本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，是一種抗炎的針對Kdm6a的RNA干擾藥物。本發(fā)明提供一組針對Kdm6a的表達(dá)及功能的干擾RNA的核苷酸序列，具有靶向Kdm6a基因表達(dá)及抗炎功能。本發(fā)明還公開了將該RNA干擾藥物用于抵抗感染、治療因感染導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病的策略。

背景技術(shù)：

Kdm6a(賴氨酸特異性去甲基化酶6a，Lysine-specific deMethylase 6a，Kdm6a)又名UTX，可以特異性去除H3K27me2/3的甲基基團(tuán)，發(fā)揮H3K27去甲基化酶活性(Lee,MG.等,Science 318,447-450(2007))。該分子擁有高度保守的同源的C末端結(jié)構(gòu)域即JMJC結(jié)構(gòu)域，也是其酶活性結(jié)構(gòu)域，主要發(fā)揮組蛋白去甲基化活性。該分子的N末端包含了6個重復(fù)序列的TPR結(jié)構(gòu)域，主要發(fā)揮蛋白蛋白相互作用的功能。Kdm6a基因定位于X染色體，但是卻不受X染色體失活的影響，在細(xì)胞和機體內(nèi)廣泛表達(dá)(Agger,K.等,Nature 449,731-734(2007))。

Kdm6a是H3K4甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體MLL2的組成部分，可以通過調(diào)控HOX基因來控制機體的狀態(tài)(Cho,Y.W.等,J Biol Chem 282,20395-20406(2007)；Issaeva,I.等,Mol Cell Biol 27,1889-1903(2007))。在多能細(xì)胞中，HOX基因大多保持沉默，并且以連續(xù)的高水平的H3K27me3為標(biāo)志。隨著機體的分化發(fā)育，Kdm6a被招募到HOX基因的啟動子區(qū)，并且與MLL一起改變該基因啟動子區(qū)的組蛋白修飾狀態(tài)，使其H3K27甲基化水平降低，而H3K4甲基化水平增加，促進(jìn)基因的表達(dá)(Agger,K.等,Nature 449,731-734(2007))。Kdm6a基因敲除的實驗研究揭示了Kdm6a在多種生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。例如造血系統(tǒng)的生成和心血管的發(fā)育(Lee,S.等,Developmental cell 22,25-37(2012)；Seenundun,S.等,EMBO J 29,1401-1411(2010)；Shpargel,K.B.等,PLoS Genet 8,e1002964(2012)；Thieme,S.等,Blood 121,2462-2473(2013)；Wang,A.H.等,EMBO J 32,1075-1086(2013)；Wang,C.等,Proc Natl Acad Sci U S A109,15324-15329(2012)；Welstead,G.G.等,Proc Natl Acad Sci U S A 109,13004-13009(2012))。即在胚胎干細(xì)胞的分化發(fā)育過程中，Kdm6a對于外胚層和中胚層的分化是必需的(Morales Torres,C.等,PloS one 8,e60020(2013))。在小鼠造血祖細(xì)胞系EML中特異性敲除Kdm6a可以影響集落形成的能力，在原代小鼠骨髓細(xì)胞中特異性敲除Kdm6a可以通過調(diào)控關(guān)鍵基因MLL1、RUNX1和SCL的啟動子區(qū)的H3K27me3水平而影響這些基因的表達(dá)，在白血病細(xì)胞系中特異性敲除Kdm6a可以影響細(xì)胞的增殖(Liu,J.等,Exp Hematol 40,487-498 e483(2012))。在心肌分化條件下，敲除了Kdm6a的胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞不能誘發(fā)心臟節(jié)律性收縮，并且Kdm6a缺陷的小鼠可以發(fā)生嚴(yán)重的心臟缺陷和胚胎致死(Lee,S.等,Developmental cell 22,25-37(2012))。同時，也有實驗小組開展了Kdm6a的過表達(dá)研究，一系列的研究報道Kdm6a可以作為一些特異性疾病的潛在治療靶點。2009年，由于Kdm6a的H3K27me2/3去甲基化功能，Kdm6a被作為抑癌基因在多種腫瘤中發(fā)揮作用，例如多發(fā)性骨髓瘤、食道癌和腎癌(Van Haaften,G.等,Nat Genet 41,521-523(2009))。除此之外，Kdm6a和jmjd3在正常和惡性化的T細(xì)胞中通過與包含BRG1的SWI/SNF染色體重塑復(fù)合物相互作用發(fā)揮組蛋白去甲基化非依賴的功能(Miller,S.A.等,Mol Cell 40,594-605(2010))。2012年，人們發(fā)現(xiàn)Kdm6a特定位點的功能缺失體可以導(dǎo)致遺傳性疾病Kabuki綜合征的發(fā)生(Miyake,N.等,Hum Mutat 34,108-110(2013))。

Kdm6a作為重要的表觀修飾酶可以特異性去除H3K27me2/3的甲基化，在個體的分化、發(fā)育以及腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，然而在免疫系統(tǒng)中的功能受到的關(guān)注非常少。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是新近發(fā)展起來的一種封閉基因表達(dá)的有效方法。它采用與目的基因同源的21-23核苷酸長的干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)切酶形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)，RISC以siRNA為模板特異的識別其同源基因mRNA并對其進(jìn)行遞進(jìn)式進(jìn)行剪切，形成強有效的瀑布效應(yīng)，誘導(dǎo)序列特異性的mRNA降解，細(xì)胞表現(xiàn)特定基因的缺陷表型。該策略可以將癌癥基因關(guān)閉，而僅有一個堿基突變則喪失RNA干擾作用，對正常細(xì)胞影響甚微，特異性強。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗炎的RNA干擾藥物，采用RNAi技術(shù)，在mRNA水平針對Kdm6a基因，對表達(dá)Kdm6a的細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行干預(yù)，能有效抑制Kdm6a的表達(dá)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的第一方面，提供一種抑制Kdm6a基因表達(dá)的siRNA，所述的siRNA選自si-Kdm6a1、si-Kdm6a2或si-Kdm6a3中的一種；

所述的si-Kdm6a1包括正義鏈SEQ ID NO.1和反義鏈SEQ ID NO.2；

所述的si-Kdm6a2包括正義鏈SEQ ID NO.3和反義鏈SEQ ID NO.4；

所述的si-Kdm6a3包括正義鏈SEQ ID NO.5和反義鏈SEQ ID NO.6。

其堿基序列和作用部位分別如下：

si-Kdm6a1：

SEQ ID No.1：5’-GCAUUUCAGUGGGCUAUUA-3’(+778-+796位)

SEQ ID No.2：3’-CGUAAAGUCACCCGAUAAU-5’

si-Kdm6a2：

SEQ ID No.3：5’-GCAGAUACAUGGUGUUCAA-3’(+1297-+1315位)

SEQ ID No.4：3’-CGUCUAUGUACCACAAGUU-5’

si-Kdm6a3：

SEQ ID No.5：5’-GCACCCACUCUACCUCAUA-3’(+2179-+2197位)

SEQ ID No.6：3’-CGUGGGUGAGAUGGAGUAU-5’。

所述的siRNA序列可以通過直接的化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、質(zhì)粒擴(kuò)增、病毒復(fù)制等方式獲得，因此本發(fā)明應(yīng)包括包含所述序列的前述應(yīng)用形式。

所述的siRNA序列可以采用合成的方式形成3’端含有2-4個dT或含有2-6個U的延伸結(jié)構(gòu)的小雙鏈RNA。

本發(fā)明所選用的siRNA序列是針對Kdm6a及其表達(dá)蛋白進(jìn)行靶點治療，具有靶向Kdm6a基因表達(dá)及抗炎功能，是針對Kdm6a基因mRNA不同位點選取的3段siRNA序列，稱之為si-Kdm6a1、si-Kdm6a2和si-Kdm6a3。另設(shè)無關(guān)對照序列作為陰性對照(正義鏈SEQ ID No.7、反義鏈SEQ ID No.8)。

本發(fā)明所用的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞是陽性表達(dá)Kdm6a的原代細(xì)胞。細(xì)胞接種于含10％的小牛血清的RPMI1640(Invitrogen公司)培養(yǎng)液，置于37攝氏度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12-24小時。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，分別為si-Kdm6a1(正義鏈SEQ ID No.1、反義鏈SEQ ID No.2)、si-Kdm6a2(正義鏈SEQ ID No.3、反義鏈SEQ ID No.4)、si-Kdm6a3(正義鏈SEQ ID No.5、反義鏈SEQ ID No.6)和無關(guān)陰性對照(正義鏈SEQ ID No.7、反義鏈SEQ IDNo.8)以20nM的終濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)液，于孵育后24～48小時收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測。

本發(fā)明從mRNA和蛋白質(zhì)水平二個層次來檢測si-Kdm6a1、si-Kdm6a2和si-Kdm6a3抑制Kdm6a基因表達(dá)。mRNA的檢測采用RT-PCR和Q-PCR定量分析。技術(shù)路線：1)RT-PCR：按TRIzol總RNA提抽試劑盒提取總RNA。電泳鑒定RNA的質(zhì)量，紫外光分光光度計定量。取總RNA1ug,加入20ul逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自于TOYOBO公司)，按說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Q-PCR反應(yīng)體系按常規(guī)(試劑購自TOYOBO公司)。循環(huán)條件：95℃變性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸20秒，最后延伸10分鐘。另以β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)參對照。Kdm6a蛋白表達(dá)水平的檢測采用Western blot技術(shù)檢測Kdm6a的表達(dá)。收集48h的各組細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液，用Kdm6a多抗進(jìn)行Western blot檢測。也可以采用免疫熒光標(biāo)記和免疫組織化學(xué)技術(shù)等方法檢測Kdm6a蛋白水平的表達(dá)

RNA干擾技術(shù)是目前高特異性的有效技術(shù)，因此無論是在功能基因組研究，還是基因治療方面均具有廣闊地應(yīng)用前景。本發(fā)明根據(jù)Cenix等的siRNA user guide設(shè)計原則，針對Kdm6a基因不同靶位點設(shè)計了3條siRNA序列，用以抑制Kdm6a的表達(dá)。本發(fā)明證實Kdm6a的siRNA可望成為治療炎性疾病的有效手段。本發(fā)明的siRNA可以單獨使用或幾條siRNA聯(lián)合，還可以與其它藥物和治療手段聯(lián)合，用于炎性疾病的治療。

上述siRNA序列的給藥途徑可采用：直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法以及復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法中的一種，其中：

1、直接裸DNA注射法

(1)新噴氣注射系統(tǒng)釋放裸DNA治療序列，可以采用一種新的噴氣注射系統(tǒng)，將裸DNA釋放到體內(nèi)的炎性部位中。沃爾瑟(W.Walter)博士和同事開發(fā)了一種便攜的“高速噴氣注射器”系統(tǒng)，在病毒媒介和脂質(zhì)體基因釋放系統(tǒng)之外提供了又一選擇。

(2)裸DNA直接注射：將裸質(zhì)粒DNA直接注射到機體的肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜、靜脈內(nèi)。這種方法簡單易行。

2、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法：包裹DNA的脂質(zhì)體能與組織細(xì)胞發(fā)生膜融合，而將DNA攝入，減少了核酸酶對DNA的破壞。注射途徑同裸DNA直接注射。

3、金包被DNA基因槍轟擊法：將質(zhì)粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入組織細(xì)胞。

4、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法：選擇一種容易進(jìn)入某組織器官的細(xì)菌，將其繁殖基因去掉，然后用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)為細(xì)菌，當(dāng)這些細(xì)菌進(jìn)入某組織器官后，由于不能繁殖，則自身裂解而釋放質(zhì)粒DNA。即:可口服的減毒沙門氏菌。

5、復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法：選擇一種容易進(jìn)入某組織器官的復(fù)制缺陷型腺病毒，攜帶目的RNA干擾序列，可以通過肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜、靜脈內(nèi)等途徑在宿主體內(nèi)表達(dá)目的RNA干擾序列。

本發(fā)明的第二方面，提供上述抑制Kdm6a基因表達(dá)的siRNA在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三方面，提供上述抑制Kdm6a基因表達(dá)的siRNA在制備抵抗感染或治療因感染導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四方面，提供一種針對Kdm6a的RNA干擾藥物，所述的RNA干擾藥物包括上述的si-Kdm6a1、si-Kdm6a2或si-Kdm6a3中的任意一種或兩種以上的組合。

優(yōu)選的，所述的RNA干擾藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，所述的藥學(xué)上可接受的載體為藥學(xué)上可接受的賦形劑，懸浮劑，填充劑和/或稀釋劑。

本發(fā)明的第五方面，提供上述的針對Kdm6a的RNA干擾藥物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六方面，提供上述的針對Kdm6a的RNA干擾藥物在制備抵抗感染或治療因感染導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

本發(fā)明采用RNAi技術(shù)，在mRNA水平針對Kdm6a基因的siRNA對陽性表達(dá)Kdm6a的細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，實驗證明抑制Kdm6a的表達(dá)可以降低炎癥因子的水平，本發(fā)明研制的siRNA能有效抑制Kdm6a的表達(dá)，為RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗炎治療提供了實驗證據(jù)和有效新藥。

附圖說明

圖1：Kdm6a siRNA干擾Kdm6a表達(dá)后Kdm6a在mRNA水平表達(dá)的分析。

圖2：干擾Kdm6a表達(dá)對巨噬細(xì)胞IL-6產(chǎn)生的抑制作用。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細(xì)說明。以下列舉部分實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明。

實施例1：Kdm6a siRNA干擾Kdm6a表達(dá)后Kdm6a在mRNA水平表達(dá)的分析

腹腔注射3％的脫水硫羥乙酸培養(yǎng)基2ml，4天后，頸椎脫臼法處死小鼠，75％酒精浸泡5-10分鐘，小鼠腹部朝上，在腹中線剪開一小口，撕開皮膚，完全暴露腹膜。然后用20ml注射器注入10ml無血清1640培養(yǎng)基，針尖于腹膜下至腹腔則邊，且針尖朝上，避開腸子和脂肪，緩慢抽吸，此時，腹腔灌洗液即含有大量巨噬細(xì)胞。將收集的腹腔液放于50ml的離心管。重復(fù)此步驟一次，共20ml。細(xì)胞懸液800g離心5分鐘，棄上清，用含有10％FCS的DMEM重懸。細(xì)胞懸液置入培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)1小時后換液，貼壁細(xì)胞即為新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

分別將si-Kdm6a1(正義鏈SEQ ID No.1、反義鏈SEQ ID No.2)、si-Kdm6a2(正義鏈SEQ ID No.3、反義鏈SEQ ID No.4)和si-Kdm6a3(正義鏈SEQ ID No.5、反義鏈SEQ ID No.6)以轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin(Invitrogen公司)瞬時轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞，48h收取細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR分析。同時設(shè)無關(guān)陰性對照si-Control(正義鏈SEQ ID No.7、反義鏈SEQ ID No.8)。

SEQ ID No.7：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’

SEQ ID No.8：3’-AAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’

所有SiRNA序列均由上海吉凱生物工程公司合成。

所用的Kdm6a引物(由上海生工生物工程公司合成)為：

5’-AAGGCTGTTCGCTGCTACG-3’(SEQ ID No.9)和

5’-GGATCGACATAAAGCACCTCC-3’(SEQ ID No.10)。

β-actin引物為：

5’-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3’(SEQ ID No.11)和

5’-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3’(SEQ ID No.12)。

結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)siRNA處理48h后檢測，與陰性對照組相比，si-Kdm6a1、si-Kdm6a2和si-Kdm6a3組的Kdm6a mRNA表達(dá)明顯下降，表明si-Kdm6a1、si-Kdm6a2和si-Kdm6a3轉(zhuǎn)染成功阻抑了Kdm6a的表達(dá)，而的陰性對照siRNA寡核苷酸si-Control對Kdm6a的表達(dá)沒有影響(圖1)。

實施例2：干擾Kdm6a表達(dá)對巨噬細(xì)胞IL-6產(chǎn)生的抑制作用

分別將si-Kdm6a1(正義鏈SEQ ID No.1、反義鏈SEQ ID No.2)、si-Kdm6a2(正義鏈SEQ ID No.3、反義鏈SEQ ID No.4)和si-Kdm6a3(正義鏈SEQ ID No.5、反義鏈SEQ ID No.6)以轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin(Invitrogen公司)瞬時轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞，48h收取細(xì)胞，以100ng/ml LPS(又稱脂多糖，為TLR4的配體，購自Sigma公司)處理不同時間后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，制備cDNA用于定量RT-PCR檢測IL-6mRNA水平；或者用培養(yǎng)上清通過ELISA(所用試劑盒購自R&D公司)檢測IL-6蛋白水平。

IL-6mRNA的定量RT-PCR分析和ELISA分析的結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示：干擾Kdm6a在小鼠巨噬細(xì)胞的表達(dá)對IL-6產(chǎn)生起抑制作用。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)

<120> 抑制Kdm6a基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用

<130> /

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcauuucagu gggcuauua 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

cguaaaguca cccgauaau 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcagauacau gguguucaa 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgucuaugua ccacaaguu 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcacccacuc uaccucaua 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgugggugag auggaguau 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagaggcuug cacagugca 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaggctgttc gctgctacg 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggatcgacat aaagcacctc c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agtgtgacgt tgacatccgt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcagctcagt aacagtccgc 20