷酸適配子、抗體、單鏈抗體、多糖、受體、多聚核苷酸，和/或多聚核苷酸類(lèi)似物。在本發(fā)明中任何具有特異性結(jié)合特性的材料的組合都可以用作捕捉試劑/分析物對(duì)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“小分子”是指分子量小于3000道爾頓的化合物，優(yōu)選地小于2000或者1500，更優(yōu)選地小于1000，最優(yōu)選地小于600道爾頓。優(yōu)選但是并非必要地，小分子不是一種寡聚肽。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指由至少兩個(gè)氨基酸單體通過(guò)酰氨鍵與相鄰的氨基酸連接組成的共價(jià)聚合物。一種“寡聚多肽”是由一小段氨基酸序列(例如大于2到幾百個(gè)氨基酸)組成的多肽。寡聚多肽一般是通過(guò)化學(xué)合成的方法制備，或者通過(guò)將更大的多聚肽片斷化得到。多肽藥物的實(shí)例包括但并不限于，治療抗體、胰島素、類(lèi)胸腺荷爾蒙、多肽疫苗、以及抗生素例如萬(wàn)古霉素。新多肽藥物的可能通過(guò)例如嗜菌體顯示技術(shù)來(lái)識(shí)別。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指通過(guò)體內(nèi)或者體外免疫抗原響應(yīng)的發(fā)生而獲得的免疫球蛋白分子，包括多克隆、單特異性和單克隆抗體，和抗原結(jié)合片斷(例如Fab片斷)?！懊庖呖乖憫?yīng)”是指適當(dāng)?shù)募?xì)胞與這樣的抗原接觸后針對(duì)一個(gè)或多個(gè)抗原而導(dǎo)致的抗體生成。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單鏈可變區(qū)片斷”或者“scFv”是指通過(guò)共價(jià)聯(lián)接而連接在一起的單個(gè)抗體輕鏈和抗體重鏈上一個(gè)可變的、抗原結(jié)合決定區(qū)域，這種共價(jià)聯(lián)接具有足夠的長(zhǎng)度可以保證重鏈和輕鏈的部分可以形成一種抗原結(jié)合部位。這樣的連接子可以只有一個(gè)共價(jià)鍵那樣短；優(yōu)選的連接子長(zhǎng)度是2-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選的是5-25個(gè)長(zhǎng)度。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多聚核苷酸”是指由核苷酸共價(jià)聚合物組成的分子，核苷酸一般是通過(guò)相鄰的核糖或者脫氧核糖單元上3’和5’羥其形成磷酯鍵連接的。一種“寡聚核苷酸”是一種由短堿基序列(例如，大于2到幾百個(gè)核苷酸，25至50個(gè)核苷酸比較常見(jiàn))組成的多聚核苷酸。多聚核苷酸同時(shí)包括RNA和DNA，可能形成三維形狀例如棒槌頭，啞鈴等，可能是單鏈或者雙鏈。多聚核苷酸藥物可包括核酶RNAi結(jié)構(gòu)，多聚核苷酸疫苗。多聚核苷酸也可包括一種或者多種取代物，例如一種核糖或者脫氧核糖在2’或者3’位置被烷基(例如氧甲基，氧乙基，氧丙基)，甲氧基乙氧基，烯丙基，氨基，或者氟代基。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多聚核苷酸類(lèi)似物”是指與多聚核苷酸結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似的分子，但是它們不是通過(guò)磷酯鍵連接而成的核苷酸共價(jià)聚合物。肽核酸，由嘌呤和嘧啶堿基通過(guò)N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元構(gòu)成的骨架連接在一起的，是一種寡聚核苷酸類(lèi)似物的例子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多糖”是指由兩個(gè)或者更多共價(jià)連接的糖單元構(gòu)成的碳水化合物。一種“寡聚多糖”是一種短糖序列構(gòu)成的多糖(例如，大于2到幾千個(gè)糖單元)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)化多肽”是指單個(gè)氨基酸單元構(gòu)成的共價(jià)聚合物分子，其中每個(gè)分子至少由兩個(gè)氨基酸單元通過(guò)酰氨鍵形成巨環(huán)分子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽類(lèi)似物”是指與多肽結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似的分子，但并不是通過(guò)酰氨鍵連接的氨基酸共價(jià)聚合物。一種類(lèi)肽，它是N取代甘氨酸單元的聚合物，是一種肽類(lèi)似物的例子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸適配子”是指結(jié)合非多聚核苷酸目標(biāo)分子(例如多肽或者小分子)的多聚核苷酸。
一種優(yōu)選的陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面包括一種支撐光學(xué)薄膜測(cè)試表面的襯底。優(yōu)選的襯底材料包括那些基本上為剛性的材料，例如玻璃、硬質(zhì)塑料、金屬、硅等。特別優(yōu)選的襯底材料將在下文中具體描述。這些襯底可能本來(lái)就具有與待測(cè)薄膜效應(yīng)的生成有關(guān)的反射表面，或者可通過(guò)加工來(lái)提供反射表面，例如通過(guò)氣相沉積一個(gè)金屬層?；蛘?，在各種實(shí)施方式中，可優(yōu)選透射性襯底。在下文所述的各種實(shí)施方式中，陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面可進(jìn)一步包括下列置于反射表面之上的附加層中的一個(gè)或多個(gè)一個(gè)抗反射層；以及一個(gè)附著層，其提供共價(jià)或非共價(jià)連接以固定捕捉試劑。正如這里所描述的，這些層的每一個(gè)都是可選的，例如在本發(fā)明的所有方式中，抗反射層不是必需的；而捕捉試劑可以被直接固定到測(cè)試表面上。
一種優(yōu)選形式是將各個(gè)獨(dú)立的陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面置于一個(gè)可以方便地進(jìn)行試劑傳送和分析操作(手動(dòng)地或者利用擺放機(jī)器人(shelfrobotic))的設(shè)備中。因此在各種實(shí)施方式中，在各個(gè)獨(dú)立陣列位置之間具有間隔的96位板(96-position plate)，被用來(lái)容納在本文所述方法和設(shè)備中使用的多個(gè)獨(dú)立陣列，這種96位板與市面上已有的96井板(96-well plate)有類(lèi)似之處。應(yīng)該理解的是，其他的板配置包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，包括96的倍數(shù)(例如384，1536)個(gè)井，利用市面上已有的液體操作機(jī)器人可以方便地使用這些井。
在其它方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面和測(cè)試表面載體的方法。正如下文所要描述的，本發(fā)明的測(cè)試表面載體為超過(guò)光學(xué)薄膜方法的寬廣范圍的檢測(cè)技術(shù)提供了優(yōu)勢(shì)。
本文所述的方法和設(shè)備對(duì)于樣品中多種分析物是否存在或其數(shù)量的多路化檢測(cè)(multiplexed detection)特別有用。術(shù)語(yǔ)“分析物”或者“目標(biāo)”是指在分析中要檢測(cè)的任何分子。分析物(或者目標(biāo))一般是通過(guò)將一種或者多種結(jié)合搭配物(在本文中稱(chēng)為“捕捉試劑”)固定在陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面上測(cè)試位置上。這種結(jié)合搭配物固定住分析物，以便通過(guò)本文描述的方法進(jìn)行檢測(cè)。
優(yōu)選的是生物樣品。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”是指從一種有機(jī)體中得到的樣品。獲得此類(lèi)樣品是為了對(duì)臨床病人進(jìn)行診斷、預(yù)后檢查或評(píng)估。在某些實(shí)施方式中，獲得此類(lèi)樣品是為了確定某種正在發(fā)展的疾病的結(jié)果或者某種疾病的治療方法的效果。優(yōu)選的生物樣品是血液樣品，組織樣品，便樣，唾液樣品，血清樣品，血漿樣品，腦脊液樣品，尿樣，以及其他從病人、有機(jī)體或者樣品得到的液體。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明涉及針對(duì)從手動(dòng)到全自動(dòng)獲取和處理圖像的方法、軟件以及相關(guān)硬件，其中所述圖像是從一個(gè)陣列或者一個(gè)陣列的陣列上獲取的。雖然本文是針對(duì)陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面的分析來(lái)描述的，但本領(lǐng)域技術(shù)應(yīng)該理解的是，這些方法、軟件和硬件可以應(yīng)用于一般的陣列分析，包括組織陣列(例如可從Xymed購(gòu)買(mǎi)到的MAXARRAYTM)；核酸陣列和微陣列(例如可從Affvmetrix購(gòu)買(mǎi)到的GENECHIP)；蛋白或核酸陣列和微陣列(例如可從Panomics購(gòu)買(mǎi)到的)；抗體陣列和微陣列(例如可從Clonetech購(gòu)買(mǎi)到的)；蛋白陣列和微陣列(例如可從Ciphergen購(gòu)買(mǎi)到的)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了一種集成的“圖像分析站”，其包括下列元件中的一個(gè)或多個(gè)，更優(yōu)選地是包括所有下列元件一個(gè)測(cè)試表面載體，其包括本文所述的多個(gè)陣列；用于照射陣列的光學(xué)部件，其用以從多個(gè)離散尋址位置生成信號(hào)；所述光學(xué)部件包括一個(gè)漫射光源；一個(gè)數(shù)碼相機(jī)，其用于記錄一個(gè)或多個(gè)陣列的圖像；用于所述數(shù)碼相機(jī)聚焦和畫(huà)面控制的光學(xué)部件；一個(gè)工作臺(tái)，其用于使所述測(cè)試表面載體相對(duì)于所述數(shù)碼相機(jī)的視場(chǎng)運(yùn)動(dòng)；工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)；所述工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)的手動(dòng)控制器；所述數(shù)碼相機(jī)的手動(dòng)控制器；與所述工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)和/或所述數(shù)碼相機(jī)集成在一起的計(jì)算機(jī)處理器；用于提供預(yù)先確定工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)和/或相機(jī)控制指令的軟件；用于記錄圖像和結(jié)果的數(shù)字存儲(chǔ)介質(zhì)；和/或用于輸入命令和/或觀察圖像和/或結(jié)果的用戶(hù)界面。在優(yōu)選實(shí)施方式中，對(duì)于測(cè)試表面載體上的所有反應(yīng)陣列，圖像分析都是在沒(méi)有用戶(hù)參與的情況下自動(dòng)完成的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“圖像分析”和“圖像處理”是指從陣列上獲得一個(gè)或多個(gè)數(shù)字圖像，以及利用所收集的圖像來(lái)確定一種或者多種分析物在所述陣列上的一個(gè)離散尋址位置處，優(yōu)選是在多個(gè)離散尋址位置處是否存在或者存在的量。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“用于照射陣列的光學(xué)部件”是指光源以及在陣列上提供所需入射光的相關(guān)光學(xué)元件。按照分析形式的不同，用于照射陣列的光學(xué)部件可能簡(jiǎn)單到僅是一束白光或者一個(gè)相干光源；或者可包括位于光源和陣列之間的濾光鏡，以便去除不需要的光線(xiàn)波長(zhǎng)(例如某種低通、高通或帶通濾光鏡)；位于光源和陣列之間的偏振器，以改變光的偏振狀態(tài)；以及本領(lǐng)域技術(shù)人員在反射儀和/或橢圓儀中常用的其他部件。橢圓偏光法可能需要一個(gè)相干或單色光源。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“漫射光源”是指在整個(gè)數(shù)碼相機(jī)的視場(chǎng)上提供基本均勻的照度的光源。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“數(shù)碼相機(jī)”是指一種提供對(duì)應(yīng)于該相機(jī)所獲圖像的數(shù)字輸出信號(hào)的相機(jī)。合適的相機(jī)包括CMOS(互補(bǔ)性氧化金屬半導(dǎo)體)、APS(活動(dòng)像素傳感器)、CCD、和非CCD相機(jī)，這是本領(lǐng)域中所公知的。CCD相機(jī)的優(yōu)選類(lèi)型是線(xiàn)性(Linear)，行間插入(Interline)，全楨(Full-Frame)，全楨轉(zhuǎn)移(Frame-Transfer)。線(xiàn)性CCD包括單一行像素；為了定義一個(gè)圖像，線(xiàn)性CCD必須掃描整個(gè)圖像平面，一行一行地構(gòu)建該圖像。行間插入、全楨、全楨轉(zhuǎn)移設(shè)計(jì)被認(rèn)為是區(qū)域陣列(AreaArray)CCD，因?yàn)樗鼈兪怯尚纬砷L(zhǎng)方形或者正方形區(qū)域的多個(gè)行和列組成的。在一個(gè)行間插入CCD中，每個(gè)像素都具有一個(gè)光檢測(cè)器和電荷存儲(chǔ)區(qū)域。該存儲(chǔ)區(qū)域是通過(guò)對(duì)部分像素屏蔽或掩蔽光而形成的，并且僅將其用于電荷變換過(guò)程。全楨CCD將所有像素都用于圖像捕捉。因而，當(dāng)電荷變換發(fā)生的時(shí)候，像素就處于繁忙狀態(tài)，沒(méi)法繼續(xù)捕捉光子。為了防止像素在進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)移時(shí)(可能會(huì)導(dǎo)致圖像的光模糊)繼續(xù)讀取額外的光，通常要在相機(jī)的透鏡之間或之后設(shè)置一個(gè)機(jī)械快門(mén)。最后，全楨轉(zhuǎn)移CCD類(lèi)似于全楨CCD，但是它們屏蔽出一半的陣列用于臨時(shí)存儲(chǔ)電荷，也就是所謂的“存儲(chǔ)陣列”。連接到一個(gè)模數(shù)轉(zhuǎn)換器的模擬相機(jī)也在這個(gè)術(shù)語(yǔ)的范圍之內(nèi)，因?yàn)檫@類(lèi)相機(jī)提供了所需的圖像數(shù)字輸出，以用于被計(jì)算機(jī)處理器進(jìn)一步處理。
如果一個(gè)圖像被獲取以便被計(jì)算機(jī)處理器處理，該圖像就被說(shuō)成是被一個(gè)相機(jī)“記錄”。本文所述的所有或部分圖像可被存儲(chǔ)在相機(jī)的電子器件中(臨時(shí)或者永久地)，或者可被傳送到附帶的數(shù)字存儲(chǔ)設(shè)備上，或者不經(jīng)存儲(chǔ)直接傳送到計(jì)算機(jī)處理器上。圖像可被獲取成一次一個(gè)測(cè)試表面或在單個(gè)圖像中包括多個(gè)測(cè)試表面、靜態(tài)圖像或?qū)崟r(shí)圖像，連續(xù)或掃描模式圖像的形式，這取決于特定設(shè)備的需求或者處理量的需求。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“用于聚焦控制的光學(xué)部件”是指被用來(lái)將一個(gè)感興趣的區(qū)域聚焦以便被數(shù)碼相機(jī)記錄的光學(xué)器件和相關(guān)機(jī)械硬件。類(lèi)似地，“用于畫(huà)面控制的光學(xué)部件”是指為數(shù)碼相機(jī)提供縮放和搖攝控制的光學(xué)器件和相關(guān)硬件。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“工作臺(tái)”是指用于支撐和提供沿著測(cè)試表面載體的一個(gè)軸或多個(gè)軸運(yùn)動(dòng)的機(jī)械硬件。優(yōu)選地，一個(gè)工作臺(tái)提供沿著標(biāo)記為X和Y的正交方向的移動(dòng)；在某些實(shí)施方式中包括沿著Z軸方向的移動(dòng)(與X/Y平面垂直)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)”是指給工作臺(tái)提供移動(dòng)的部件(例如，步進(jìn)電機(jī)、齒輪裝置，齒輪齒條元件，軸承裝置等)。
如果指令從一個(gè)手動(dòng)控制器或者計(jì)算機(jī)處理器上傳送到一個(gè)裝置上，那么該手動(dòng)控制或者計(jì)算機(jī)處理器就被“集成”到該裝置上，以通過(guò)該裝置提供后續(xù)動(dòng)作。優(yōu)選地，這種集成也提供從該裝置到該手動(dòng)控制器或計(jì)算機(jī)處理器的反饋。例如，一個(gè)與計(jì)算機(jī)處理器集成的數(shù)碼相機(jī)可以接收來(lái)自處理器的指令以記錄圖像，和/或所有或部分圖像數(shù)據(jù)可以從相機(jī)傳送到處理器。集成可以有線(xiàn)方式提供(例如通過(guò)硬連線(xiàn)，串行端口(例如標(biāo)準(zhǔn)的RS-232端口)，USB端口，“火線(xiàn)”端口等)或者以無(wú)線(xiàn)方式提供(例如通過(guò)紅外連接，射頻連接，藍(lán)牙連接等)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“軟件”是指通過(guò)一個(gè)計(jì)算機(jī)處理器來(lái)執(zhí)行的、一組存儲(chǔ)在易失或者非易失性數(shù)字介質(zhì)中的指令、程序和/或過(guò)程。這樣的軟件可存儲(chǔ)在硬盤(pán)或軟盤(pán)上，在易失或者非易失性存儲(chǔ)器中，或光學(xué)介質(zhì)上等。在本發(fā)明中，軟件所提供的指令可用于例如通過(guò)機(jī)器人系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)試驗(yàn)；用于記錄數(shù)字圖像；和/或用于分析數(shù)字圖像，如下文所述。
術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)處理器”是指執(zhí)行一個(gè)計(jì)算機(jī)程序的邏輯運(yùn)算的數(shù)字化裝置，通常也被稱(chēng)為“CPU”。一般地，一個(gè)計(jì)算機(jī)處理器包括帶有算術(shù)邏輯單元(ALU)的數(shù)據(jù)通道來(lái)執(zhí)行算術(shù)/邏輯運(yùn)算，一個(gè)地址生成單元來(lái)提供存儲(chǔ)器地址，和一個(gè)控制單元以向數(shù)據(jù)通道中的各種裝置提供正確的控制信號(hào)來(lái)完成所需的操作。計(jì)算機(jī)一般有一個(gè)處理器、一個(gè)主存儲(chǔ)器，一個(gè)輔助存儲(chǔ)設(shè)備，一個(gè)連接處理器、主存儲(chǔ)器和外圍設(shè)備的總線(xiàn)。數(shù)碼相機(jī)可以通過(guò)這一總線(xiàn)或者通過(guò)并行或串行端口連接到計(jì)算機(jī)。大量公知的計(jì)算機(jī)處理器中的任何一種，例如IntelCorporation，of Santa Clara，Calif的處理器可以用于本文所述的設(shè)備中。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“數(shù)字存儲(chǔ)介質(zhì)”是指任何以數(shù)字形式存儲(chǔ)信息的介質(zhì)。這包括硬盤(pán)和軟盤(pán)，光盤(pán)，隨機(jī)存取存儲(chǔ)器，只讀存儲(chǔ)器等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“用戶(hù)界面”是指允許用戶(hù)與本發(fā)明的設(shè)備交互的裝置，包括下列中的一個(gè)或多個(gè)鍵盤(pán)，鼠標(biāo)，操縱桿，小鍵盤(pán)(keypad)，觸摸屏，監(jiān)視器等。
除非特別說(shuō)明，否則本文所用的術(shù)語(yǔ)“大約”是指任何給定數(shù)值的±10％。
雖然本文所述的圖像分析站的硬件是以檢測(cè)薄膜變化的這些術(shù)語(yǔ)來(lái)表述的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，無(wú)論采用何種信號(hào)生成方法，本發(fā)明的各種部件(特別地包括軟件)可以與任何圖像分析方法結(jié)合使用。僅要求該圖像所提供的信號(hào)與背景之間具有一定的反差，并對(duì)陣列內(nèi)元件具有一定的空間分辨率即可，而且其可以按照某種合適的處理格式存儲(chǔ)。因此這個(gè)軟件可用于熒光，化學(xué)發(fā)光，和其他發(fā)色團(tuán)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于自動(dòng)圖像分析的方法和設(shè)備(包括軟件)，以確定在陣列上的一個(gè)離散尋址位置處，優(yōu)選是多個(gè)離散尋址位置處，一種或者多種分析物是否存在或存在的量。
正如這里描述的，本發(fā)明的圖像分析儀器適于在只有少量用戶(hù)輸入以及該陣列無(wú)用戶(hù)位置的情況下分析大量陣列，最適于以完全自動(dòng)化的方式來(lái)分析大量陣列。但是手動(dòng)序列仍然可以被執(zhí)行，如果需要的話(huà)。這個(gè)圖像分析站已經(jīng)被選用于讀取一個(gè)高反射性的測(cè)試表面，這個(gè)表面生成信號(hào)是在表面上生成的薄膜與光作用之后產(chǎn)生的反射光中生成的。該表面的薄膜特性是該反應(yīng)的永久記錄，而且可以按照需要被分析許多次。生成的信號(hào)對(duì)光致漂白或者光腐蝕都不敏感，因此在整個(gè)分析過(guò)程中都很穩(wěn)定。由于薄膜效應(yīng)是設(shè)備的各層的固有特性，因此各反應(yīng)區(qū)域之間沒(méi)有交擾(cross-talk)，如在測(cè)量熒光或者其他發(fā)色團(tuán)時(shí)觀察到的。
為了便于使用，圖像分析站被設(shè)計(jì)成分析那些裝配在凹槽(depression——例如一個(gè)微量滴定井(microtiter well))底部的表面。這就提供了一種操作和傳送樣品和試劑的簡(jiǎn)單機(jī)構(gòu)，但是需要圖像分析站能夠重復(fù)定位每個(gè)井，并聚焦到該井以獲得圖像，而不受井壁的干擾。同樣的光學(xué)配置可以用于分析以各種其他傳送方式(包括簡(jiǎn)單滑動(dòng)方式或者獨(dú)立的測(cè)試表面)來(lái)呈現(xiàn)的表面。工作臺(tái)優(yōu)選適于容納每種類(lèi)型形式，并適當(dāng)?shù)匾苿?dòng)這些測(cè)試表面以對(duì)該設(shè)備中的每個(gè)陣列進(jìn)行成像。
在下面優(yōu)選的實(shí)施方式中描述的測(cè)試表面載體提供正方形的井來(lái)接收制好的測(cè)試表面，這些測(cè)試表面已經(jīng)涂布了一組生物捕捉試劑的。雖然市面上的微量滴定板可以作為構(gòu)造測(cè)試表面載體的模板，但是也將描述一種專(zhuān)門(mén)為這一具體應(yīng)用而改進(jìn)的微量滴定板。這種微量滴定形式的板的設(shè)計(jì)可以用于傳送所需的任何類(lèi)型的測(cè)試表面，特別是光學(xué)薄膜表面。光學(xué)薄膜表面可以通過(guò)上表面反射來(lái)分析或者根據(jù)光學(xué)支撐或者表面的設(shè)計(jì)與檢測(cè)系統(tǒng)的光程通過(guò)透射測(cè)量來(lái)分析。所生成的信號(hào)是所用測(cè)試表面的一個(gè)功能。例如玻璃支撐可以與熒光或者化學(xué)發(fā)光的標(biāo)簽或者標(biāo)記一起使用?？梢酝ㄟ^(guò)反射或者透射模式進(jìn)行測(cè)量。由于這種改進(jìn)的測(cè)試表面載體或者微量滴定板保持了現(xiàn)有微量滴定板的印記，因此可與所有的現(xiàn)有自動(dòng)化樣品處理設(shè)備兼容。因此這種改進(jìn)的測(cè)試表面載體適合于各種高處理量的應(yīng)用。
當(dāng)一個(gè)陣列的反應(yīng)完成時(shí)，無(wú)論使用了何種信號(hào)生成方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的各種圖像分析工具都需要使用者定義或者定位陣列的位置，陣列上元件的數(shù)目，陣列上元件的定位。這一般是通過(guò)用戶(hù)選擇陣的大小并生成一個(gè)與所選參數(shù)匹配的網(wǎng)格來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然后，用戶(hù)必須將網(wǎng)格拖動(dòng)到該反應(yīng)陣列的一個(gè)圖像上，并保證每個(gè)網(wǎng)格元素對(duì)應(yīng)于合適的陣列元素。因此用戶(hù)要對(duì)陣列內(nèi)元件的任何歪斜和搖擺或者未對(duì)準(zhǔn)負(fù)責(zé)。雖然這些現(xiàn)有工具的性能已經(jīng)非常適合于分析單個(gè)陣列(即使帶有大量元素)，但是無(wú)論以任何分析頻率，它們還不是非常適合于分析大量陣列，即使每個(gè)陣列只有少量的元素。新的“斑點(diǎn)尋找”方法(其以軟件形式提供或者以被編程以完成本發(fā)明所需步驟的通用或者專(zhuān)用計(jì)算機(jī)的形式提供)，大大了減輕了各種高處理量應(yīng)用。
上面所述本發(fā)明內(nèi)容并不是限制性的，根據(jù)下文對(duì)優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述以及所附的權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更加明顯。


圖1是一個(gè)流程圖，示出了生成一個(gè)斑點(diǎn)位置和強(qiáng)度表格的方法的一種實(shí)施方式。
圖2A-2F示出了本發(fā)明的測(cè)試表面載體的一種實(shí)施方式。
圖3示出了一種實(shí)施方式的圖像分析儀器的光程部件的裝配圖。
圖4示出了用于圖像分析儀器的底支撐板的一種實(shí)施方式。
圖5A-5D和圖6A-6D示出了用于圖像分析儀器的側(cè)支撐架的一種實(shí)施方式。
圖7A-7C示出了用于圖像分析儀器的后支撐板的一種實(shí)施方式。
圖8A-8B示出了用于圖像分析儀器的相機(jī)支撐板的一種實(shí)施方式。
圖9A-9C示出了用于圖像分析儀器的延長(zhǎng)管道支架的一種實(shí)施方式。
圖10A-10B示出了用于圖像分析儀器的延長(zhǎng)管道夾的一種實(shí)施方式。
圖11A-11C示出了在本發(fā)明的一種布局中示例性地形成的斑點(diǎn)。
圖12A-12B示出了一個(gè)斑點(diǎn)陣列的梯度。
圖13示出了用于梯度大小和方向的表決圈變換(voting circletransform)。
圖14示出了一組實(shí)驗(yàn)的所有斑點(diǎn)平均值的示例性CV值。
圖15示出了一系列實(shí)驗(yàn)的強(qiáng)度比；以及圖16為同質(zhì)斑點(diǎn)(homozygous spot)示出了圖15中所示的信息。
具體實(shí)施例方式
如上所述，本發(fā)明的描述是針對(duì)陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面的分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，這些方法、軟件和硬件可以應(yīng)用于一般性的陣列的分析。對(duì)于薄膜成像，該圖像分析站包括下列部件或能力中的一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選包括下列所有部件或能力一個(gè)光學(xué)檢測(cè)設(shè)備；一架CCD相機(jī)；一個(gè)同軸漫射光源；一個(gè)可選的偏振器；一個(gè)延長(zhǎng)管道；聚焦透鏡；可選的自動(dòng)變焦和自動(dòng)聚焦能力；一個(gè)x，y工作臺(tái)(有或者沒(méi)有閉環(huán)位置控制)；支撐結(jié)構(gòu)；一個(gè)儀器殼體罩；一個(gè)光功率源(light power source)；一個(gè)工作臺(tái)控制器；一個(gè)用于手動(dòng)工作臺(tái)控制的手柄；一個(gè)計(jì)算機(jī)或者用于軟件和硬件控制的類(lèi)似設(shè)備；一個(gè)用戶(hù)界面；一個(gè)監(jiān)視器；以及軟件。
測(cè)試表面載體是一種格式化設(shè)備(formatting device)，其被設(shè)計(jì)成用于傳送陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面，每個(gè)陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面都包括離散捕捉位置的一個(gè)圖案化陣列，并用于提供試劑傳送和分析處理，而且包括一個(gè)以穩(wěn)固方式放入x，y工作臺(tái)中的表面。傳送平臺(tái)可以是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)載物片的形狀或者可以被設(shè)置成一個(gè)帶有任意井?dāng)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板。優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案采用正方形的井來(lái)接收測(cè)試表面。這種測(cè)試表面載體可以用于傳送非薄膜應(yīng)用的測(cè)試表面。
光學(xué)薄膜測(cè)試表面可以被切割、劃線(xiàn)、或者被破碎成適合的尺寸，然后粘合或熔合到測(cè)試表面載體中。測(cè)試表面載體可以容納一個(gè)或多個(gè)光學(xué)薄膜測(cè)試表面，這取決于測(cè)試表面載體的配置。測(cè)試表面載體的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)是一個(gè)具有96個(gè)井(well)的微量滴定板，其井間隙與市面上的常規(guī)微量滴定板一致。在優(yōu)選實(shí)施方式中，每個(gè)井包含一個(gè)7mm×7mm的光學(xué)薄膜測(cè)試表面；因此，板上的井優(yōu)選為正方形。如果采用光學(xué)薄膜測(cè)試表面的其他配置(例如長(zhǎng)方形，圓形等)，每個(gè)被就被合適地設(shè)計(jì)成可以容納測(cè)試表面。當(dāng)微量滴定板被用于傳送測(cè)試表面給一種分析方法時(shí)(無(wú)論采用何種信號(hào)生成方法)，各個(gè)獨(dú)立陣列表面的尺寸應(yīng)該被處理成適合于測(cè)試表面載體的尺寸。
如果將載物片作為測(cè)試表面載體，那么單個(gè)1″×3″的測(cè)試表面就可以裝入檢測(cè)設(shè)備中，或者大量的更小的條帶或者正方形可以裝入大小仍然是1″×3″的測(cè)試表面載體上。
不論使用何種分析格式或者檢測(cè)方法，測(cè)試表面都是通過(guò)將一組捕捉試劑固定到測(cè)試表面上來(lái)制備的。這種捕捉試劑可以是一種復(fù)雜的組合材料，被設(shè)計(jì)成針對(duì)一定范圍的不同分析物、基因、基因產(chǎn)物、基因組DNA、小分子、SNP、或者其他感興趣的材料對(duì)樣品進(jìn)行檢查。每種捕捉試劑可以特別地捕捉一個(gè)目標(biāo)核苷酸序列，蛋白質(zhì)，糖，脂類(lèi)，激素，或者其他分析物。例如捕捉試劑可以是一種對(duì)樣品中一定范圍的細(xì)胞活素類(lèi)的抗體?；蛘卟蹲皆噭┛梢允且唤M寡聚核苷酸，其對(duì)作為某種特異性疾病的標(biāo)記或者指示的基因組合具有特異性?；蛘卟蹲皆噭┛梢允且唤M寡聚核苷酸，其對(duì)某種特定基因中的SNP突變具有特異性，該特定基因?yàn)槟撤N疾病(例如囊腫性纖維化(CF))指示出某個(gè)個(gè)體的載體狀態(tài)?；蛘卟蹲皆噭┛梢允菍?duì)于一組用于過(guò)敏篩選的過(guò)敏原具有特異性的抗體，或者可以是對(duì)細(xì)菌或病毒抗原(或用于基因的寡聚核苷酸)具有特異性的抗體，以用于傳染病(例如呼吸道傳染病)的致病源的鑒別診斷。
專(zhuān)門(mén)用于各個(gè)獨(dú)立陣列圖像分析的軟件將自動(dòng)識(shí)別和確認(rèn)陣列中每個(gè)檢測(cè)元素的位置和信號(hào)強(qiáng)度。為了自動(dòng)地處理分析過(guò)程，該優(yōu)選實(shí)施方式，如果可能將首先定位圖像中測(cè)試表面的邊緣。如果邊緣被發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)一步的分析中將去除圖像邊緣以外的區(qū)域。接著，在該圖像中定位任何具有正確大小、形狀和強(qiáng)度的可能特征。然后計(jì)算這些特征的數(shù)目。這些特征的數(shù)目被用于確定該圖像中樣品的類(lèi)型。例如，被反應(yīng)的病人樣品的特征數(shù)目可能位于一定范圍之內(nèi)；空白可能有另外一個(gè)不同的范圍；一個(gè)空井可能具有另外一個(gè)典型數(shù)目范圍。一旦確定了樣品類(lèi)型，就利用一組啟發(fā)式規(guī)則(heuristic rule)來(lái)除去偽噪音特征。例如，測(cè)試表面邊緣的少量像素內(nèi)的一個(gè)斑點(diǎn)很有可能是由于清洗問(wèn)題而非真實(shí)反應(yīng)造成的，因而可以在進(jìn)一步的分析中去除。接著，該算法試圖定位剩余斑點(diǎn)位置的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。一種聚類(lèi)算法和額外的啟發(fā)可以用于確定該斑點(diǎn)網(wǎng)格的各行各列的位置。對(duì)于那些含有很少或者未含有反應(yīng)區(qū)域的行和列，可以根據(jù)其他含有較多斑點(diǎn)的行和列的位置和間距來(lái)估計(jì)它們的位置。最終，斑點(diǎn)被匹配到網(wǎng)格上，且信號(hào)被測(cè)量到。為了進(jìn)一步分類(lèi)，將生成一個(gè)斑點(diǎn)位置和信號(hào)強(qiáng)度表格。下文所述的軟件和測(cè)試表面載體一般也適合于非薄膜應(yīng)用。下面將參考圖1來(lái)描述生成斑點(diǎn)位置和信號(hào)表格的方法的一種實(shí)施方式。
該系統(tǒng)的軟件需求包括一個(gè)圖像獲取協(xié)議、工作臺(tái)移動(dòng)和位置控制、陣列識(shí)別、陣列元素識(shí)別，陣列元素量化，陣列偏斜校正，按陣列元素排布的結(jié)果表的生成，背景獲取，背景校正，數(shù)據(jù)處理和解釋?zhuān)约敖Y(jié)果報(bào)告。大量的圖像獲取和工作臺(tái)控制的商業(yè)化資源都是可用的。CCD相機(jī)和工作臺(tái)的供應(yīng)商也提供可以用于這些功能的軟件，然后再集成成一個(gè)最終軟件包。Scanalytics提供一套集成了圖像獲取和工作臺(tái)控制以及其他用于收集和分析圖像化之后的陣列的軟件協(xié)議的軟件包。然而，即使是分析很小的陣列，這個(gè)軟件也需要大量的用戶(hù)交互。
測(cè)試表面設(shè)計(jì)用于光學(xué)薄膜分析的光學(xué)薄膜測(cè)試表面的設(shè)計(jì)方法在本領(lǐng)域是公知的。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,629,214，在此將其全部?jī)?nèi)容(包括所有的表格、附圖和權(quán)利要求)并入本文。很多種剛性材料可以用來(lái)形成襯底，包括玻璃、熔融硅、塑料、陶瓷、金屬和半導(dǎo)體材料。這些襯底可以是任何期望厚度。柔性光學(xué)襯底包括塑料及類(lèi)似材料制成的薄板。大多數(shù)襯底在后續(xù)層被沉積到其上之前，僅需要一種標(biāo)準(zhǔn)的溶劑、電漿蝕刻或者酸洗，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。
光學(xué)薄膜測(cè)試表面一般是反射表面，優(yōu)選為硅或者硅涂布的襯底材料。對(duì)于基于反射的分析應(yīng)用，選擇襯底的主要要求就是要保證僅在上表面發(fā)生反射。剛性材料(例如玻璃和半導(dǎo)體材料，例如硅，金屬等)的表面如果被刨光的話(huà)，都是足夠光滑的，可以提供鏡面反射。提供反射表面也可以通過(guò)在襯底上氣相沉積一層薄金屬膜來(lái)輕松實(shí)現(xiàn)，后續(xù)層的附著也可以通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，一個(gè)玻璃襯底的最上層表面可以涂布一個(gè)層以阻止下層表面產(chǎn)生不希望有的反射。
希望反射表面能夠允許在支撐材料上施加抗反射(AR)膜疊層。AR層的使用也可適用于透射模式檢測(cè)(下面的襯底是透射性的)。由于光學(xué)測(cè)試表面上的膜厚度不同，抗反射膜疊層會(huì)通過(guò)相消干涉來(lái)產(chǎn)生信號(hào)。一般地，襯底(玻璃，石英等)上涂布有薄層材料，以致來(lái)自該膜外表面的反射和來(lái)自該襯底外表面的反射通過(guò)相消干涉彼此抵消。單層涂布中的反射光線(xiàn)產(chǎn)生完全相消的兩個(gè)條件是這些反射的相位差為180°(弧度II)；具有相同的強(qiáng)度。單層抗反射膜的厚度應(yīng)該是四分之一波長(zhǎng)的奇數(shù)倍，以達(dá)到相消的正確相位。如果有三個(gè)或者更多的反射層參與，通過(guò)仔細(xì)地選擇任意相位和相對(duì)強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)完全相消。這是兩層抗反射涂布的基礎(chǔ)，其中這些層被調(diào)整以適合可用材料的折射率，反之亦然。對(duì)于一個(gè)給定的材料組合，常常有兩個(gè)組合的層厚度在給定波長(zhǎng)處為零反射。許多光學(xué)系統(tǒng)(特別是成像系統(tǒng))都采用多色光(不止一個(gè)波長(zhǎng))。為了使系統(tǒng)具有平坦的光譜響應(yīng)，透射光學(xué)器件都用寬波段或者二向色抗反射涂層來(lái)涂布。
對(duì)于來(lái)自光學(xué)測(cè)試表面的反射光或透射光的相消干涉，可以用數(shù)碼相機(jī)(例如CCD)以顏色的變化來(lái)檢測(cè)或者用一個(gè)灰度相機(jī)以灰度值的變化來(lái)檢測(cè)。在沒(méi)有抗反射膜疊層的情況下，一個(gè)反射表面也適合于類(lèi)橢圓光分析(ellipsometric-like analysis)，不過(guò)在光程的檢測(cè)端需要一個(gè)額外的偏振元件。在這種情況下，反射光支撐物上的薄膜可以用于生成入射光的相位變化，然后直接在檢測(cè)器上以反射光或者透射光的強(qiáng)度變化來(lái)測(cè)量這些相位變化。
常規(guī)的抗反射膜疊層可能是在硅襯底上涂布一層氮化硅。這種疊層對(duì)于藍(lán)光波長(zhǎng)是抗反射性的，從而產(chǎn)生一個(gè)金色背景。當(dāng)表面厚度由于目標(biāo)分子的捕獲而改變時(shí)，抗反射波長(zhǎng)開(kāi)始轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生一種藍(lán)紫色。
一旦光學(xué)薄膜測(cè)試表面被提供，就需要考慮捕捉試劑的附著，例如小分子，多肽，蛋白質(zhì)，環(huán)化多肽，肽類(lèi)似物，適配子，抗體，scFv，多糖，受體，多聚核苷酸，多聚核苷酸類(lèi)似物。分子附著到表面的方法，例如通過(guò)共價(jià)附著，靜電附著，疏水附著等，這在本領(lǐng)域是公知的。這些材料可以被直接附著到光學(xué)薄膜測(cè)試表面上，如果其上有足夠的位點(diǎn)來(lái)結(jié)合足夠量的捕捉試劑，以提供光學(xué)分析中的信號(hào)。優(yōu)選地，一個(gè)附著層會(huì)介于光學(xué)薄膜測(cè)試表面和捕捉試劑之間。附著層可以用來(lái)，例如從表面中擴(kuò)展捕捉試劑以便有效結(jié)合。另外，附著層由多價(jià)分子形成，例如由枝狀聚合物(dendrimer)、星形聚合物、自組裝聚合物、多聚硅氧烷，以及制膜膠乳組成的組合，因而使用附著層可以擴(kuò)大光學(xué)薄膜測(cè)試表面上結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。
對(duì)于一個(gè)光學(xué)薄膜設(shè)備，優(yōu)選對(duì)表面進(jìn)行如下處理。為了清楚起見(jiàn)，將針對(duì)AR涂布表面進(jìn)行描述，但是AR層也是可選的。對(duì)于視覺(jué)分析、色度分析或者灰度成像，一般都需要AR層。監(jiān)測(cè)橢圓率的變化并不需要AR層。通過(guò)氣相沉積工藝為硅晶片(直徑大小并不重要)涂布了一層氮化硅。對(duì)厚度和折射率進(jìn)行選擇以適合該應(yīng)用。一個(gè)優(yōu)選設(shè)置是，厚度為500?！?5，折射率為1.985±15。其他的AR材料也是適合的，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。
AR涂布晶片是在旋涂工藝中用一層枝狀硅氧烷來(lái)涂布的。硅氧烷是優(yōu)選的附著層涂層，但是表面的其他化學(xué)變化也是可能的。接著一層長(zhǎng)鏈氨基酸(多聚苯丙氨酸-多聚賴(lài)氨酸)通過(guò)浸液涂布工藝被涂布到硅氧烷層上。多聚苯丙氨酸-多聚賴(lài)氨酸表面提供了一個(gè)氨基層，用于共價(jià)附著到一個(gè)捕捉試劑陣列，以及具有足夠的疏水性以適合于附著到硅氧烷化表面上。如果不需要共價(jià)連接，那么對(duì)于許多基于蛋白質(zhì)的捕捉試劑而言，可以不需要這一層。對(duì)于那些不需要高強(qiáng)度表面操作、高分析嚴(yán)謹(jǐn)度、或者頻繁清洗的表面而言，捕捉試劑的被動(dòng)附著也不失為一個(gè)很好的方案。不同共價(jià)附著方案的表面變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。氨基可以被大量化學(xué)試劑激活，激活之后就可以于其他氨基反應(yīng)?？梢约せ畋砻姘被?，或者可以激活捕捉試劑上的氨基。被激活的氨基與相應(yīng)的未變化的氨基反應(yīng)。其他的化學(xué)作用包括將巰基、醛、亞氨基醚、聯(lián)胺、異氰酸等用作反應(yīng)基團(tuán)。
陣列形成可以利用不同強(qiáng)度的陣列對(duì)測(cè)試表面進(jìn)行斑點(diǎn)化(spot)。單個(gè)陣列內(nèi)斑點(diǎn)的數(shù)目將取決于所進(jìn)行的分析。同一陣列的多次重復(fù)可以應(yīng)用于測(cè)試表面的各個(gè)離散區(qū)段，而且可依賴(lài)或者不依賴(lài)某些類(lèi)型的物理屏障來(lái)隔開(kāi)產(chǎn)品表面上的各個(gè)獨(dú)立陣列。或者具有獨(dú)特內(nèi)容的多個(gè)陣列(每個(gè)陣列中都有大量元素)也有可應(yīng)用于測(cè)試表面。同樣，某種物理屏障也可用于分隔各個(gè)獨(dú)立陣列。
對(duì)于某些應(yīng)用可能需要在一個(gè)特定捕捉試劑的陣列中提供多個(gè)拷貝。例如，當(dāng)對(duì)人群中具有高頻率的SNP進(jìn)行基因性狀篩選時(shí)，可能需要構(gòu)建用于該SNP的兩個(gè)捕捉試樣的多重拷貝?；蛘邔?duì)于一種特定的致病生物或者其株系特異的捕捉試劑可能需要在陣列中有額外的拷貝。這樣，就可以容易地在單次分析中驗(yàn)證陣列中關(guān)鍵的元素。除了針對(duì)將要檢測(cè)的分析物或者疾病圖譜特異的捕捉試劑之外，也可在陣列中提供控制試劑和定向試劑。
在每個(gè)應(yīng)用的捕捉試劑布局設(shè)計(jì)中一個(gè)重要的考慮就是在陣列中各行各列例行生成的信號(hào)數(shù)量。這個(gè)設(shè)計(jì)因素對(duì)于下面將要描述的自動(dòng)陣列識(shí)別算法非常重要。每個(gè)列和行中的足夠元素必須生成信號(hào)，以便在處理所獲取圖像的過(guò)程中，提供對(duì)每個(gè)列和行的優(yōu)化和快速識(shí)別。
陣列中捕捉試劑的設(shè)計(jì)和篩選包括許多因素。所有固定在陣列內(nèi)的捕捉探針必須在常規(guī)反應(yīng)條件下工作，并同時(shí)保持最終完成的測(cè)試表面所需要的靈敏性和特異性。因此斑點(diǎn)化試劑(spotting reagent)必須被設(shè)計(jì)成可以為測(cè)試表面上斑點(diǎn)尺寸一致的產(chǎn)品提供類(lèi)似的表面張力。這種斑點(diǎn)化試劑也應(yīng)該提供一種可以將陣列中每個(gè)捕捉試劑保持成離散和獨(dú)立區(qū)域的表面張力(連同表面化學(xué)，如果有的話(huà))。但是它們也必須提供一個(gè)環(huán)境，該環(huán)境可促進(jìn)特定捕捉試劑粘附到表面上或者使所用附著物的化學(xué)性質(zhì)最大化。這種斑點(diǎn)化試劑也需要防止極少量的斑點(diǎn)化捕捉試劑在表面反應(yīng)固定時(shí)間內(nèi)的干化。
可以通過(guò)多種不同的斑點(diǎn)化技術(shù)將捕捉試劑施加成離散斑點(diǎn)。如果斑點(diǎn)化技術(shù)允許，并且取決于要生成的陣列元素的數(shù)目，所有組成陣列的捕捉試劑可以同時(shí)被施加到測(cè)試表面上。然后，斑點(diǎn)化頭(spotting head)或測(cè)試表面再被調(diào)整到一個(gè)新的位置，接著產(chǎn)生下一個(gè)陣列。或者，每個(gè)捕捉試劑可以被單獨(dú)地按次序施加到測(cè)試表面上的某個(gè)特定位置，直到整個(gè)陣列形成。為了便于生產(chǎn)，優(yōu)選將這些捕捉試劑施加到大塊測(cè)試表面(bulk test surface)上，其中可以同時(shí)或者按次序生成大量陣列(取決于大塊測(cè)試表面的尺寸)。一旦捕捉試劑被固定到大塊測(cè)試表面上，該測(cè)試表面就可以被處理成大量的離散陣列，以便于測(cè)試表面載體內(nèi)的固定。例如如果將一個(gè)4″的硅晶片分成7平方毫米的檢測(cè)片，那么就可以產(chǎn)生大約124個(gè)陣列。
在利用陣列斑點(diǎn)化技術(shù)來(lái)制備陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面過(guò)程中，必須小心避免表面磨耗(abrasion)，因?yàn)樽罱K陣列的表面形貌的偏差可被視作背景信號(hào)或陣列上的偽測(cè)試位置。對(duì)所用斑點(diǎn)化方法的選擇必須平衡將所需捕捉試劑傳送到光學(xué)表面(常常是疏水)的需要以及避免損傷光學(xué)疊層的需要。
對(duì)正負(fù)控制(positive and negative controls)、信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)以及基準(zhǔn)信號(hào)來(lái)說(shuō)，也可保持陣列上的某些離散位置。在后一種情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，如果來(lái)自陣列斑點(diǎn)化方法的背景信號(hào)已經(jīng)被最小化，那么在化驗(yàn)中并不能檢測(cè)到未反應(yīng)陣列上的捕捉位置。假設(shè)一個(gè)有16個(gè)斑點(diǎn)的4×4陣列，無(wú)法分辨每個(gè)拐角斑點(diǎn)和其他的拐角斑點(diǎn)；因此，不可能正確確定陣列的“左上”位置。無(wú)論是在進(jìn)一步的制造過(guò)程或者是在圖像的分析過(guò)程中，可以利用陣列上一個(gè)或多個(gè)預(yù)先確定的、而且在未反應(yīng)狀態(tài)下可以觀察到的斑點(diǎn)來(lái)確定捕捉位置的相對(duì)方位。
一旦所有的陣列在大塊或產(chǎn)品級(jí)測(cè)試表面上生成，就可能需要一些額外的處理。這包括保溫、清洗和干化處理、過(guò)涂布處理以保證穩(wěn)定性或者降低非特異性結(jié)合。所有這些處理都發(fā)生在通過(guò)切割、劃線(xiàn)、激光切割或者其他將大塊測(cè)試表面分成合適尺寸的測(cè)試表面以便適于并入測(cè)試表面載體之前。對(duì)于某些應(yīng)用，測(cè)試表面的結(jié)構(gòu)可以直接出現(xiàn)在測(cè)試表面載體的下層表面上。當(dāng)在一個(gè)大塊測(cè)試表面上生成各個(gè)獨(dú)立陣列的多個(gè)拷貝時(shí)，陣列設(shè)計(jì)的部分必須包括針對(duì)分離處理的足夠的環(huán)繞區(qū)域，以保證切割或分離各個(gè)獨(dú)立陣列時(shí)不會(huì)損壞該陣列。該獨(dú)立測(cè)試表面的外邊緣對(duì)于將測(cè)試表面安放到測(cè)試表面載體上的放置設(shè)備來(lái)說(shuō)也是非常重要的。這是用于該設(shè)備的接觸點(diǎn)。一旦各個(gè)獨(dú)立測(cè)試表面被全部生成，它們就必須被放置到測(cè)試表面載體上。需要采用某種方式將測(cè)試表面粘附到測(cè)試表面載體上。這可以通過(guò)膠合、熱封、化學(xué)焊接、或者其他技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，它們可以合適地處理測(cè)試表面和載體的成分，以及捕捉試劑的穩(wěn)定性和靈敏度。各個(gè)獨(dú)立測(cè)試表面必須以正確的方向，很少的傾斜(平面度)，以及很少的偏斜插入到載體中。
在本發(fā)明中，在測(cè)試表面上獲得必須的平面度優(yōu)選需要將每個(gè)陣列以相對(duì)于水平面大約±10°的傾斜公差放置到載體上，更加優(yōu)選的是傾斜公差為相對(duì)于水平面大約±5°，最優(yōu)選的是傾斜公差為相對(duì)于水平面大約±1°。
陣列中使用的捕捉試劑的數(shù)目是按照將要進(jìn)行的測(cè)試的分析需要，所選格式的測(cè)試表面的大小，以及所施加的捕捉試劑斑點(diǎn)的大小來(lái)決定的。例如，一個(gè)至少有59個(gè)寡聚核苷酸的陣列需要用來(lái)分析一個(gè)病人樣本的與囊性纖維化相關(guān)的CFTR基因中的SNP突變(25個(gè)突變和6個(gè)多態(tài)性)。其中一個(gè)捕捉探針對(duì)于野生型序列(wild typesequence)是特異的，而另一個(gè)對(duì)于該基因在特定待分析SNP位置的突變是特異的。其中三個(gè)多態(tài)性需要一個(gè)捕捉探針。這一板待測(cè)突變是根據(jù)來(lái)自American College of Medical Genetics的建議而決定的。
測(cè)試表面載體的設(shè)計(jì)和制造雖然已經(jīng)商業(yè)化的正方形96井板可以用作測(cè)試表面載體，但是采用新設(shè)計(jì)的載體可以獲得在儀器性能和產(chǎn)量上的巨大提高。這種載體保持了96井板的格式，因?yàn)榭商幚磉@種格式的設(shè)備非常普遍。參見(jiàn)圖2A-2F，改進(jìn)的測(cè)試表面載體保持了標(biāo)準(zhǔn)96井板的外觀尺寸，因此它仍然與所有設(shè)計(jì)用于96井板的機(jī)器人兼容。參見(jiàn)圖2A至2D。
為了改進(jìn)測(cè)試表面的放置和方向，井壁的高度已經(jīng)降低了，因而填滿(mǎn)一個(gè)井的試劑體積從620μL降到320μL。這樣設(shè)計(jì)降低了機(jī)器人必須調(diào)整以進(jìn)入井內(nèi)放置測(cè)試表面的深度，而且潛在地降低了來(lái)自與井壁的陰影所造成的偽成像?？杀皇┘拥綔y(cè)試表面的試劑體積的減少應(yīng)該不會(huì)對(duì)分析的性能造成明顯的影響，反而可能對(duì)于分析過(guò)程中的試劑消耗有正面的影響。而且，更淺的井可以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)規(guī)程中的清洗步驟。
改進(jìn)后的設(shè)計(jì)產(chǎn)生的載體相對(duì)已經(jīng)商業(yè)化的96井板具有更好的幾何公差。“幾何公差”意指在井中心與井中心之間的測(cè)量中、井壁形貌、井底直徑、載體的總體平面度、載體的總體扭曲度的差異。這使得載體中測(cè)試表面的自動(dòng)定位更加容易，對(duì)于已反應(yīng)測(cè)試表面的圖像分析也變得更加容易。所有的幾何公差被設(shè)置成±0.5°。
改進(jìn)后的載體的模具設(shè)計(jì)包括那些將會(huì)導(dǎo)致載體外表顯現(xiàn)為無(wú)光澤或細(xì)微紋理的特征。它還包括圖案化識(shí)別目標(biāo)，例如在每個(gè)井或凹穴的右上角或左下角具有一個(gè)可識(shí)別特征(在示例性的實(shí)施方式中是光滑的、有光澤的圓)。這些特征為測(cè)試表面自動(dòng)定位儀器提供了方向和方位標(biāo)記，這樣在測(cè)試表面放置到井中時(shí)，機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)就可以用來(lái)評(píng)價(jià)排列情況。它們也可以被用于最終的圖像分析過(guò)程中以促進(jìn)井的排列、識(shí)別、定位和分隔，如果需要的話(huà)可以將其用于在成像之前。另外，該載體的每個(gè)井具有8個(gè)對(duì)準(zhǔn)肋條(井的每個(gè)邊分別具有兩條)，它們被設(shè)計(jì)用來(lái)輔助測(cè)試表面在井內(nèi)的支撐。這些肋條可以控制井內(nèi)測(cè)試表面的方位放置(“扭曲”或者“偏斜”)。當(dāng)測(cè)試表面定位在井內(nèi)時(shí)，這些肋條將會(huì)與測(cè)試表面的邊緣相鄰接。參見(jiàn)圖2E。在對(duì)準(zhǔn)肋條內(nèi)部是一個(gè)從井壁中延伸出來(lái)的延長(zhǎng)的窗口框架，它也可以支撐測(cè)試表面并輔助保持井內(nèi)測(cè)試表面的平面度。這一特征能夠改善自動(dòng)分配膠水的能力，因?yàn)樗峁┝四z水分配的凹坑，而且機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)可以用來(lái)控制分配的膠水相對(duì)延長(zhǎng)窗口的量。所放置的測(cè)試表面一旦在井中被緊緊地密封，這將最大程度地降低在分析過(guò)程中滯留在測(cè)試表面下方的試劑、清洗液等的體積。這種特征還可最大程度地降低后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟中的污染。
圖像分析設(shè)備設(shè)計(jì)和制造光學(xué)部件設(shè)計(jì)的一個(gè)可接受的起點(diǎn)是Scanalytics的Elispot設(shè)備(酶聯(lián)免疫點(diǎn)設(shè)備)。然而對(duì)于一般的高處理量使用還需要更加堅(jiān)固的支撐結(jié)構(gòu)和儀器內(nèi)部構(gòu)造。這種圖像分析設(shè)備包括一個(gè)具有至少0.5″的檢測(cè)器表面和不超過(guò)10μm×10μm的像素大小，以及至少640×480像素陣列的CCD相機(jī)。優(yōu)選的最小掃描面積是6.3mm×4.8mm。相機(jī)應(yīng)該提供數(shù)字溫度補(bǔ)償以及至少8比特的數(shù)字偏移控制，但優(yōu)選的是12比特或者更多。最少25000個(gè)電子滿(mǎn)容量的井是優(yōu)選的。動(dòng)態(tài)范圍至少是8比特，優(yōu)選是12比特，16Mhz的掃描速度是優(yōu)選的。讀出噪音不應(yīng)該大于16個(gè)電子，光譜范圍應(yīng)該位于280-1000nm。大于1000的抗浮散因子(anti-blooming factor)也是優(yōu)選的。
相機(jī)應(yīng)該裝配在一個(gè)延長(zhǎng)管或者其他光學(xué)定位硬件以提供合適的聚焦距離和深度。任何所需的光學(xué)放大部件也應(yīng)該包括在光程的這一部分上。
對(duì)于薄膜應(yīng)用來(lái)說(shuō)黑白相機(jī)是優(yōu)選的，但是彩色相機(jī)也是可接受的。
在一種實(shí)施方式中，包括聚焦、成像距離和放大倍數(shù)的光程是預(yù)設(shè)好的，不需要調(diào)整。在實(shí)際應(yīng)用的另一種實(shí)施方式中(其中也許需要在一個(gè)陣列的一個(gè)子部分上聚焦)，可能需要一個(gè)可以調(diào)節(jié)的放大和聚焦?？烧{(diào)節(jié)的放大和聚焦需要額外電機(jī)控制和軟件。這樣一個(gè)自動(dòng)放大、自動(dòng)聚焦的延長(zhǎng)管設(shè)備可以從Thales Optem獲得。
當(dāng)信號(hào)發(fā)生的方法是一種薄膜變化以提供強(qiáng)度一致的大范圍表面覆蓋時(shí)，漫射光源是優(yōu)選的。當(dāng)使用鏡面反射的反射表面時(shí)，漫射光源也會(huì)將來(lái)自該反射表面的反射中的假象降到最小。光源的強(qiáng)度和波長(zhǎng)需要將取決于測(cè)試表面和所用的薄膜信號(hào)生成方法。光源應(yīng)該提供恒定一致的照度。薄膜生成方法可以采用隨機(jī)偏振或者部分偏振的白光源。線(xiàn)性偏振光也可以用于降低鏡面反射的假象。這種光源可被過(guò)濾以提供單色入射光。一根光纖可被用于將光從光源引導(dǎo)到光程的入口。同軸散射器模塊是向該光學(xué)系統(tǒng)提供輸入光一種選擇。
應(yīng)該提供一個(gè)支撐系統(tǒng)，其包括足夠硬度和重量的底座，以最大程度地降低工作臺(tái)在在向各個(gè)方向移動(dòng)時(shí)的振動(dòng)。一個(gè)0.5″厚的鋁板適合于這個(gè)目的。該板的尺寸取決于工作臺(tái)和光學(xué)部件的尺寸，但是一個(gè)15″×18″的板一般來(lái)說(shuō)是足夠的。為了最大程度地降低雜散的表面反射，該鋁板一般被陽(yáng)極化處理或者涂成無(wú)光澤的黑色。
支撐板在各個(gè)位置含有鉆孔。其中部分鉆孔是用于連接x，y工作臺(tái)的支撐栓，而另一部分鉆孔是用于連接支撐結(jié)構(gòu)，這些支撐結(jié)構(gòu)用于連接所述相機(jī)和光學(xué)部件。對(duì)于一個(gè)Ludl Biopoint x，y工作臺(tái)，有4個(gè)支撐栓固定在支撐板上。工作臺(tái)通過(guò)大小合適的內(nèi)六角螺釘固定到這些支撐栓上。支撐栓高度的選擇需要使電機(jī)和控制電纜與支撐板不接觸而且沒(méi)有任何結(jié)合，但也要使支撐栓的高度盡量低，以保持最大的穩(wěn)定性。支撐栓的直徑優(yōu)選地被設(shè)計(jì)成與工作臺(tái)上的機(jī)器位置匹配，而且足夠大以提供工作臺(tái)到支撐板的穩(wěn)定連接。
圖3示出了一個(gè)圖像分析站的組裝。首先，從Zoom 70XL模塊(Optem Part號(hào)399510-309)上移除透鏡帽。然后用內(nèi)六角扳手?jǐn)Q松低模塊耦合器(Optem Part號(hào)33-03-63)的上部固定螺釘。將Zoom 70XL模塊安裝到低模塊耦合器中直至它與低模塊耦合器外表面齊平，然后擰緊螺釘。從0.5x的TV管(Optem Part號(hào)29-90-70)中移除透鏡帽，然后用螺紋連接到Zoom 70XL模塊的上部分。用內(nèi)六角扳手?jǐn)Q松低模塊耦合器底部的固定螺釘，然后安裝到與同軸光照室(Optem Part號(hào)30-14-00)齊平，而且光供給管連接在后部(所有Optem的標(biāo)記應(yīng)該面對(duì)其他部件的前端)。擰緊固定螺釘。用螺紋將偏振器單元(OptemPart號(hào)29-69-02)連接到同軸光照室。用螺紋將光纖室(Optem Part號(hào)30-16-02)連接到偏振器。擰松光纖室的螺釘，然后插入10mm的光纖適配器(Optem Part號(hào)30-16-01)。擰緊螺釘。光學(xué)模塊已經(jīng)準(zhǔn)備好可以安裝了。
如果需要自動(dòng)縮放和自動(dòng)聚焦功能，組裝過(guò)程按照下面的描述修改。用螺紋將0.5x的TV管(Optem Part號(hào)29-90-70)連接到自動(dòng)縮放/自動(dòng)聚焦單元。擰松所連接的同軸光照室(其是自動(dòng)縮放/自動(dòng)聚焦單元的一部分)上的螺釘，插入10mm的光纖適配器(Optem Part號(hào)30-16-01)。擰緊螺釘。這個(gè)單元已經(jīng)準(zhǔn)備好可以安裝了。
將支撐框架置于臺(tái)架頂端上，并將基底滑動(dòng)到臺(tái)架邊緣使得底座下面的底部鉆孔可見(jiàn)。應(yīng)用兩個(gè)橡膠支撐腳，并按緊粘合劑，然后用兩個(gè)1032×1/2的內(nèi)六角螺釘穩(wěn)固連接。旋轉(zhuǎn)底座并對(duì)該底板的后邊緣重復(fù)這一步驟。參見(jiàn)圖4。在每一邊用3個(gè)內(nèi)六角螺釘將左支撐架(圖5A-5D)和右支撐架(圖6A-6D)連接到后支撐件(圖7A-7C)上，然后再將該組件固定到圖4所示的位置。用4個(gè)內(nèi)六角螺釘將相機(jī)支撐板(圖8A-8B)連接到左支撐架和右支撐架的頂部。
用4個(gè)1032×1/2″的內(nèi)六角螺釘將電動(dòng)工作臺(tái)部件安裝到四個(gè)工作臺(tái)支撐栓上，以致工作臺(tái)上的電機(jī)位于該支撐結(jié)構(gòu)的后部。將x工作臺(tái)和y工作臺(tái)控制電纜連接到所標(biāo)記的電機(jī)上，然后將箝位裝置滑動(dòng)入位。根據(jù)反饋控制的需要，一種可接受的工作臺(tái)是Ludl ElectronicsBiopoint或者Bioprecision工作臺(tái)。將控制電纜的另一端穿過(guò)后支撐板(圖7A一7C)的中心孔。將用于工作臺(tái)控制的控制盒和手柄安放在支撐框架的一側(cè)。將電源電纜連接到控制盒，然后將電源電纜插入到電涌保護(hù)的電源出口或者插到一個(gè)電源調(diào)節(jié)單元上。將手柄控制電纜連接到控制盒，并將計(jì)算機(jī)串口電纜連接到控制盒上正確的插口上。
用配套扳手將一個(gè)測(cè)微器通過(guò)螺紋方式連接到三個(gè)線(xiàn)性工作臺(tái)中的每一個(gè)。將其中一個(gè)完成的線(xiàn)性工作臺(tái)安放在相機(jī)支撐板上，以致從前面看的時(shí)候，測(cè)微器位于工作臺(tái)的右邊，而且開(kāi)放滑動(dòng)結(jié)構(gòu)位于組件的上表面(圖8A-8B)。用440×1/2的內(nèi)六角螺釘將線(xiàn)性工作臺(tái)擰緊在支撐板上。這樣可以允許相機(jī)沿y軸移動(dòng)。線(xiàn)性工作臺(tái)可以從Thermo Oriel或者Newport購(gòu)買(mǎi)到。
將第二個(gè)完成的線(xiàn)性工作臺(tái)和第一個(gè)線(xiàn)性工作臺(tái)擺放成90°角，并用4個(gè)440×1/2的內(nèi)六角螺釘擰緊。測(cè)微器安放在儀器的后面，而開(kāi)放平滑結(jié)構(gòu)位于該組件的頂部。這樣可以允許相機(jī)沿x軸運(yùn)動(dòng)。用4個(gè)440×1/2的內(nèi)六角螺釘將角架(Newport)擰緊到第二個(gè)線(xiàn)性工作臺(tái)使得該支架的一面朝向儀器的前端而另一面覆蓋著線(xiàn)性工作臺(tái)。
將第三個(gè)完成的線(xiàn)性工作臺(tái)連接到角支架的前面，而且測(cè)微器需朝下指向，開(kāi)放平滑結(jié)構(gòu)從角支架處朝外。這樣可以允許相機(jī)在z軸方向上運(yùn)動(dòng)。
用四個(gè)632×3/8內(nèi)六角螺釘將延長(zhǎng)管支撐塊連接到線(xiàn)性工作臺(tái)上，參見(jiàn)圖9A-9C。安放完成的光學(xué)組件，以使延長(zhǎng)管以支撐塊的井為中心，70XL縮放模塊的上部分位于支撐塊的底部(與底部相鄰)并在該位置固定。用2個(gè)半圓夾，參見(jiàn)圖10A-10B，將延長(zhǎng)管連接到支撐塊，對(duì)每個(gè)半圓夾使用兩個(gè)632×3/8內(nèi)六角螺釘。確保光學(xué)組件在機(jī)罩內(nèi)位于一條直線(xiàn)上而且堅(jiān)固地連接在一起。
通過(guò)相機(jī)上的螺紋將CCD相機(jī)連接到光學(xué)組件的延長(zhǎng)管的上端。相機(jī)應(yīng)該和朝向系統(tǒng)前端的相機(jī)安裝板表面完全契合。通過(guò)插入到相機(jī)頂端將相機(jī)控制線(xiàn)纜連接上，并將該線(xiàn)纜穿過(guò)后支撐板的中心孔。
將光纖束的一端插入到光學(xué)組件的光纖適配器并擰緊固定螺釘，以確保光纖電纜的牢固。將光纖束穿過(guò)后支撐板的中心孔。
將光源安放在臺(tái)架上工作臺(tái)控制器的鄰近位置，連接上電源線(xiàn)并插到一個(gè)帶電涌保護(hù)的電源出口上或者電源調(diào)節(jié)單元上。將光纖電纜的另一端引到光源外出端口上并擰緊固定螺釘。小心地滑動(dòng)位于光學(xué)部件和將所有電纜穿過(guò)儀器內(nèi)部插入物的工作臺(tái)之上的機(jī)罩組件。光纖電纜和相機(jī)電纜穿過(guò)中心支撐結(jié)構(gòu)，而工作臺(tái)電纜穿過(guò)一個(gè)側(cè)插入物。機(jī)罩組件是通過(guò)將0.5厘米厚的聚碳酸酯片切割成合適大小制成的。這些聚碳酸酯片的斷片與鋁桿及橡膠墊片連接成方形蓋，其適合于如圖4所示的底支撐板。如果檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)背景光敏感，那么古銅色的或者煙灰色的聚碳酸酯可以幫助去除室內(nèi)環(huán)境光。將聚碳酸酯的左側(cè)和左下前板封合到鋁支撐桿上，這些桿通過(guò)鉸鏈連接產(chǎn)生兩個(gè)檢修門(mén)。側(cè)檢修門(mén)可以提供接入整個(gè)系統(tǒng)，如果有任何維護(hù)或者清洗需要的話(huà)。前檢修門(mén)提供了將測(cè)試表面載體插入到工作臺(tái)定位的插入處的接口。每個(gè)鉸接的檢修門(mén)都包括所附把手和磁力鎖定特征以用來(lái)封住這些門(mén)。聚碳酸酯機(jī)罩也為工作臺(tái)和光學(xué)部件在測(cè)量之間或者測(cè)量過(guò)程中提供了防塵以及防其他污染物的功能。機(jī)罩組件高23.75″，這使得相機(jī)及其電纜等這些在設(shè)備中占據(jù)最高位置的部件之上還有一些空間。聚碳酸酯的后部分含有為所有來(lái)自各種部件連接到計(jì)算機(jī)或者合適的控制器的電纜而設(shè)的出口。
小心地滑入外殼系統(tǒng)至臺(tái)架前端，露出一小部分支撐底座的底部，用3個(gè)1032×1/2內(nèi)六角螺釘將蓋子與底座連接。在前門(mén)需要三個(gè)螺釘是因?yàn)橛袡z修門(mén)。旋轉(zhuǎn)該儀器并用兩個(gè)螺釘對(duì)后面重復(fù)連接過(guò)程。將儀器轉(zhuǎn)到正確的方位并將其放置在臺(tái)架的中心使得儀器完好地離開(kāi)邊緣。
將計(jì)算機(jī)監(jiān)視器，鍵盤(pán)，鼠標(biāo)，和計(jì)算機(jī)塔(computer tower)放置在光源和工作臺(tái)控制器的旁邊。將電源線(xiàn)接入監(jiān)視器并插到一個(gè)電涌保護(hù)的電源出口上。將計(jì)算機(jī)連接到監(jiān)視器上。根據(jù)制造商的說(shuō)明將計(jì)算機(jī)塔盒打開(kāi)，安裝圖像獲取板和任何所需的工作臺(tái)控制板。重新包裝好塔盒。將電源線(xiàn)連接到計(jì)算機(jī)塔并插到一個(gè)電涌保護(hù)的電源出口或者電源調(diào)節(jié)單元上。將工作臺(tái)控制電纜連接到面板接口上。將相機(jī)數(shù)據(jù)線(xiàn)連接到串口接口上。按照制造商的說(shuō)明將監(jiān)視器電纜，鼠標(biāo)電纜，和鍵盤(pán)電纜連接到計(jì)算機(jī)塔上。
通過(guò)該系統(tǒng)分析的測(cè)試表面可以構(gòu)建成類(lèi)似于載物片，x、y工作臺(tái)將會(huì)含有一個(gè)插入裝置保證載物片在工作臺(tái)上具有可重復(fù)的定位。測(cè)試表面可以裝配在具有任何井尺寸的井板(welled plate)的底部，同樣一個(gè)插入裝置用來(lái)保證該板在工作臺(tái)上重復(fù)定位。
軟件設(shè)計(jì)生物或者化學(xué)陣列的圖像分析軟件包的目標(biāo)將是完全不需要用戶(hù)的介入。除了初始的設(shè)置和校正之外，所有的步驟應(yīng)該是自動(dòng)發(fā)生的。合適的設(shè)置和校正步驟包括設(shè)置一個(gè)光源的起始光強(qiáng)度，手工確認(rèn)測(cè)試表面與工作臺(tái)定位控制器是否對(duì)準(zhǔn)也應(yīng)該包括在內(nèi)。優(yōu)選地，所有步驟都在軟件的控制之下。
本文所公開(kāi)的實(shí)施方式可以利用很多方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，本文所公開(kāi)的方法可以被實(shí)現(xiàn)成軟件或者固件。進(jìn)一步的實(shí)施方式包括硬件實(shí)現(xiàn)，這包括例如，現(xiàn)場(chǎng)可編程門(mén)陣列(FPGA)。
目前實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的主要限制是確定陣列在測(cè)試表面的位置和校正圖像中陣列的偏斜、處理斑點(diǎn)的大小和形狀變化、反射，斑點(diǎn)組成的“波浪”狀的行和列，以及正確地估計(jì)陣列中元素的數(shù)目和位置。而且，斑點(diǎn)形態(tài)差異的處理，或者在其每個(gè)行和列中具有較低斑點(diǎn)冗余度或很少元素的陣列，也會(huì)阻止該過(guò)程的完全自動(dòng)化。對(duì)所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性和定量處理是可能的。
對(duì)于初始的討論，假設(shè)一個(gè)陽(yáng)性或正(positive)陣列元素將會(huì)被監(jiān)測(cè)成亮背景中的一個(gè)暗特征。然而，算法可以非常容易地實(shí)現(xiàn)檢測(cè)暗背景中的白色元素或者一個(gè)特定顏色與另外一個(gè)顏色——實(shí)際在任一種情況下，都在陽(yáng)性陣列元素和其背景之間產(chǎn)生足夠的對(duì)比度。
圖像分析算法的實(shí)施方式提供一個(gè)應(yīng)用編程接口(API)，其允許該算法可以通過(guò)一個(gè)特定目的的用戶(hù)接口而運(yùn)行，例如為測(cè)試目的而完成，以及作為一個(gè)更加一般化目的軟件包，例如圖像捕捉和報(bào)告程序的一個(gè)擴(kuò)展。進(jìn)一步地，這種模塊化的API背后的算法促進(jìn)了其跨工作臺(tái)的可移植性。例如，這種算法可以打包成微軟Windows上的動(dòng)態(tài)鏈接庫(kù)(DLL)，或者打包成Linux上的一個(gè)共享庫(kù)。另外，這種API使得算法更加不依賴(lài)于在一個(gè)系統(tǒng)的其他部分所用的編程語(yǔ)言。例如，這個(gè)算法已經(jīng)用C語(yǔ)言實(shí)現(xiàn)了，但是也可以被C++，Delphi，VisualBasic和Java編寫(xiě)的其他程序使用。
在測(cè)試表面生產(chǎn)過(guò)程的很多步驟中均可能造成陣列偏斜。用來(lái)施加各個(gè)獨(dú)立捕捉試劑的斑點(diǎn)化技術(shù)可能引入斑點(diǎn)的系統(tǒng)錯(cuò)位，結(jié)果產(chǎn)生偏斜的陣列。用來(lái)生成各個(gè)獨(dú)立測(cè)試表面的分割過(guò)程可能會(huì)因?yàn)椴粶?zhǔn)確或者產(chǎn)生非一致的邊緣而引入偏斜。定位裝置可能會(huì)將測(cè)試表面不準(zhǔn)確地放入到載體中。測(cè)試表面材料的任何固有彎曲可能會(huì)產(chǎn)生最終定位陣列的偏斜，正如測(cè)試表面載體本身的彎曲一樣。一個(gè)邊緣可以是單個(gè)測(cè)試表面的物理邊緣，或者是一個(gè)物理屏障或者標(biāo)記用來(lái)分離單個(gè)陣列以提供相對(duì)于圖像或者測(cè)試表面的其他部分的對(duì)比度。
一個(gè)合適的斑點(diǎn)尋找算法是達(dá)到所需結(jié)果的第一步。這個(gè)程序不但要處理圖像化陣列的任何扭曲，而且還要處理圖像化陣列的平面度，總體質(zhì)量差的陣列，陣列中的非特異性結(jié)合，以及照明不足。這樣的一個(gè)算法在第一步使測(cè)試表面的圖像正方形化(square)。這樣減少了不是由于陣列元素的錯(cuò)位而導(dǎo)致的、在圖像各行或列的斑點(diǎn)中的任何左右或上下漂移。
測(cè)試表面的正方形化包括形成兩個(gè)像素和的矢量。一個(gè)向量代表圖像中所有列像素的和。另一個(gè)代表圖像中所有行像素的和。對(duì)于每個(gè)和向量，生成該向量一階導(dǎo)數(shù)的平方。采用在NucleoSight圖像工作站中使用的圖像大小，這個(gè)過(guò)程是通過(guò)利用一個(gè)Savitsky-Golay濾光鏡來(lái)完成的，其內(nèi)核尺寸(kernal size)為20或者一個(gè)與被分析的圖像和信號(hào)相適合的值。每個(gè)平方導(dǎo)數(shù)中的兩個(gè)強(qiáng)峰代表邊緣。邊緣的質(zhì)量可以通過(guò)平方導(dǎo)數(shù)中的峰高來(lái)估計(jì)。平方導(dǎo)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的倍數(shù)可以作為邊緣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。如果平方導(dǎo)數(shù)的峰沒(méi)有使標(biāo)準(zhǔn)偏差比平均值增加好幾倍的話(huà)，邊緣可能會(huì)被認(rèn)為質(zhì)量太差而需要繼續(xù)進(jìn)行正方形化操作。
如果令人滿(mǎn)意的邊緣被檢測(cè)到，一個(gè)簡(jiǎn)單的搜索被進(jìn)行，用來(lái)旋轉(zhuǎn)圖像以生成一階導(dǎo)數(shù)的平方的最強(qiáng)峰。一般地，嘗試旋轉(zhuǎn)0.25度，上面的求和以及求導(dǎo)過(guò)程被重復(fù)。如果平方導(dǎo)數(shù)的峰值下降，則反轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)方向。否則，進(jìn)行額外的旋轉(zhuǎn)，所得到的峰值強(qiáng)度被檢驗(yàn)。重復(fù)這個(gè)過(guò)程，直到峰值強(qiáng)度超過(guò)最大值。在那一點(diǎn)，原始圖像被反方向旋轉(zhuǎn)一步，降低的峰值就會(huì)被觀察到。這個(gè)反轉(zhuǎn)將圖像返回到產(chǎn)生最佳峰值的旋轉(zhuǎn)。這對(duì)應(yīng)著測(cè)試表面的邊緣最水平和最垂直的旋轉(zhuǎn)。在旋轉(zhuǎn)搜索過(guò)程中的任一時(shí)刻，如果發(fā)現(xiàn)來(lái)自四條邊的結(jié)果不一致，那么就會(huì)利用一個(gè)投票算法來(lái)決定搜索是否繼續(xù)。那種情況下，為了繼續(xù)搜索，必須對(duì)四條邊中的三條進(jìn)行改進(jìn)。
對(duì)測(cè)試表面的圖像進(jìn)行了正方形化處理之后，要嘗試定位該圖像中的斑點(diǎn)網(wǎng)格。由于斑點(diǎn)排列在相對(duì)規(guī)則的行和列中，行像素和列像素的和在斑點(diǎn)所在的行和列的位置會(huì)表現(xiàn)出不同的峰值。這些像素和中的峰值可以用于整體定位該斑點(diǎn)網(wǎng)格。為了這個(gè)過(guò)程的進(jìn)行，測(cè)試表面的所有四個(gè)邊緣必須都要在圖像中被檢測(cè)到，否則該過(guò)程停止。實(shí)際上這些“和”首先被“反轉(zhuǎn)”，通過(guò)從各行各列的最大和中減去每個(gè)像素行和列的像素和。這個(gè)操作將數(shù)據(jù)變換成一種形式，其中，這些“和”中的正向(positive-going)峰值代表了一列或一行斑點(diǎn)的存在。然后生成像素和倒數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)，一個(gè)用于水平像素和，一個(gè)用于垂直像素和。一個(gè)Savitsky-Golay平滑/導(dǎo)數(shù)化多項(xiàng)式被用來(lái)產(chǎn)生這樣的導(dǎo)數(shù)。平滑內(nèi)核的大小設(shè)置成大于常用來(lái)抑制不重要細(xì)節(jié)的情況。這會(huì)使得斑點(diǎn)列和行的位置不變，但卻平滑掉了寬度信息。
二階導(dǎo)數(shù)的一個(gè)區(qū)域被用來(lái)搜索測(cè)試表面邊緣之間的最小值。在測(cè)試表面邊緣的一個(gè)“插圖(inset)”中開(kāi)始和停止搜索將進(jìn)一步減少了搜索的面積。只有測(cè)試表面的寬度或長(zhǎng)度的3％的插圖似乎工作得很好。這個(gè)插圖使搜索從測(cè)試表面邊緣的二階導(dǎo)數(shù)的巨大變化上移開(kāi)。二階導(dǎo)數(shù)的最小值代表這些“和”中的峰值。對(duì)于一個(gè)要考查其有效性的最小值，它的絕對(duì)值必須超過(guò)某個(gè)預(yù)先確定的“截止(cutoff)”值。如果一個(gè)峰值符合這個(gè)截止值，它的位置就被記錄下來(lái)供以后使用。
當(dāng)搜索許多列或者行的斑點(diǎn)時(shí)，如果列的占有率與陣列中其他列或行相比為最小時(shí)，那么對(duì)二階導(dǎo)數(shù)的峰值搜索操作就會(huì)稍微有些不同。算法檢測(cè)高占有率的列或行，并對(duì)未檢測(cè)到的列的位置進(jìn)行插值。算法通過(guò)對(duì)那些檢測(cè)到的行或列之間的距離進(jìn)行檢查來(lái)確認(rèn)插值的列或行的有效性。分隔距離應(yīng)該是幾乎規(guī)則的。如果一個(gè)無(wú)關(guān)的行或列被檢測(cè)到，分隔距離就不會(huì)如此規(guī)則。如果沒(méi)有檢測(cè)到足夠數(shù)目的強(qiáng)峰，例如對(duì)于空井或者沒(méi)有反應(yīng)的測(cè)試表面，算法停止進(jìn)一步分析并返回一個(gè)編碼指示分析被停止的原因。這個(gè)編碼被返回到結(jié)果圖表中以便使用者可以看到失敗的原因。
當(dāng)所有的列和行已經(jīng)被檢測(cè)或者被插值之后，算法移到后來(lái)在算法中用來(lái)校正單個(gè)斑點(diǎn)位置的網(wǎng)格的起始位置。接著，任何需要的圖像的預(yù)處理就完成了。例如，平滑，擴(kuò)張等。目前的算法版本進(jìn)行一個(gè)內(nèi)核尺寸為3.0的中值過(guò)濾操作。內(nèi)核尺寸的選擇將取決于被分析的圖像和信號(hào)。
下一步是對(duì)所處理的圖像應(yīng)用一種自適應(yīng)閾值操作。這個(gè)過(guò)程為后續(xù)的分析步驟對(duì)圖像進(jìn)行二進(jìn)制化(binarize)。之所以使用自適應(yīng)閾值是因?yàn)?，由于測(cè)試表面背景的變化、測(cè)試表面傾斜而造成的照度變化等因素決定了并不存在一個(gè)能夠可靠地對(duì)圖像進(jìn)行二進(jìn)制化的單一閾值。平均自適應(yīng)閾值和中值自適應(yīng)閾值都己被使用。沒(méi)有觀察到一個(gè)方法比另一個(gè)方法更有優(yōu)勢(shì)。
在這一點(diǎn)上應(yīng)用一種形態(tài)愈合(closure)處理(在侵蝕之后進(jìn)行擴(kuò)張)。閾值化圖像中的小“洞”可能會(huì)對(duì)后續(xù)的斑點(diǎn)搜索算法造成干擾，而這個(gè)過(guò)程將使這些小“洞”愈合。愈合中使用的內(nèi)核尺寸非常小，對(duì)于侵蝕是2個(gè)像素，對(duì)于擴(kuò)張是3個(gè)像素。用于侵蝕的較大內(nèi)核被發(fā)現(xiàn)以連接背景區(qū)域。用于擴(kuò)張的較大內(nèi)核在某種程度上可以幫助分解相連的背景區(qū)域。對(duì)于量化分析，這個(gè)步驟可能不被推薦。
當(dāng)獲得了圖像的閾值化版本之后，便需要檢查合適大小和形狀的斑點(diǎn)。一個(gè)默認(rèn)的網(wǎng)格用來(lái)估計(jì)反應(yīng)斑點(diǎn)應(yīng)該出現(xiàn)的位置。這個(gè)程序通過(guò)檢查每個(gè)網(wǎng)格單元格正中心的像素，在每個(gè)單元格中開(kāi)始它的搜索。如果該像素是黑的，程序通過(guò)在水平和垂直方向上搜索下一個(gè)白色的像素來(lái)尋找該中心。如果搜索表明起始點(diǎn)并不位于中心，不論是水平的或者是垂直的，那么將該起始點(diǎn)移向中心，并重復(fù)搜索步驟。對(duì)于大多數(shù)的真實(shí)斑點(diǎn)而言，只需要幾個(gè)搜索步驟就可以確定中心。總之，對(duì)于薄膜圖像分析，中心點(diǎn)搜索步驟被限制在5步之內(nèi)。
如果開(kāi)始時(shí)在單元格中心的像素不是黑的，那么該算法就將單元格分成四個(gè)四分之一部分，估計(jì)每個(gè)四分之一部分的平均強(qiáng)度，并試圖從最黑的四分之一部分的中心重新開(kāi)始搜索。如果最黑的四分之一部分的中心像素也是白的，搜索停止。否則，對(duì)斑點(diǎn)中心的搜索按照上一段的描述繼續(xù)。如果檢測(cè)到的斑點(diǎn)的寬度和高度在預(yù)定范圍之內(nèi)，寬度和高度的比例也在預(yù)定范圍之內(nèi)，那么就將這個(gè)單元格移到一個(gè)新位置。
當(dāng)搜索了該網(wǎng)格上的所有單元格之后，檢查這些單元格以確定鄰近的單元格是否被移動(dòng)到相同的位置。當(dāng)初始網(wǎng)格位置處于一個(gè)使測(cè)試表面上的真實(shí)斑點(diǎn)被幾乎平分的位置上時(shí)，就可能發(fā)生這種“沖突”。任何發(fā)生沖突的單元格均被返回到它們的原始位置。
經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)了沖突之后，被可靠檢測(cè)的斑點(diǎn)(它們具有可接受的大小和形狀)，需要檢查距離起始位置的系統(tǒng)水平和垂直偏移量。該程序?qū)λ椒较蛏掀屏康拇_定是通過(guò)對(duì)所有在列1、3、5和7中可靠地檢測(cè)到的斑點(diǎn)在水平位置上距離起始位置的差異求平均而實(shí)現(xiàn)的。類(lèi)似地，該程序通過(guò)檢查第一行和最后一行中的可靠地檢測(cè)到的斑點(diǎn)來(lái)決定垂直方向上的偏移量。這些行和列可用于一個(gè)特定組的分析物，并且可以為測(cè)試表面上的不同分析物布局而被改變。當(dāng)確定了垂直和水平方向上的偏移量之后，就通過(guò)這些偏移量來(lái)調(diào)整原始網(wǎng)格的位置，并將其重新應(yīng)用到閾值化圖像，并重復(fù)斑點(diǎn)搜索過(guò)程。雖然在這個(gè)步驟后從來(lái)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)過(guò)斑點(diǎn)沖突現(xiàn)象，但是本算法仍然會(huì)尋找斑點(diǎn)沖突，而且一旦檢測(cè)到便逆轉(zhuǎn)它們。
雖然第二個(gè)搜索步驟很少檢測(cè)到額外的強(qiáng)斑點(diǎn)，但是它為弱斑點(diǎn)或未反應(yīng)斑點(diǎn)提供了非常好的估計(jì)位置。如果沒(méi)有這個(gè)調(diào)整，那么對(duì)背景信號(hào)的估計(jì)將不會(huì)很好，因?yàn)榭赡芤黄疱e(cuò)過(guò)未反應(yīng)斑點(diǎn)和弱斑點(diǎn)。
當(dāng)完成了斑點(diǎn)搜索算法之后，通過(guò)從排列在每個(gè)單元格中心周?chē)摹斑吙颉敝械南袼氐钠骄鶑?qiáng)度中減去該中心內(nèi)的圓形區(qū)域(其直徑為22個(gè)像素)的平均強(qiáng)度，來(lái)確定每個(gè)單元格的“信號(hào)”。此時(shí)，該邊框的每一邊具有35個(gè)像素，其厚度為兩個(gè)像素，即有大約270個(gè)像素會(huì)影響這個(gè)平均值。是否使用長(zhǎng)方形邊框并不重要，這只是為了計(jì)算方便。像素的選擇將基于單個(gè)元素的尺寸(斑點(diǎn)尺寸)和圖像獲取參數(shù)，例如折疊放大倍數(shù)(fold magnification)等。
為了獲得每個(gè)單元格的信號(hào)，暗中心區(qū)域的平均強(qiáng)度被從較亮的周?chē)吙虻钠骄鶑?qiáng)度中減去。由于較高的強(qiáng)度值代表著較亮的像素，按照這種方式進(jìn)行計(jì)算將對(duì)“較強(qiáng)”斑點(diǎn)產(chǎn)生更加正向或陽(yáng)性(positive)的信號(hào)。當(dāng)對(duì)測(cè)試表面的所有信號(hào)處理完成時(shí)，用于信號(hào)計(jì)算的位置在圖像上以一個(gè)小“+”號(hào)標(biāo)記在每個(gè)斑點(diǎn)的中心。雖然這個(gè)過(guò)程對(duì)于用戶(hù)來(lái)說(shuō)發(fā)生得太快，以致在實(shí)際的板運(yùn)行過(guò)程看不到，但每個(gè)井的圖像都與這些標(biāo)記一起被記錄下來(lái)用于以后參考，如果需要的話(huà)。
即使是在測(cè)試表面圖像由于斑點(diǎn)化、破裂、檢測(cè)載體放置，工作臺(tái)移動(dòng)、或者用戶(hù)對(duì)準(zhǔn)問(wèn)題造成未對(duì)準(zhǔn)的情況下，該程序也可以定位斑點(diǎn)網(wǎng)格。如果一個(gè)測(cè)試表面具有反應(yīng)斑點(diǎn)，而且該測(cè)試表面的所有邊在圖像上都是清晰可見(jiàn)的，那么該算法將可以正確定位這些斑點(diǎn)?？站约澳切y(cè)試表面未被利用的井常常是在分析過(guò)程的早期就會(huì)被檢測(cè)到。一旦檢測(cè)到這些井，就不會(huì)再對(duì)它們進(jìn)行額外的分析。如果該算法確定某個(gè)特定的井不應(yīng)該被分析，那么它會(huì)返回一個(gè)編碼告知用戶(hù)該分析失敗的原因。
當(dāng)本算法為特定的井生成了數(shù)據(jù)表時(shí)，這個(gè)表包括圖像中每個(gè)斑點(diǎn)的位置，以及前景、背景和凈信號(hào)。雖然該信息不需要被用在全自動(dòng)板運(yùn)行的整個(gè)過(guò)程中，但它們可以用于手工分析各個(gè)獨(dú)立測(cè)試表面。該算法在每個(gè)斑點(diǎn)中心的位置處添加了一個(gè)小的“+”號(hào)標(biāo)記。帶有標(biāo)記的圖像在全自動(dòng)運(yùn)行中被保存。如果對(duì)一個(gè)斑點(diǎn)是否被成功檢測(cè)存在任何疑問(wèn)，那么就可以取回該圖像，并檢查標(biāo)記的位置。
其中這個(gè)區(qū)域的陣列元素的值可以通過(guò)計(jì)算大于一個(gè)閾值的像素?cái)?shù)目或者其他計(jì)算得到。對(duì)于所識(shí)別的元素的各個(gè)獨(dú)立像素響應(yīng)也可以被記錄下來(lái)，或者可以生成像素強(qiáng)度的組織分布圖。該數(shù)據(jù)的其他顯示方式也是可能的，而且這些顯示方式在本領(lǐng)域中是公知的。
該斑點(diǎn)尋找算法的一個(gè)優(yōu)選方案就是要利用一種方法簡(jiǎn)單地識(shí)別和確認(rèn)出陣列中各個(gè)元素的方位，從而消除在圖像上放置網(wǎng)格(對(duì)應(yīng)于該陣列中的元素個(gè)數(shù))的需要。為了識(shí)別陣列上各個(gè)元素，這個(gè)算法必須首先確定符合待分析陣列大小所期望的、元素的粗略大小、形狀和位置。為了這個(gè)目的，將采用霍夫變換。這個(gè)算法根據(jù)所用的準(zhǔn)確變換來(lái)特別地搜索幾何基元(geometric primitive)，例如線(xiàn)或圓形。它也可以用于尋找與真實(shí)空間或圖像中一個(gè)目標(biāo)的位置相對(duì)應(yīng)的變換空間中的最大值。這些變換已經(jīng)被用于檢測(cè)各種行星圖像上的火山口和用于工程制圖的數(shù)字化?；鹕娇跈z測(cè)技術(shù)非常有價(jià)值，因?yàn)樗梢栽诓痪鶆蛘丈浠蛘卟痪鶆虮尘暗臈l件下工作。它也在圓圈不是嚴(yán)格排列的條件下，以及兩個(gè)圓圈都比背景亮和暗的條件下，以及圓圈直徑不是常數(shù)的條件下工作。
這個(gè)流程中的步驟為任意圖像產(chǎn)生了反應(yīng)斑點(diǎn)位置的列表。然后根據(jù)預(yù)先設(shè)置的選擇規(guī)則確定哪個(gè)斑點(diǎn)位置是噪音，并去除該噪音。任何被識(shí)別為真實(shí)斑點(diǎn)位置的斑點(diǎn)均被按照預(yù)先確定的陣列圖分配到一個(gè)特定元素?；陉嚵猩弦炎R(shí)別的元素之間的距離，將未反應(yīng)的斑點(diǎn)在該陣列上分配一個(gè)位置。根據(jù)每個(gè)分配位置的強(qiáng)度數(shù)據(jù)，就可以確定該陣列中每個(gè)元素是否存在或者確定每個(gè)元素的絕對(duì)值。
薄膜檢測(cè)分析的一個(gè)獨(dú)特的特征就是對(duì)于非常強(qiáng)烈的反應(yīng)，該位置的膜厚度或結(jié)合質(zhì)量(bound mass)導(dǎo)致顏色的變化形成一個(gè)第二彩色邊緣，這個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)比灰度測(cè)量中的背景更亮的斑點(diǎn)。因此陽(yáng)性斑點(diǎn)可能會(huì)比背景暗或者比背景亮，但都仍然是有效的陽(yáng)性結(jié)果。另外，形成的斑點(diǎn)的厚度可能不一致。參見(jiàn)圖11A-11C。對(duì)于這種類(lèi)型的測(cè)試表面，以及對(duì)于其他信號(hào)發(fā)生的方法，所選算法要正確地檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)，并將陽(yáng)性信號(hào)正確分配到暗斑點(diǎn)、強(qiáng)反應(yīng)斑點(diǎn)以及非一致性斑點(diǎn)，而且甚至在有噪音背景存在的情況下也不會(huì)召集(call)未反應(yīng)斑點(diǎn)。如果在分析過(guò)程中生成了背景，那么未反應(yīng)斑點(diǎn)能夠表現(xiàn)為暗背景中的亮斑點(diǎn)。參見(jiàn)圖11C。圖像處理的方法必須恰當(dāng)?shù)亟鉀Q這類(lèi)處理問(wèn)題。
在這種情況下，單獨(dú)的霍夫變換是不夠的，因?yàn)樘幚頃r(shí)間太長(zhǎng)。我們注意到，這類(lèi)薄膜分析產(chǎn)生的圖像在斑點(diǎn)中心處都產(chǎn)生一個(gè)從亮到暗的強(qiáng)信號(hào)梯度，而且在其他應(yīng)用中也是這樣。未反應(yīng)斑點(diǎn)同樣也有強(qiáng)信號(hào)梯度，但是它朝向斑點(diǎn)中心是從暗到亮的。參見(jiàn)圖12A-12B。
對(duì)于這些表面具有最佳性能的處理算法由下列步驟構(gòu)成，如圖1中的方法100所示。首先定位測(cè)試表面圖像，雖然這是一個(gè)可選步驟。然后，圖像被裁剪以去除圖像上來(lái)自板井(plate well)的黑邊。同樣這也是一個(gè)可選步驟，但其可減少將要檢查的數(shù)據(jù)量，使算法運(yùn)行更快。而且另一個(gè)好處就是任何在邊緣附近的噪音信號(hào)不用被檢測(cè)或者檢查。為了完成裁剪，形成圖像在水平方向和垂直方向上的投影。兩個(gè)投影的一階導(dǎo)數(shù)通過(guò)階數(shù)為3，內(nèi)核尺寸為21個(gè)元素的Savitsky-Golay平滑/派生多項(xiàng)式產(chǎn)生。根據(jù)具體的應(yīng)用、儀器格式和信號(hào)發(fā)生方法可以選取其他的值。然后這些導(dǎo)數(shù)被平方，并且從邊緣到中心對(duì)這些導(dǎo)數(shù)進(jìn)行掃描以搜索高于該平方導(dǎo)數(shù)的平均值4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的第一個(gè)峰。這樣根據(jù)每個(gè)平方導(dǎo)數(shù)檢測(cè)到的兩個(gè)峰的中心被認(rèn)為是測(cè)試表面的邊緣沿相關(guān)軸的位置。測(cè)試表面的邊緣被檢測(cè)到以后(塊102)，圖像被裁剪到這些邊緣位置(塊104)，一般表現(xiàn)為圖像大小縮小約25％更少像素。如果沒(méi)有檢測(cè)到測(cè)試表面邊緣，那么就跳過(guò)塊104中的步驟，在沒(méi)有減少圖像大小的情況下繼續(xù)處理過(guò)程。
用來(lái)檢測(cè)平方導(dǎo)數(shù)的峰的、高于平均值的四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選取。所選擇的值被設(shè)置成去除了將反射作為實(shí)際的測(cè)試表面邊緣的錯(cuò)誤檢測(cè)。較低的值導(dǎo)致反射被不正確地認(rèn)為是測(cè)試表面邊緣。設(shè)置盡量高的截止值會(huì)在實(shí)際的測(cè)試表面邊緣和圖像中測(cè)試表面的旋轉(zhuǎn)造成限制。如果測(cè)試表面邊緣是破碎的、不平整的，或者被非特異性結(jié)合隱匿，那么裁剪操作可能會(huì)失敗。同樣，如果測(cè)試表面被旋轉(zhuǎn)超過(guò)4°或5°，裁剪操作也可能失敗?？山邮艿男D(zhuǎn)度數(shù)會(huì)因測(cè)試表面圖像的其他質(zhì)量(例如測(cè)試表面背景的總亮度、“清晰度”等)而不同。
如上所述，裁剪圖像失敗對(duì)于斑點(diǎn)搜索算法不是致命的。它僅會(huì)導(dǎo)致稍稍延長(zhǎng)的分析，并可能需要處理更多的偽噪音斑點(diǎn)。
在塊106，在水平方向和垂直方向上同時(shí)產(chǎn)生圖像梯度。這些梯度是通過(guò)采用Ando提出的5×5系數(shù)集(Shigeru Ando，“ConsistentGradient Operators”，IEEE Transaction on Pattern Analysis and ModuleIntelligence，22(3)252-265，2000.)對(duì)圖像進(jìn)行卷積而生成的。取垂直梯度除以水平梯度的反正切函數(shù)生成梯度方向(塊108)。如果哪個(gè)方向上的梯度小于該系統(tǒng)最小可表示的單精度浮斑點(diǎn)數(shù)的絕對(duì)值，那么該方向被設(shè)置成0。注意，生成梯度方向的量級(jí)以及平方梯度的大小和閾值(將在稍后描述)，并不被認(rèn)為會(huì)是非常大的。在塊110，對(duì)水平方向和垂直方向上的梯度進(jìn)行平方，然后將這些結(jié)果相加，生成圖像梯度的平方大小。一個(gè)更加傳統(tǒng)的方法將會(huì)通過(guò)求該和的平方根來(lái)生成圖像梯度大小。去除求平方根的步驟不但使運(yùn)算速度更快，而且也使本算法不存在平方根操作中可能出現(xiàn)的值域問(wèn)題。平方根梯度可以通過(guò)一個(gè)閾值操作(塊112)被二進(jìn)制化。平方梯度大小高于平方梯度大小平均值的所有像素在圖像的閾值化版本中被設(shè)置成1。而平方梯度大小較低的所有像素被設(shè)置成0。
采用平方梯度大小的平均值的倍數(shù)對(duì)圖像進(jìn)行閾值化是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)樣本圖像進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而得到該平均值的那種倍數(shù)會(huì)工作得很好。平均值的一倍數(shù)值對(duì)薄膜圖像工作良好。利用其他測(cè)量平方梯度大小的方法也是可能的，例如方差或中值的倍數(shù)。典型圖像的總體質(zhì)量也有可能影響截止值的選擇。這一步驟對(duì)于該算法的剩余操作并不是絕對(duì)必須的。然而，它將剩余的工作的焦斑點(diǎn)集中在感興趣的像素上。這通常會(huì)為進(jìn)一步的檢查去除大約90％的圖像像素，從而大大地加快分析速度。
在這個(gè)算法的下一步中，即塊114中，從梯度方向、梯度大小和可接受的斑點(diǎn)半徑中得到的信息被組合生成原始圖像的一個(gè)變換，該變換可以揭示可接受斑點(diǎn)的位置。
在一個(gè)圓的邊緣處，梯度“指向”一條垂直于切線(xiàn)的線(xiàn)。梯度可以指向該圓的中心或者遠(yuǎn)離它，這取決于該圓是亮背景上的暗圓還是暗背景上的亮圓。對(duì)于一個(gè)理想定義的圓，所有沿梯度指向圓心的線(xiàn)都會(huì)在圓心相交。由于該圓的形狀會(huì)偏離理想形狀，因而這些交叉斑點(diǎn)可能會(huì)變得模糊，但仍然會(huì)趨向于位于該圓的中心。
當(dāng)其進(jìn)行從亮背景到暗圓的變換時(shí)，梯度的意義被定義成指向各圓的中心。這導(dǎo)致梯度指向圓心，無(wú)論是對(duì)于亮背景上的暗圓圈，對(duì)于白色的圓圈(其由于測(cè)試表面的物理性質(zhì)而具有一個(gè)暗環(huán)圍繞在白色中心的周?chē)?，還是對(duì)于“環(huán)形圈”(其中指示可能已經(jīng)剝落，而僅在亮背景上留下一個(gè)暗圈)。如果一個(gè)未反應(yīng)的斑點(diǎn)被暗色的、非特異性結(jié)合的材料圍繞，那么這個(gè)被暗背景包圍的亮斑點(diǎn)將導(dǎo)致梯度從圓心向外指向，正如所期望的。對(duì)于該算法的這個(gè)步驟，一個(gè)新的空?qǐng)D像(全為0)被產(chǎn)生。對(duì)于閾值化平方梯度大小中的每個(gè)非零像素，梯度方向被返回。梯度方向被用于構(gòu)建一條線(xiàn)段，其指向一個(gè)可能的圓的中心。可接受的圓半徑?jīng)Q定了該線(xiàn)段的結(jié)束端斑點(diǎn)。對(duì)應(yīng)于該線(xiàn)段中一個(gè)像素的、新建圖像中的每個(gè)像素得到一個(gè)“投票”。也就是說(shuō)，每個(gè)這樣的像素的強(qiáng)度都增加了1。隨著閾值化平方梯度大小內(nèi)的連續(xù)像素被檢查和線(xiàn)段被生成，新圖像中對(duì)應(yīng)于合適大小的圓心的斑點(diǎn)趨向于積累更多投票。在這個(gè)過(guò)程的最后，梯度大小和方向已經(jīng)被變換成原始圖像的某種表示，其中圓心具有比背景更高的強(qiáng)度值，參見(jiàn)圖13。雖然這種方法被設(shè)計(jì)用來(lái)處理光學(xué)薄膜測(cè)試表面，但該算法可以處理圖像變化類(lèi)型能夠消極影響圖像解釋的任何檢測(cè)格式。
對(duì)于線(xiàn)段未準(zhǔn)確穿過(guò)像素中心時(shí)鄰近像素之間投票的“劃分”，這個(gè)步驟目前的實(shí)施方式并沒(méi)有進(jìn)行優(yōu)化。該實(shí)施方式也未包含關(guān)于線(xiàn)段生成的優(yōu)化，例如某種Bresenham線(xiàn)生成器。如果需要，可以進(jìn)行這樣的改進(jìn)，但是迄今為止還不存在這樣的情況。
正如利用平方梯度大小一樣，利用閾值操作來(lái)生成該變換的二進(jìn)制版本(圖1的塊116)。這種情況下，閾值標(biāo)準(zhǔn)將要采用該變換中最高票數(shù)的某個(gè)分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)研究表明，將最高票數(shù)的七分之一作為閾值對(duì)于薄膜圖像而言效果很好。因此，在閾值化變換中，這樣的像素被設(shè)置為1，它們對(duì)應(yīng)于該變換中票數(shù)高于最高票數(shù)的七分之一的像素。所有其他的像素被設(shè)置為0。利用其他閾值標(biāo)準(zhǔn)也是可能的。采用最高票數(shù)的某個(gè)分?jǐn)?shù)可使空井圖像中的許多偽斑點(diǎn)被檢測(cè)到。由于沒(méi)有哪個(gè)像素可以得到非常之多的票數(shù)，因此許多像素(常常多于1000個(gè)像素)，可以獲得足夠多的票數(shù)以超過(guò)閾值。在本算法的稍后階段中，將會(huì)聲明這些圖像和無(wú)法解釋的偽斑點(diǎn)，并且去除它們。
閾值化變換中的斑點(diǎn)常常由連續(xù)的多組像素來(lái)表示。在本算法的這一階段，在塊118中，這些連續(xù)的像素被檢測(cè)到。所有在同一連續(xù)區(qū)域中的像素被分配一個(gè)標(biāo)記。一個(gè)小的正整數(shù)用來(lái)表示斑點(diǎn)數(shù)目。對(duì)于閾值圖像中每個(gè)像素連續(xù)區(qū)域，只有一個(gè)像素用來(lái)代表斑點(diǎn)的位置(程序塊120)。合成來(lái)自變換和標(biāo)記區(qū)域的信息，該區(qū)域中對(duì)應(yīng)變換中具有最多票數(shù)的像素的像素被設(shè)置成1。這個(gè)區(qū)域的所有其他像素被設(shè)置成0。有時(shí)會(huì)發(fā)生一個(gè)斑點(diǎn)，或者一個(gè)斑點(diǎn)和噪斑點(diǎn)，在閾值化變換中被兩個(gè)或者多個(gè)連續(xù)區(qū)域表示。算法的下一步，第一階段被壓制的像素被檢查鄰近的周邊像素?！坝H近”是利用生成變換中同樣的斑點(diǎn)大小標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義的。如果兩個(gè)或者更多的像素被識(shí)別成位于另外一個(gè)斑點(diǎn)可接受的半徑之內(nèi)，變換中除了單個(gè)具有最多票數(shù)的像素之外所有像素都被設(shè)置成0，這樣就可以去除緊鄰像素(程序塊122)。
通過(guò)算法的這一步，所有可接受的斑點(diǎn)都已經(jīng)被檢測(cè)到了，并定位到單個(gè)可以最好地代表斑點(diǎn)位置的像素上。除了通過(guò)斑點(diǎn)大小進(jìn)行的選擇，算法對(duì)于這個(gè)斑點(diǎn)是完全通用的，可以應(yīng)用到任何斑點(diǎn)定位任務(wù)。算法的后續(xù)步驟應(yīng)用陣列布局的知識(shí)將每個(gè)斑點(diǎn)于一個(gè)陣列元素聯(lián)系在一起，并決定測(cè)試表面上何處需要進(jìn)行測(cè)量。這些步驟構(gòu)建出于陣列布局匹配的網(wǎng)格。
網(wǎng)格中可能的行與列通過(guò)一個(gè)叫作“領(lǐng)導(dǎo)者—跟隨者”算法的聚類(lèi)算法來(lái)估計(jì)。所采用的聚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)是基于在霍夫變換中采用的同樣的最大斑點(diǎn)大小標(biāo)準(zhǔn)。在程序塊124中，某些斑點(diǎn)或者斑點(diǎn)簇可能會(huì)被當(dāng)作噪音斑點(diǎn)去除，而一個(gè)斑點(diǎn)網(wǎng)格可能會(huì)被定位。假的斑點(diǎn)簇可能會(huì)被去除如果它們太靠近測(cè)試表面的邊緣。這一步依賴(lài)于上述裁剪階段測(cè)試表面邊緣的成功檢測(cè)。如果離邊緣的一些關(guān)鍵距離之類(lèi)的斑點(diǎn)簇被檢測(cè)到，它們可能會(huì)由于破損，清洗效應(yīng)，或者其他碎片的原因被去除。
剩下的斑點(diǎn)被計(jì)數(shù)以決定應(yīng)用于測(cè)試表面的樣本類(lèi)型，如果有的話(huà)。斑點(diǎn)計(jì)數(shù)用于在空白，病人樣本，高密度樣本，或者空井之間分離樣本。對(duì)于這樣樣本的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)范圍不需要是連續(xù)，因?yàn)榇嬖谟行┯?jì)數(shù)是不可能被任何合法的樣本類(lèi)型產(chǎn)生的。
在這個(gè)階段，一系列啟發(fā)式的尺度用來(lái)驗(yàn)證剩下的斑點(diǎn)和斑點(diǎn)簇。如果一個(gè)斑點(diǎn)簇不符合那個(gè)特定位置的設(shè)定條件時(shí)，這個(gè)斑點(diǎn)簇就會(huì)被去除，接著新的斑點(diǎn)簇被驗(yàn)證。常常有這樣的強(qiáng)況，聚類(lèi)信息沒(méi)有完全地指定陣列中所有行和列的位置。例如，在圖12A-12B的陣列中，8個(gè)列常常沒(méi)有任何斑點(diǎn)出現(xiàn)，沒(méi)有產(chǎn)生任何斑點(diǎn)簇。在這些情況下，算法將要試圖插值缺失的斑點(diǎn)簇的位置。例如當(dāng)只有7個(gè)合法的列被檢測(cè)到的時(shí)候，算法將會(huì)檢查檢測(cè)到的列之間的距離，決定缺失的列是其中一個(gè)邊緣還是位于網(wǎng)格中的一個(gè)內(nèi)部列。一旦決定被執(zhí)行，對(duì)于缺失列的估計(jì)位置就可能根據(jù)來(lái)自檢測(cè)到的斑點(diǎn)簇的距離信息被得到。
當(dāng)所有需要的網(wǎng)格行和列被檢測(cè)到或者從聚類(lèi)信息中被估計(jì)出來(lái)，所有參考斑點(diǎn)的列表被驗(yàn)證用來(lái)尋找與每個(gè)網(wǎng)格行與列的交叉斑點(diǎn)相近的斑點(diǎn)。當(dāng)一個(gè)匹配被發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)格的位置移到斑點(diǎn)的位置。如果沒(méi)有適合的參考斑點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)格交叉斑點(diǎn)不移動(dòng)。決定一個(gè)斑點(diǎn)是否與網(wǎng)格位置“足夠近”的標(biāo)準(zhǔn)再一次是依據(jù)在霍夫變換步驟中使用的可接受的斑點(diǎn)半徑基礎(chǔ)上制定的。
每個(gè)網(wǎng)格位置的信號(hào)，不管該處是否有一個(gè)斑點(diǎn)被檢測(cè)到，是通過(guò)加和可接受的最大斑點(diǎn)半徑之內(nèi)的梯度大小來(lái)生成的(塊126)。如果一個(gè)斑點(diǎn)在網(wǎng)格位置附近被檢測(cè)到，就像在前一步確定的一樣，該斑點(diǎn)位置的信號(hào)被測(cè)量。圖像可以被返回到獲取軟件包，并且測(cè)量位置的中心位置標(biāo)記了一個(gè)小加號(hào)“+”標(biāo)記(塊128)。這些信號(hào)值，與測(cè)量中心的位置一起，用來(lái)構(gòu)建一樣返回到界面/獲取軟件包的信息表，并記錄為對(duì)該測(cè)試表面的讀取。
通過(guò)將斑點(diǎn)變換應(yīng)用到整個(gè)梯度大小而且不是閾值版本，我們可以增加檢測(cè)器的靈敏度。檢測(cè)結(jié)束之后，信號(hào)可以通過(guò)對(duì)檢測(cè)到的斑點(diǎn)周?chē)奶荻茸髌骄M(jìn)行測(cè)量。聚類(lèi)質(zhì)量尺度可能需要調(diào)整。一系列在算法中使用的不同的截止值可能需要設(shè)置成最不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹狄栽黾屿`敏度或者斑點(diǎn)信號(hào)的分化。這個(gè)過(guò)程必須與算法輸出結(jié)果中的任何偽斑點(diǎn)檢測(cè)的增加或者背景影響相平衡。特別是投票約數(shù)應(yīng)該被調(diào)整到一個(gè)更大的數(shù)目。采用目前的算法尋找斑點(diǎn)然后依據(jù)一個(gè)或多個(gè)采用閾值的互動(dòng)流程的方法可能會(huì)產(chǎn)生更加靈敏的斑點(diǎn)檢測(cè)。第一個(gè)算法可能用于確認(rèn)合適的斑點(diǎn)位置，第二個(gè)算法可能用于在那個(gè)位置的斑點(diǎn)的真實(shí)強(qiáng)度。
對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行其他合適的修改是非常明顯的，但這并沒(méi)有脫離本發(fā)明或其中任一實(shí)施方式的范圍。現(xiàn)在已經(jīng)詳細(xì)了描述了本發(fā)明，但參考下面的實(shí)例可能會(huì)更加清楚，其中這里的實(shí)例只是說(shuō)明性的，并無(wú)意限定本發(fā)明。
實(shí)例實(shí)例1下面所描述的陣列被設(shè)計(jì)成，從PCR擴(kuò)增后的樣本中檢測(cè)涉及囊性纖維化(“CF”)的基因組目標(biāo)DNA序列。測(cè)試表面是一個(gè)光學(xué)薄膜表面，其檢測(cè)目標(biāo)序列與互補(bǔ)的固定化捕捉序列之間的雜交。生成的光學(xué)信號(hào)是由于雜交事件而導(dǎo)致的光學(xué)厚度變化的函數(shù)。光學(xué)表面反射入射白光，以致特定波長(zhǎng)的光被減弱或者去除，結(jié)果導(dǎo)致特定顏色的變化。在沒(méi)有光學(xué)厚度變化的條件下，反射光保持原始顏色或背景顏色。
被CF表面檢測(cè)的基因組序列對(duì)CFTR基因中的25個(gè)突變和多態(tài)性是特異的，它們被示于下面的表格中


FM-基準(zhǔn)標(biāo)記CC-化學(xué)對(duì)照Neg-陰性對(duì)照每個(gè)CF光學(xué)薄膜測(cè)試表面含有64個(gè)陣列元素。該陣列由針對(duì)25個(gè)突變中每一個(gè)的成對(duì)突變和野生型位置組成。另外CF測(cè)試表面還含有檢測(cè)6個(gè)多態(tài)性的位置。在這個(gè)64個(gè)元素的陣列中有9個(gè)探針序列來(lái)檢測(cè)這些多態(tài)性。除了59個(gè)陣列元素之外，該陣列還含有3個(gè)基準(zhǔn)標(biāo)記和兩個(gè)過(guò)程對(duì)照。
試劑制備1X雜交緩沖液250mL20×SSC緩沖液10mL 10％SDS5gms 酪蛋白至1L 無(wú)RNase/DNase水pH＝ 7.0±0.2一種不溶性沉淀會(huì)立即出現(xiàn)。加熱至50℃直至全部溶解。用一個(gè)0.2μ的醋酸纖維素過(guò)濾單元來(lái)過(guò)濾。分裝到50mL的錐形離心管中。
在2-8℃存放直至使用。
變性溶液 5mL 2N NaOH4mL 0.5M EDTA91mL 無(wú)RNase/DNase的水用一個(gè)0.2μ的醋酸纖維素過(guò)濾單元來(lái)過(guò)濾。室溫保存?？股锼豀RP偶聯(lián)抗體1mg/mL偶聯(lián)儲(chǔ)液 將0.5毫克偶聯(lián)物(conjugate)重新溶解在0.5mL的水中，并在室溫下放置15分鐘。
在2-8℃存放直至使用。偶聯(lián)物從Jackson ImmunoResearchLaboratories公司購(gòu)買(mǎi)的。
清洗液A 5mL 20×SSC10mL 10％SDS985mL無(wú)RNase/DNase的水pH＝ 7.0±0.2用一個(gè)0.2μ的醋酸纖維素過(guò)濾單元來(lái)過(guò)濾。室溫保存。
清洗液B5mL20×SSC995mL 無(wú)RNase/DNase的水pH＝ 7.0±0.2用一個(gè)0.2μ的醋酸纖維素過(guò)濾單元來(lái)過(guò)濾。室溫保存。
實(shí)驗(yàn)設(shè)置在50℃預(yù)熱1X雜交緩沖液大約20分鐘或者直至使用前全部溶解。
移取一份四甲基聯(lián)苯銨(TMB)襯底，使它在臺(tái)架上預(yù)熱到室溫至少15分鐘。分析一塊板一共需要14.4mL，但是待分析的每塊板不會(huì)消耗超過(guò)16mL。
通過(guò)將抗生物素HRP偶聯(lián)抗體偶聯(lián)儲(chǔ)液在雜交緩沖液中稀釋1000倍來(lái)為待分析的板的數(shù)量準(zhǔn)備足夠的偶聯(lián)物(15mL/板)。放置在室溫下直至需要的時(shí)候。稀釋的偶聯(lián)物可以最多可以1小時(shí)內(nèi)使用。
將CF板從熱封包裝袋中取出，但是在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前不要移去粘附的板密封物。
實(shí)驗(yàn)方法移去粘附的板密封物，加入180μL1X雜交緩沖液到每一個(gè)含有測(cè)試表面的井當(dāng)中。替換板密封物，然后在51℃下在SOLO HT加熱塊(或等效物)上預(yù)熱30分鐘。在30分鐘的保溫時(shí)間之后20分鐘開(kāi)始步驟2。
注意保持板的溫度對(duì)于正確的雜交非常關(guān)鍵。室溫可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的溫度并且應(yīng)該被仔細(xì)地監(jiān)測(cè)。
加入PCR擴(kuò)增樣品到試管或者板上，以及足夠的水使得總體積達(dá)到10μL。加入10μL變性溶液到擴(kuò)增樣中，用移液器一次上下混勻。在室溫下保溫10分鐘。
移開(kāi)板板密封物并保存。從CF板上每個(gè)井中移取50μL預(yù)熱的雜交緩沖液，加入到變性的PCR產(chǎn)物中?；旌喜⑺械淖冃訮CR產(chǎn)物(大約70μL)加入到合適的CF井中的雜交緩沖液中。通過(guò)重復(fù)地用移液器吸入吹出來(lái)充分混合。用板密封物覆蓋板。在51℃保溫10分鐘。
從加熱塊上將板拿下，移去板密封物。在室溫下用清洗液A的水流劇烈清洗板(4次)，接著用清洗液B的強(qiáng)水流清洗(4次)。
注意板的清洗是通過(guò)將合適的清洗液水流直接沖向井的一角直至井被溶液充滿(mǎn)為止。每次清洗之后，溶液被倒出。最后一步清洗之后，井被打開(kāi)，板被反扣在臺(tái)面上以去除多余體積的清洗液，或者用一個(gè)設(shè)置成合法程序的板清洗器。
5)加入125μL 1μg/mL的在雜交緩沖液中稀釋的抗生物素HRP偶聯(lián)抗體偶聯(lián)物到每個(gè)井中。在室溫下沒(méi)有覆蓋物的情況下保溫10分鐘。
用清洗液B的強(qiáng)水流清洗(6次)加入150μL TMB襯底到每個(gè)井中。在室溫下保溫5分鐘。
通過(guò)用水充滿(mǎn)每個(gè)井來(lái)清洗(5次)，然后通過(guò)加入甲醇充滿(mǎn)每個(gè)井來(lái)干燥(3次)，最終抹去多余的甲醇。允許剩下的甲醇在用圖像分析系統(tǒng)分析之前揮發(fā)。
實(shí)例2這樣研究被設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)定圖像分析站對(duì)于將要按照x—和y方向被成像的樣品的傾斜的耐受性能。一個(gè)帶有反應(yīng)的和沒(méi)有反應(yīng)的區(qū)域的測(cè)試表面被安放在一個(gè)位于光學(xué)視場(chǎng)中的測(cè)角儀上，該光學(xué)視場(chǎng)的場(chǎng)深，聚焦的水平，和分辨率都和將在分析一個(gè)96井板的井中的測(cè)試表面的完全一樣。測(cè)角儀允許對(duì)應(yīng)用到測(cè)試表面上的傾斜角度的非常細(xì)微的調(diào)節(jié)。帶有應(yīng)用到x和y方向的傾斜的測(cè)試表面被評(píng)估。單個(gè)反應(yīng)斑點(diǎn)的讀數(shù)在正負(fù)傾斜的各個(gè)角度被記錄，如下表中所標(biāo)示的。

在x和y方向上的數(shù)據(jù)是一樣的。
從-2°到6°只有少于5％的對(duì)比度損失。這允許在標(biāo)準(zhǔn)偏差為3σ的時(shí)候有±4°的傾斜差異，這在圖像工作站中是極好的耐受度。表面相對(duì)于真實(shí)的0°位置的微小位置偏移是由于范圍中心斑點(diǎn)非零的事實(shí)導(dǎo)致的。
實(shí)例3為了了解環(huán)境光對(duì)采用圖像分析站測(cè)量反應(yīng)斑點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度造成什么樣的影響，如果有的話(huà)，一個(gè)帶有多個(gè)反應(yīng)表面的板被安放在工作臺(tái)上的板支持器上，并在相機(jī)下排列以適合成像。反應(yīng)測(cè)試表面的各個(gè)斑點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度在存在和不存在環(huán)境光的條件下被測(cè)量。這些反應(yīng)表面被測(cè)量，測(cè)量條件是偏振器的設(shè)置為45°(中心斑點(diǎn))的刻度盤(pán)范圍，燈位置是刻度標(biāo)記剛好位于最上面的位置，代表一個(gè)中等輸入強(qiáng)度。測(cè)量在不同測(cè)試表面上的一系列位置進(jìn)行。E8井中所有斑點(diǎn)位置的單個(gè)斑點(diǎn)強(qiáng)度對(duì)于有和沒(méi)有環(huán)境光的相關(guān)性系數(shù)是94.6％。因此環(huán)境光似乎對(duì)于光學(xué)薄膜陣列的分析具有很小的影響。
實(shí)例4這個(gè)研究被設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)定圖像分析站的合適的光強(qiáng)度設(shè)定和偏振器位置。96井板上一系列具有反應(yīng)區(qū)域和沒(méi)有反應(yīng)區(qū)域的單個(gè)測(cè)試表面被挑選出來(lái)，然后采用光設(shè)定和偏振器位置的不同組合來(lái)分析。偏振器室具有90°的旋轉(zhuǎn)，因此導(dǎo)致飽和信號(hào)(沒(méi)有偏振)的位置被標(biāo)記成1號(hào)位置，而且看作0°位置。從1號(hào)位置相反90°的位置被標(biāo)記成2號(hào)位置(90°位置)，而中心斑點(diǎn)或者偏振器的45°位置被標(biāo)記成3號(hào)位置。光源具有從數(shù)字編號(hào)1到9的光設(shè)定，5是中斑點(diǎn)設(shè)置。
一個(gè)可接受的光/偏振器組合將不會(huì)飽和背景(例如用12比特CCD時(shí)產(chǎn)生4095的灰度值)，將會(huì)表現(xiàn)出陰性斑點(diǎn)和陽(yáng)性斑點(diǎn)之間最大的對(duì)比度，將不會(huì)采用可能導(dǎo)致信號(hào)丟失的全交叉的偏振器設(shè)置，將不會(huì)采用最低的光設(shè)置因?yàn)榭赡軙?huì)損失信號(hào)強(qiáng)度和對(duì)比度，將不會(huì)采用可能降低燈壽命的最高光設(shè)置，將會(huì)采用一些偏振以平衡貫穿測(cè)試表面的光照和缺，以及校正透鏡發(fā)射。
被檢測(cè)的設(shè)定組合如下表所示

總體最好的光條件是在條件4，8和9得到的。所有這些條件都給出了陽(yáng)性和陰性結(jié)果的良好分離。條件5和6也是可能的設(shè)定。為了更加仔細(xì)地考慮偏振器對(duì)于數(shù)據(jù)的影響，這些數(shù)據(jù)按照灰度差異與光設(shè)定在不同的偏振器設(shè)定下作圖。條件4(67.5°偏振器，光設(shè)定1)和條件8(0°偏振器，光設(shè)定4)給出了最好的信號(hào)差異，但是在偏振器為45°設(shè)置時(shí)候獲得的信號(hào)強(qiáng)度完全與光設(shè)定無(wú)關(guān)。這是一個(gè)非常適合的條件，因?yàn)楣鈴?qiáng)度隨著時(shí)間可能發(fā)生較小的變化，而45°偏振器設(shè)置應(yīng)該不會(huì)影響信號(hào)的質(zhì)量。當(dāng)沒(méi)有偏振器使用的時(shí)候和在偏振器全設(shè)置(90°)低光設(shè)置(可保護(hù)燈的壽命和質(zhì)量)下照明不足以產(chǎn)生信號(hào)的時(shí)候，光設(shè)置非常明顯地影響信號(hào)。
雖然完全沒(méi)有偏振器也是可接受的，例如偏振器的0°設(shè)置，我們選擇了45°的設(shè)置以利用在這個(gè)偏振器設(shè)置下沒(méi)有對(duì)光設(shè)定的依賴(lài)的優(yōu)斑點(diǎn)。同樣在沒(méi)有任何光偏振存在的前提下，系統(tǒng)在中等燈設(shè)置處飽和，而飽和不是最好的條件。一個(gè)中等的燈設(shè)定明顯給出最好的整體信號(hào)對(duì)比度，這是優(yōu)選的燈設(shè)定。光設(shè)定和偏振器設(shè)定的耐受是相當(dāng)高的。
實(shí)例5一個(gè)實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的再現(xiàn)性研究被執(zhí)行以測(cè)定包含在設(shè)置光學(xué)識(shí)別和板讀取的誤差。一個(gè)含有24個(gè)測(cè)試表面的96井板被用于這項(xiàng)評(píng)估。每個(gè)測(cè)試表面具有一個(gè)64元素的陣列，如實(shí)例所示。每個(gè)測(cè)試表面上反應(yīng)的斑點(diǎn)的數(shù)目決定于用于分析的輸入樣品的基因型。板名稱(chēng)為021202。
了解包含在每次實(shí)驗(yàn)的設(shè)置中先天的差異型非常有趣。為了測(cè)定這個(gè)差異性，一塊板在統(tǒng)一個(gè)儀器上被實(shí)驗(yàn)5次。其中包括每次重新設(shè)置以保證每次實(shí)驗(yàn)的獨(dú)立性。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之間的相關(guān)性用相關(guān)性數(shù)據(jù)分析包例如Excel來(lái)計(jì)算。相關(guān)系數(shù)p是通過(guò)協(xié)方差和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差按照下面的方式計(jì)算的ρX,Y=Cov(X,Y)σX]]>這個(gè)過(guò)程在021202板上進(jìn)行，一塊非常干凈帶有排布好的分開(kāi)的斑點(diǎn)。這個(gè)板在3個(gè)行中有測(cè)試表面A，D和H。這個(gè)板伴隨著一個(gè)測(cè)試表面拉伸功能和斑點(diǎn)尋找功能被進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。021202板上的測(cè)試表面不是所有的都帶有同樣的同源或者異源突變。為了說(shuō)明這種差異，同源測(cè)試表面上的突變/缺失野生型的斑點(diǎn)的數(shù)據(jù)斑點(diǎn)在對(duì)那個(gè)特定的斑點(diǎn)作平均的時(shí)候不被考慮。突變斑點(diǎn)從異源斑點(diǎn)中被去除。對(duì)于斑點(diǎn)5T，7T和9T，因?yàn)榻^大多數(shù)芯片表現(xiàn)出一個(gè)7T斑點(diǎn)，所以5T和9T斑點(diǎn)在它們出現(xiàn)的地方被去除，而且那些沒(méi)有表現(xiàn)出7T的斑點(diǎn)也不被考慮。斑點(diǎn)4和6沒(méi)有出現(xiàn)，而斑點(diǎn)5出現(xiàn)了。另外一方面，絕大多數(shù)的響應(yīng)被保持。去除了不恒定的斑點(diǎn)，相關(guān)性數(shù)據(jù)被計(jì)算出來(lái)，被列表在下面的表格中。


對(duì)于021202板的實(shí)驗(yàn)之間的相關(guān)系數(shù)是非常好的。最小的相關(guān)系數(shù)是實(shí)驗(yàn)4和實(shí)驗(yàn)2之間的99.907％。所有這些小的差異都在所獲得的標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的恒定性非常好。計(jì)算得到相關(guān)性表明板021202上最大的差異是位于實(shí)驗(yàn)3和2之間，位于0.8％的級(jí)別。這個(gè)差異和其他任何差異都更占包含在斑點(diǎn)平均中標(biāo)準(zhǔn)偏差。這些結(jié)果說(shuō)明板之間在數(shù)據(jù)上的任何差異都更有可能不是由于設(shè)置光燈或者由操作者進(jìn)行的手工排列造成的。只要來(lái)自用戶(hù)手冊(cè)上的好幾個(gè)操作指導(dǎo)都被執(zhí)行了，這個(gè)結(jié)論就是正確的。排布必須盡可能好地將斑點(diǎn)配合到排布網(wǎng)格的方塊中。
實(shí)例6這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是驗(yàn)證圖像分析的信的斑點(diǎn)尋找算法的有效性。斑點(diǎn)尋找算法被設(shè)計(jì)用來(lái)通過(guò)定位網(wǎng)格默認(rèn)位置之外的斑點(diǎn)來(lái)允許斑點(diǎn)定位的極大可塑性。這個(gè)功能利用在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始系統(tǒng)地未對(duì)準(zhǔn)的拐角測(cè)試表面(96井板的拐角)被檢測(cè)。被分析的板含有如實(shí)例1中被斑點(diǎn)化了CF陣列的光學(xué)薄膜測(cè)試表面。信號(hào)的解釋是用一個(gè)用來(lái)對(duì)樣品基因型分類(lèi)的軟件包裝進(jìn)行的。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，報(bào)告的分類(lèi)與輸入樣本的已知分類(lèi)相比。在集成這個(gè)新軟件算法前后的性能的恒定性之間的對(duì)比將會(huì)用來(lái)建立與原始的斑點(diǎn)尋找路徑相比的任何在功能方面的缺失。斑點(diǎn)信號(hào)和強(qiáng)度值的解釋在進(jìn)行這些比較時(shí)都將會(huì)被考慮。
這項(xiàng)研究是用上述的圖像分析系統(tǒng)和一個(gè)名稱(chēng)為EW042502的板來(lái)進(jìn)行的。板被獨(dú)立地分析了8次，每次都改變初始的排布位置。光強(qiáng)被一次設(shè)置，剩下的實(shí)驗(yàn)都用同樣的設(shè)置。初始排列網(wǎng)格在測(cè)試表面的4個(gè)拐角被系統(tǒng)地調(diào)整，同時(shí)保持圖像上測(cè)試表面的邊緣。
實(shí)驗(yàn)1-正常排列，網(wǎng)格被放置使得它可以很好地包圍陣列上的斑點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)2-網(wǎng)格被放置在四個(gè)拐角的井中斑點(diǎn)的左邊。
實(shí)驗(yàn)3-網(wǎng)格被放置在這些斑點(diǎn)的右邊。
實(shí)驗(yàn)4-網(wǎng)格被放置在這些斑點(diǎn)的上邊。
實(shí)驗(yàn)5-網(wǎng)格被放置在這些斑點(diǎn)的下邊。
實(shí)驗(yàn)6-網(wǎng)格按照對(duì)角線(xiàn)向上放置在左邊。
實(shí)驗(yàn)7-網(wǎng)格按照對(duì)角線(xiàn)從4個(gè)拐角的斑點(diǎn)向外放置。A1井在這些斑點(diǎn)的左上，A12井在這些斑點(diǎn)的右上，H1井在這些斑點(diǎn)的左下而H12井位于這些斑點(diǎn)的右下。
實(shí)驗(yàn)8-網(wǎng)格按照對(duì)角線(xiàn)從4個(gè)拐角的斑點(diǎn)向內(nèi)放置。A1井下/右，A12井下/左，H1井上/右，H12井上/左。
每個(gè)未對(duì)準(zhǔn)之后，這個(gè)板被實(shí)驗(yàn)并對(duì)基因型進(jìn)行分類(lèi)。結(jié)果得到的數(shù)據(jù)被比較以決定斑點(diǎn)尋找算法是否實(shí)際上偏移誤差的未對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整?；蛐驼偌托盘?hào)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)都被用于該比較。
在基因型分類(lèi)中產(chǎn)生好幾種差異。沒(méi)有趨勢(shì)對(duì)應(yīng)于未對(duì)準(zhǔn)的類(lèi)型。每次實(shí)驗(yàn)中不正確基因型分類(lèi)的數(shù)目的表可以在下表中發(fā)現(xiàn)

這些錯(cuò)誤調(diào)用給出一個(gè)錯(cuò)誤代碼24，除了井A4之外。代碼24表示一個(gè)井含有沒(méi)有定義邊緣的測(cè)試表面。這可能是由于邊緣位于成像區(qū)域的外面，塑料井邊的反射，芯片邊緣和拐角不是清楚的線(xiàn)的帶有陰影或者破損的芯片導(dǎo)致的。這個(gè)例外，A4井，在所有的實(shí)驗(yàn)除了實(shí)驗(yàn)3之外都被一樣地解釋。來(lái)自制造商的額外的膠水提供了一個(gè)零星發(fā)生的問(wèn)題，該問(wèn)題是與定位在載體內(nèi)部的測(cè)試表面的過(guò)程同時(shí)出現(xiàn)。
對(duì)于量化數(shù)據(jù)分析，野生型的變異系數(shù)(“CV”)值對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)都計(jì)算，同樣也對(duì)所有實(shí)驗(yàn)在一起計(jì)算。這似乎不是一個(gè)錯(cuò)配類(lèi)型到產(chǎn)生的錯(cuò)誤類(lèi)型的相關(guān)系數(shù)。例如，實(shí)驗(yàn)1(正常)排列產(chǎn)生一個(gè)錯(cuò)誤而實(shí)驗(yàn)4(網(wǎng)格位于斑點(diǎn)下方)沒(méi)有失敗。所有的錯(cuò)誤(除了井A4，實(shí)驗(yàn)3)都是屬于為“差芯片”準(zhǔn)備的24型。這些是沒(méi)有清楚定義邊緣和拐角的的測(cè)試表面。4個(gè)拐角的井如此扭曲產(chǎn)生的陰影/反射效應(yīng)在這些案例中影響了邊緣。這是一個(gè)屬于斑點(diǎn)尋找算法范圍之外的話(huà)題了。
不同結(jié)果的CV值遵循一個(gè)類(lèi)似的趨勢(shì)。所有實(shí)驗(yàn)的平均值之間的CV被展現(xiàn)在圖14中，最大的偏差達(dá)到1.2％。這個(gè)結(jié)果表明針對(duì)井位于圖像的不同位置的解釋的同等性。
圖15說(shuō)明每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的強(qiáng)度比例(背景對(duì)信號(hào))。同樣，這個(gè)數(shù)據(jù)遵循一個(gè)類(lèi)似的趨勢(shì)。最大的偏差是位于斑點(diǎn)711+1，其中對(duì)于實(shí)驗(yàn)3的比例幾乎比實(shí)驗(yàn)5要的0.2個(gè)單位。如果考慮更多數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)這個(gè)差異會(huì)更加確定。
圖16表示的是同源斑點(diǎn)的同樣的圖。這里最大的差異是實(shí)驗(yàn)3和實(shí)驗(yàn)8之間的差異，數(shù)量為0.04個(gè)單位。
上面所示的差異處于再現(xiàn)性研究所期待的差異之內(nèi)。這說(shuō)明了當(dāng)斑點(diǎn)不在期望范圍中時(shí)，該斑點(diǎn)尋找算法仍然能夠定位這些斑點(diǎn)。
在不同位置中發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)的靈活性，以及在低于理想狀況下對(duì)于上面所述的不同放大倍數(shù)的靈活性，表明了在整個(gè)過(guò)程中并入該算法是一個(gè)改進(jìn)。
在此，以引用方式將本文提到或引用過(guò)的論文、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)、以及所有其他文獻(xiàn)和電子版信息的全部?jī)?nèi)容并入本文，就像單獨(dú)地將每個(gè)文獻(xiàn)以引用方式并入本文一樣。申請(qǐng)人保留將來(lái)自任何這樣的論文、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、或者其他文獻(xiàn)信息物理地并入本申請(qǐng)中的權(quán)利。
本文已示例性地描述了本發(fā)明，但是在缺少任何一個(gè)或多個(gè)元素或限制情況下仍可能實(shí)施本發(fā)明，盡管這在本文中沒(méi)有具體公開(kāi)。因此，例如“組成”，“包括”，“含有”等術(shù)語(yǔ)應(yīng)被廣意地、沒(méi)有限制地理解。另外，本文所用的一些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)方式已經(jīng)被用作描述性的非限制性術(shù)語(yǔ)，在使用這些術(shù)語(yǔ)和表述方式的過(guò)程中，并無(wú)意排除所示和所述特征或其某些部分的任何其他等同物，而且應(yīng)該認(rèn)識(shí)到的是，各種的修改都有可能落入本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此應(yīng)該理解的是，雖然已經(jīng)通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方式和可選特征具體地公開(kāi)了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)Ρ疚乃_(kāi)的發(fā)明進(jìn)行修改和變化，而這樣的修改和變化應(yīng)被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本文已經(jīng)廣泛地、一般性地描述了本發(fā)明。任何落入該一般性公開(kāi)范圍之內(nèi)的較窄具體形式和下位集合也是本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般性描述具有從類(lèi)別概念中去除任何主題內(nèi)容的條件性或否定性限制，而無(wú)論所排除的內(nèi)容在本文中是否有明確記載。
其他實(shí)施方式落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。另外，在以馬庫(kù)什組合的形式來(lái)描述本發(fā)明特征或方面的地方，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，本發(fā)明也由此以馬庫(kù)什組合中的任何單獨(dú)成員或者成員子集的形式被描述。
權(quán)利要求
1.一種識(shí)別測(cè)試表面上陣列位置的方法，其包括a)獲取所述測(cè)試表面的電子圖像；b)對(duì)所述圖像進(jìn)行正方形化，從而使像素的各個(gè)列和行分別被定向成一種基本垂直和水平的方式；c)對(duì)所述圖像上所述列和行的網(wǎng)格進(jìn)行定位；并d)利用一個(gè)信號(hào)強(qiáng)度閾值對(duì)所述圖像進(jìn)行二進(jìn)制化，從而識(shí)別所述網(wǎng)格上的斑點(diǎn)位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述進(jìn)行正方形化的步驟包括檢測(cè)所述圖像的邊緣；并旋轉(zhuǎn)所述圖像。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述檢測(cè)邊緣的步驟包括為所述圖像中的一組像素列形成像素和的第一向量；為所述圖像中的一組像素行形成像素和的第二向量；生成所述第一和第二向量的一階導(dǎo)數(shù)的平方；并檢測(cè)所述一階導(dǎo)數(shù)的平方的峰值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述定位網(wǎng)格的步驟包括檢測(cè)對(duì)應(yīng)于所述網(wǎng)格的行和列的信號(hào)峰值的一個(gè)網(wǎng)格。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述檢測(cè)信號(hào)峰值的一個(gè)網(wǎng)格的步驟包括生成像素和倒數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)；并定位所述二階導(dǎo)數(shù)的最小值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述二進(jìn)制化步驟采用一種自適應(yīng)閾值。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述自適應(yīng)閾值是一種平均自適應(yīng)閾值。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述自適應(yīng)閾值是一種中值自適應(yīng)閾值。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括e)使所述網(wǎng)格與一個(gè)默認(rèn)網(wǎng)格相關(guān)，所述網(wǎng)格對(duì)應(yīng)于所述陣列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述相關(guān)包括f)使步驟e)中定位的每個(gè)所述斑點(diǎn)的中心與所述默認(rèn)網(wǎng)格中的一個(gè)斑點(diǎn)相關(guān)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟f)包括確定所述默認(rèn)網(wǎng)格中所述斑點(diǎn)處的一個(gè)信號(hào)是否對(duì)應(yīng)于步驟d)中定位的所述斑點(diǎn)中一個(gè)斑點(diǎn)的所述中心；并且當(dāng)所述確定的結(jié)果為否時(shí)，使所述斑點(diǎn)相對(duì)于所述默認(rèn)網(wǎng)格回到中心。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括d)對(duì)步驟d)中定位的所述斑點(diǎn)進(jìn)行霍夫變換，從而為所述陣列估計(jì)所述斑點(diǎn)與一個(gè)期望斑點(diǎn)的相關(guān)性。
13.一種識(shí)別測(cè)試表面上陣列位置的方法，其包括a)在兩個(gè)基本垂直的方向上為一個(gè)圖像生成梯度；b)生成對(duì)應(yīng)所述生成梯度的平方梯度大??；c)利用所述平方梯度大小的閾值對(duì)所述梯度大小進(jìn)行二進(jìn)制化；d)基于所述梯度生成一個(gè)變換圖像；e)利用為步驟d)的變換計(jì)數(shù)得到的最大票數(shù)的閾值，將所述圖像二進(jìn)制化，從而產(chǎn)生一個(gè)閾值化變換圖像；f)在所述閾值化變換圖像中檢測(cè)連續(xù)的像素組；g)構(gòu)建對(duì)應(yīng)于所述陣列一個(gè)布局的網(wǎng)格；h)測(cè)量所述網(wǎng)格的各個(gè)斑點(diǎn)位置的信號(hào)強(qiáng)度；并i)生成一個(gè)斑點(diǎn)位置和強(qiáng)度表格，所述斑點(diǎn)位置表明了斑點(diǎn)中心。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟a)之前檢測(cè)所述測(cè)試表面的邊緣；并將所述圖像裁剪至所述邊緣。
15.一種程序產(chǎn)品，其包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的機(jī)器可讀程序代碼a)對(duì)所述測(cè)試表面進(jìn)行正方形化處理，從而使像素的各個(gè)列和行分別被定向成一種基本垂直和水平的方式；b)定位所述圖像的所述列和行的一個(gè)網(wǎng)格；并c)利用一個(gè)信號(hào)強(qiáng)度閾值對(duì)所述圖像進(jìn)行二進(jìn)制化，從而識(shí)別所述網(wǎng)格上的斑點(diǎn)位置。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的程序產(chǎn)品，其中所述正方形化的步驟包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的程序代碼檢測(cè)所述圖像的邊緣；并旋轉(zhuǎn)所述圖像。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的程序產(chǎn)品，其中所述檢測(cè)邊緣步驟包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的程序代碼為所述圖像中的一組像素列形成像素和的第一向量；為所述圖像中的一組像素行形成像素和的第二向量；生成所述第一和第二向量的一階導(dǎo)數(shù)的平方；并檢測(cè)所述一階導(dǎo)數(shù)的平方的峰值。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的程序產(chǎn)品，其中所述定位網(wǎng)格的步驟包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的程序代碼檢測(cè)對(duì)應(yīng)于所述網(wǎng)格的行和列的信號(hào)峰值的一個(gè)網(wǎng)格。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的程序產(chǎn)品，其中所述檢測(cè)信號(hào)峰值的一個(gè)網(wǎng)格的步驟包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的程序代碼生成像素和倒數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)；并定位所述二階導(dǎo)數(shù)的最小值。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的程序產(chǎn)品，其中所述二進(jìn)制化步驟采用一種自適應(yīng)閾值。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的程序產(chǎn)品，其中所述自適應(yīng)閾值是一種平均自適應(yīng)閾值。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的程序產(chǎn)品，其中所述自適應(yīng)閾值是一種中值自適應(yīng)閾值。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的程序產(chǎn)品，其中所述程序代碼使機(jī)器進(jìn)一步執(zhí)行下列方法步驟d)使所述網(wǎng)格與一個(gè)默認(rèn)網(wǎng)格作相關(guān)，所述網(wǎng)格對(duì)應(yīng)于所述陣列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述所述的程序產(chǎn)品，其中所述相關(guān)包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的程序代碼e)使步驟c)中定位的每個(gè)所述斑點(diǎn)的中心與所述默認(rèn)網(wǎng)格中的一個(gè)斑點(diǎn)相關(guān)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的程序產(chǎn)品，其中步驟e)包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的程序代碼確定所述默認(rèn)網(wǎng)格中所述斑點(diǎn)處的一個(gè)信號(hào)是否對(duì)應(yīng)于步驟c)中定位的所述斑點(diǎn)中一個(gè)斑點(diǎn)的所述中心；并且當(dāng)所述確定的結(jié)果為否時(shí)，使所述斑點(diǎn)相對(duì)于所述默認(rèn)網(wǎng)格回到中心位置。
26.根據(jù)權(quán)利要求15所述的程序產(chǎn)品，其中所述程序代碼使機(jī)器進(jìn)一步執(zhí)行下列方法步驟d)對(duì)步驟c)中定位的所述斑點(diǎn)進(jìn)行霍夫變換，從而為所述陣列估計(jì)所述斑點(diǎn)與一個(gè)期望斑點(diǎn)的相關(guān)性。
27.一種程序產(chǎn)品，其包括使機(jī)器執(zhí)行下列方法步驟的機(jī)器可讀程序代碼a)在兩個(gè)基本垂直的方向上為一個(gè)圖像生成梯度；b)生成對(duì)應(yīng)所述生成梯度的平方梯度大??；c)利用所述平方梯度大小的閾值對(duì)所述梯度大小進(jìn)行二進(jìn)制化；d)基于所述梯度生成一個(gè)變換圖像；e)利用為步驟d)的變換計(jì)數(shù)得到的最大票數(shù)的閾值將所述圖像二進(jìn)制化，從而產(chǎn)生一個(gè)閾值化變換圖像；f)在所述閾值化變換圖像中檢測(cè)連續(xù)的像素組；g)構(gòu)建對(duì)應(yīng)于所述陣列一個(gè)布局的網(wǎng)格；h)測(cè)量所述網(wǎng)格的各個(gè)斑點(diǎn)位置的信號(hào)強(qiáng)度；并i)生成一個(gè)斑點(diǎn)位置和強(qiáng)度表格，所述斑點(diǎn)位置表明了斑點(diǎn)中心。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的程序產(chǎn)品，其中所述程序代碼使機(jī)器進(jìn)一步執(zhí)行下列方法步驟在步驟a)之前檢測(cè)所述測(cè)試表面的邊緣；并將所述圖像裁剪至所述邊緣。
29.一種測(cè)試表面載體，其包括多個(gè)凹穴，其中每個(gè)凹穴被配置成容納一個(gè)離散陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面，并在所述測(cè)試表面之上提供一個(gè)體積以在所述凹穴內(nèi)容納液體，并且其深度被配置成去除圖像分析過(guò)程中的干擾；以及位于每個(gè)所述凹穴內(nèi)的陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面，所述陣列化光學(xué)薄膜測(cè)試表面包括多個(gè)離散測(cè)試位置，所述離散測(cè)試位置包括一個(gè)捕捉試劑檢測(cè)位置以及一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)位置。
30.一種測(cè)試表面載體，其包括一個(gè)用于圖像分析應(yīng)用的無(wú)光澤表面，其中所述無(wú)光澤表面減少來(lái)自所述測(cè)試表面載體的偽反射。
31.一種測(cè)試表面載體，其包括多個(gè)凹穴，用以接收多個(gè)測(cè)試表面；以及在每個(gè)凹穴處的一個(gè)或多個(gè)圖案化識(shí)別目標(biāo)，其中所述圖案化識(shí)別目標(biāo)改進(jìn)了每個(gè)凹穴內(nèi)一個(gè)或多個(gè)測(cè)試表面的放置。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的測(cè)試表面載體，其中所述圖案化識(shí)別目標(biāo)用于在一個(gè)自動(dòng)化生產(chǎn)過(guò)程中放置所述測(cè)試表面。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的測(cè)試表面載體，其中所述圖案化識(shí)別目標(biāo)是光滑的。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的測(cè)試表面載體，其中所述圖案化識(shí)別目標(biāo)是一個(gè)幾何形狀。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的測(cè)試表面載體，其中所述幾何形狀是一個(gè)圓。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的測(cè)試表面載體，其中所述圖案化識(shí)別目標(biāo)被用于圖像分析過(guò)程，以識(shí)別、定位、確認(rèn)距離、以及對(duì)準(zhǔn)所述凹穴。
37.一種測(cè)試表面載體，其包括多個(gè)凹穴，用以接收多個(gè)測(cè)試表面的；以及所述凹穴內(nèi)的對(duì)準(zhǔn)肋條，其中所述對(duì)準(zhǔn)肋條用于支撐所述測(cè)試表面；其中所述對(duì)準(zhǔn)肋條在所述測(cè)試表面載體的生產(chǎn)過(guò)程中控制所述測(cè)試表面在所述凹穴內(nèi)的定向或偏斜。
38.一種測(cè)試表面載體，其包括多個(gè)凹穴，用以接收多個(gè)測(cè)試表面；以及所述凹穴內(nèi)的擴(kuò)展窗框特征，其中所述擴(kuò)展窗框用于支撐所述測(cè)試表面；其中所述擴(kuò)展窗框造成一個(gè)凹坑以容納膠水，其中在所述測(cè)試表面載體的生產(chǎn)過(guò)程中，所述膠水的液面是通過(guò)相對(duì)于所述凹穴中所述擴(kuò)展窗的機(jī)器視覺(jué)處理來(lái)控制的。
全文摘要
一種用于分析光學(xué)薄膜陣列的圖像分析工作站。各個(gè)獨(dú)立陣列包括單個(gè)光學(xué)薄膜測(cè)試表面，該光學(xué)薄膜測(cè)試表面提供了多個(gè)離散尋址位置，每個(gè)位置又包括一個(gè)針對(duì)感興趣分析物的固定化捕捉試劑。一個(gè)或多個(gè)離散尋址位置可以提供控制信號(hào)或基準(zhǔn)信號(hào)。
文檔編號(hào)G06K9/46GK1774721SQ200480010302
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月16日
發(fā)明者L·瑞, D·D·克拉克, R·杰森, D·莫爾 申請(qǐng)人:熱生物之星公司