本發(fā)明涉及分子生物學與生物醫(yī)藥技術領域，具體為一種特異性抑制eya2基因表達的sirna及其重組載體和應用。

背景技術：

rna干擾(rnainterference,rnai)是動植物中廣泛存在的序列特異性轉錄后基因沉默機制。1998年美國科學家andrewfire在秀麗新小桿線蟲c.elegans體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)將正義鏈和反義鏈的混合物(即dsrna)所產(chǎn)生的基因沉默效應至少10倍于反義核苷酸的抑制作用，而且能在子代中誘導出同樣的基因抑制現(xiàn)象。對rnai現(xiàn)象的機理研究表明，微量sirna即能通過轉錄后基因沉默使大量靶rna沉默，而這種高效、特異降解同源rna從而導致序列特異性基因沉默的關鍵性分子是長為21-23堿基的小雙鏈寡核苷酸，也稱作小干擾rna(sirna)。進一步研究發(fā)現(xiàn)短于21bp或者長于25bp的雙鏈rna均不能有效啟動rnai，而且其中只要有一個堿基錯配，基因沉默的效應就明顯減退甚至消失，充分體現(xiàn)了sirna作用的特異性。

顯示出強大基因沉默效能的sirna作為近年來生物技術的重大發(fā)現(xiàn)而備受矚目，正是因為它具有特異性和高效性阻斷同源基因的基因抑制功能，是基因功能研究強有力的工具。sirna具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢和特點。目前雖然已有一些抑制特定基因表達的方法，如反義rna、基因敲除(knockout)等，但sirna顯示出了明顯優(yōu)于這些技術的優(yōu)勢：與反義rna相比，它具有更高的特異性和持續(xù)性；與復雜耗時的基因敲除相比，sirna是更簡便有效的手段。目前利用sirna作為基因沉默的方法被廣泛用于惡性腫瘤機制的研究，研究的關鍵點主要集中在如何提高基因沉默效能，包括靶基因位點選擇、導入系統(tǒng)的優(yōu)化和對宿主細胞功能的影響等，并由此推動了以該技術為基礎的腫瘤特異高效靶向治療策略的研發(fā)進程。

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其病死率居各類婦科腫瘤的首位。卵巢癌治療最大的障礙是腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生,特別是出現(xiàn)多藥耐藥。隨著鉑類/泰素藥物聯(lián)合化療的實施，卵巢癌的初次化療反應率可達80％。但大多數(shù)患者在2～3年內(nèi)復發(fā)。對復發(fā)后卵巢癌，即使再采用作用機制完全不同的化療藥物，也產(chǎn)生耐藥，從而使腫瘤治療后生存率得不到顯著的提高。晚期卵巢癌的五年生存率始終徘徊在20～30％。高復發(fā)率和復發(fā)后的高耐藥率是卵巢癌高死亡率最主要的原因之一，尋找卵巢癌化療耐藥的解決方案是目前腫瘤研究的重要課題。

分子靶向藥物和化療聯(lián)合應用是目前提高惡性腫瘤患者生存率最有前景的治療方法。eya2(eyatranscriptionalcoactivatorandphosphatase2)是eya家族成員之一，是一種重要的轉錄調(diào)控因子。eya最早作為能控制果蠅眼發(fā)育的基因被發(fā)現(xiàn)，在脊椎動物和無脊椎動物中，eya基因編碼的核轉錄因子能促進眼部發(fā)育，是構成視網(wǎng)膜決定基因網(wǎng)絡的重要成員。之后的研究顯示，eya2普遍存在于各種生物體中，在進化上高度保守，它參與了胚胎發(fā)育過程中的細胞周期調(diào)控、組織分化和器官發(fā)育等重要生理過程，eya2基因發(fā)生突變將導致多種器官發(fā)育異常。近年來，陸續(xù)有一些研究在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、尿道癌、宮頸癌中組織中都檢測到eya2的表達增高，雖然到目前為止eya2在腫瘤發(fā)生中的具體功能及其作用機制和尚不清楚，但eya2參與了腫瘤的發(fā)展進程已經(jīng)被逐步認識。

我們先期的研究表明eya2在卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中有異常升高的現(xiàn)象，但該基因是否與卵巢癌發(fā)病和卵巢癌耐藥有關還有待進一步研究。因此，采用rnai技術對卵巢癌耐藥細胞株中eya2基因表達進行干擾，將是對卵巢癌發(fā)病機制的重要補充，是對卵巢癌及其耐藥治療的重要探索和應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性抑制eya2基因表達的sirna，用于卵巢癌發(fā)病機制研究。本發(fā)明的另一個目的在于提供該sirna在制備治療卵巢癌和逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明設計、合成3對特異性抑制eya2基因表達的sirna，轉染到卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中，結果發(fā)現(xiàn)s1抑制eya2基因表達的干擾效果最明顯。

本發(fā)明提供了一種特異性抑制eya2基因表達的sirna(s1)，包括正義鏈和反義鏈，

所述正義鏈：5’-uaguucuaccauuuccuugua-3’(seqidno.1)；

所述反義鏈：5’-caaggaaaugguagaacuagu-3’(seqidno.2)。

作為優(yōu)選，所述正義鏈和反義鏈的5’和3’端的3個堿基進行2’-甲氧基修飾。本發(fā)明研究證明，2’-甲氧基修飾后的sirna(s1)穩(wěn)定性增加，能提高其在體內(nèi)抵抗核糖酶的水解的能力，降低免疫刺激反應，延長sirna干擾基因表達下調(diào)的作用時間，使其作用具有高效性、特異性。

本發(fā)明提供了一種包含編碼所述sirna的dna序列的rna干擾試劑盒。所述試劑盒中包含克隆了編碼所述sirna的dna序列的質(zhì)粒載體，應用時，該質(zhì)粒載體在真核細胞中轉錄表達所需的sirna，從而達到沉默eya2基因表達的目的。

本發(fā)明提供了一種含有編碼所述sirna的dna序列的重組載體。作為優(yōu)選，采用的原始載體為慢病毒載體plko.1puro。

本發(fā)明還提供了重組載體的構建方法，包括：

(1)合成eya2-s1片段，選擇agei和ecori兩個酶切位點，根據(jù)s1的序列，設計其shrna序列，序列如下：

正義鏈：

5’-ccggactagttctaccatttccttgtattcaagagatacaaggaaatggtagaactagtttttttggtacc-3’(seqidno.7)；

反義鏈：

5’-aattggtaccaaaaaaactagttctaccatttccttgtatctcttgaatacaaggaaatggtagaactagt-3’(seqidno.8)；

(2)退火得到eya2-s1的dna片段；

(3)用慢病毒載體plko.1puro構建plko.1-eya2-sh1重組載體。

本發(fā)明提供的sirna能夠高效特異性抑制卵巢癌細胞eya2基因的表達，減少細胞增殖，增加細胞凋亡，降低細胞遷移和侵襲能力，因此，所述sirna和重組載體作為eya2基因表達抑制劑可以應用于腫瘤疾病發(fā)病機制的研究當中。

本發(fā)明提供了所述sirna和重組載體在制備eya2基因表達抑制劑中的應用。

本發(fā)明提供了所述sirna和重組載體在制備治療卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、尿道癌或?qū)m頸癌藥物中的應用。

本發(fā)明研究表明，紫杉醇耐藥株a2780/taxol轉染所述sirna后，該細胞株對紫杉醇的敏感性明顯提高，逆轉指數(shù)為6.67，說明本發(fā)明提供的sirna對紫杉醇耐藥株a2780/taxol的耐藥具有非常顯著的逆轉效果，因此，所述sirna對逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的治療具有潛在應用價值。

本發(fā)明提供了所述的sirna和重組載體在制備逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應用。

本發(fā)明具備的有益效果：

本發(fā)明提供的sirna能夠特異性、高效地抑制eya2基因的mrna和蛋白表達，減少腫瘤細胞增殖，增加腫瘤細胞凋亡，降低腫瘤細胞遷移和侵襲能力，并能有效逆轉卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥，將其應用于腫瘤發(fā)病機制研究以及制備腫瘤治療及逆轉卵巢癌耐藥治療的藥物中，具有重要意義。

附圖說明

圖1為qrt-pcr檢測a2780細胞和a2780/taxol細胞eya2mrna表達。

圖2為westernblotting檢測a2780細胞和a2780/taxol細胞eya2蛋白表達。

圖3為qrt-pcr檢測s1，s2，s3轉染48h后a2780/taxol細胞eya2mrna表達。

圖4為westernblotting檢測s1，s2，s3轉染72h后a2780/taxol細胞eya2蛋白表達。

圖5為plko.1-eya2-sh1重組質(zhì)粒及插入酶切位點示意圖。

圖6為小發(fā)卡shrna示意圖。u6啟動子指導下游小發(fā)卡shrna的轉錄；包括23個s1正義鏈堿基，23個s1反義鏈堿基。

圖7為westernblotting檢測轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol細胞eya2蛋白表達。

圖8為相差顯微鏡觀察轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol細胞數(shù)量和形態(tài)變化。

圖9為溴標法檢測轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol細胞的增殖。

圖10為caspase3活性檢測轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol細胞的凋亡。

圖11為細胞劃痕實驗檢測轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol細胞遷移能力。

圖12為transwell檢測轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol細胞遷移能力(a)和侵襲能力(b)。

圖13為轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol細胞對紫杉醇耐藥的逆轉。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。以下的實施例中采用的方法目的是更好地理解本發(fā)明，但并不限于本發(fā)明。如無特殊說明，實施例中涉及的實驗方法均為常規(guī)方法，所用的實驗材料均為常規(guī)試劑公司購買。

采用spss18.0統(tǒng)計分析軟件，各樣本數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組之間的差異用t檢驗(independent-samplettest)，多組之間的檢驗用單因素方差分析(one-wayanova)，ic50使用probit回歸分析，p＜0.05有統(tǒng)計學差異。

卵巢癌細胞株a2780及卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol由浙江省女性生殖健康研究重點實驗室細胞庫保存；

兔抗人eya2一抗(cat.11314-1-ap)、鼠抗人gapdh一抗(cat.60004-1-ig)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(cat.sa00001-1)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔igg(h+l)二抗(cat.sa00001-2)均購自proteintech公司；

westernblottingluminolreagent檢測試劑盒(cat.sc-2048)購自santacruz公司；

cdna逆轉錄試劑盒primescripttmrtmastermix(cat.rr036a)、熒光定量pcr檢測試劑盒sybrpremixextaq(perfectrealtime,cat.drr041a)購自takara公司；lipofectamine3000轉染試劑盒(cat.l3000008)購自invitrogen公司；

真核表達載體選擇rnai載體plko.1puro，源于全球科學家質(zhì)粒共享非盈利組織addgene；

限制性內(nèi)切酶agei(cat.r0552s)、ecori(cat.r0101s)、kpni(cat.r0142s)購自neb公司；t4連接酶(cat.2011a)、dna片段純化試劑盒(cat.9761)、dna凝膠回收試劑盒(cat.9762)、質(zhì)粒dna小量純化試劑盒(cat.9760)均購自takara公司；

sirna由takara公司合成；pcr引物及克隆用dna由上海生工生物工程公司合成；

預染蛋白marker(cat.26616)購自fermentas公司；

溴標法細胞增殖檢測試劑盒cellproliferationelisa,brdu(colorimetric,cat.11647229001)購自roche公司；

caspaceassaysystem(colorimetric，cat.g7351)購自promega公司；

細胞遷移、侵襲模型transwellpermeablesupports(cat.3428)購自corning公司；

lab-tekiichamberslidesystem—lab-tek腔室玻片系統(tǒng)購自nunc公司(cat.154526)；

bdmatrigel^tmbasementmembranematirx基質(zhì)膜(cat.356234)購自bd公司；

sirna陰性對照allstarsnegativecontrolsirna(cat.1027281)購自qiagen公司；

sds-page凝膠配置試劑盒(cat.cw0022m)購自康為世紀公司；

0.45umpvdf膜(cat.ipvh00010)購自millipore公司；

紫杉醇(cat.p106868)購自aladdin公司。

實施例1.卵巢癌細胞株a2780及其紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中eya2表達差異的研究

一、實時熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測eya2基因mrna表達

培養(yǎng)48h后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基，用pbs洗滌兩次后用trizol抽提總rna，thermonanodrop2000分光光度儀測定rna濃度，并按sybrpremixextaq(perfectrealtime)試劑盒說明書操作。第一步rna變性，反應體系：rna0.5ug，去rna酶depc水補足至6.8ul；反應條件：70℃孵育10min后置于冰上。第二步逆轉錄，反應體系：按照primescriptrtmastermix試劑盒說明書進行逆轉錄；反應條件：42℃孵育60min，85℃滅活5min后，-20℃保存。

取1ul逆轉錄產(chǎn)物進行熒光定量pcr反應。pcr引物序列：

5’-ggaggaaatggactgggcaa-3’；

5’-ccagcaagtgactcggaact-3’，產(chǎn)物長度：227bp；

反應條件：95℃10s，95℃5s，6℃30s，共40個循環(huán)。

采用2-△ct法計算各組樣本中eya2mrna的表達量。

結果：如圖1所示，a2780/taxol細胞和它的親本細胞a2780相比，eya2mrna表達增高了65.11％(p＜0.05)，表明在紫杉醇耐藥細胞株中eya2mrna表達顯著增高。

二、westernblotting檢測eya2蛋白表達

培養(yǎng)72h后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基，pbs洗滌3次，加入ripa蛋白裂解液(100ul/孔)，吹打數(shù)次，冰上孵育5min，使之充分裂解，4℃，12000轉離心5分鐘，收集上清，分裝-20℃貯存；每個樣品95℃變性5min后取10ul上樣，8％sds-page電泳，200v，10min；100v，100min；轉至pvdf膜：110v，120min；用含5％脫脂奶粉的tbs封閉液封閉60min；一抗孵育：eya2一抗(1：2000)、gapdh一抗(1：5000)室溫下孵育2h；tbs洗膜10min×3次；二抗孵育：辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(1：10000)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔igg(h+l)二抗(1：10000)孵育1h；tbst洗膜10min×3次，tbs洗膜10min×1次；ecl顯影后，用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對圖象掃描處理。

結果：如圖2所示，a2780/taxol細胞和它的親本細胞a2780相比，eya2蛋白表達也顯著增高(p＜0.05)。

實施例2.eya2sirna設計合成

在genebank中查獲eya2基因mrna序列(nm_005244.4)，用sidirectver2.0軟件(http://sidirect2.rnai.jp/)在線設計獲得3對sirna序列(如seqidno.1-seqidno.6)所示。設計過程中選擇同時滿足文獻報道的三種算法(ui-tei×reynolds×amarzguioui)的序列，并選擇sirna作用特異性最高的23nt長度片段，該設計可避免將來體內(nèi)實驗時發(fā)生干擾素樣免疫反應，選擇起始密碼子后100nt，避開5’和3’端utr區(qū)，gc含量控制在30-70％。共選擇3對23nt長度的sirna作為實驗篩選干擾片段，結構特征表現(xiàn)為正義鏈和反義鏈3’端各有兩個堿基外掛，結構特點如下：

隨后用blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在線進行同源性搜索，排除有同源性的序列，盡可能避免非特異性片段對sirna特異性作用效應的影響。

最后在化學合成時對正義鏈和反義鏈的5’和3’端連續(xù)3個嘌呤(嘧啶)堿基進行2’-ome(2’-甲氧基)修飾，增加sirna分子在細胞內(nèi)的化學穩(wěn)定性，延長sirna干擾基因表達下調(diào)的時間和效應。最終的序列和修飾如表1和式(ⅰ)如下：

表1

實施例3.三對eya2sirna在卵巢癌紫杉醇耐藥株a2780/taxol中對eya2基因干擾效果的檢測和篩選

一、實驗分組：

1.a2780/taxol正常組(不轉染sirna)，以下稱作ar；

2.a2780/taxol陰性對照組(轉染陰性對照sirna)，以下稱作ar-n；

3.a2780/taxol實驗組(轉染s1)，以下稱作ar-s1；

4.a2780/taxol實驗組(轉染s2)，以下稱作ar-s2；

5.a2780/taxol實驗組(轉染s3)，以下稱作ar-s3。

二、分組轉染

為確保轉染效率，降低細胞毒性，我們采用lipofectamine3000轉染試劑進行sirna轉染。轉染前一天，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板在六孔板中，使其在轉染日密度0.5×10⁶/ml，細胞融合至70-90％。每孔用125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻；制備sirna預混液，用125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋sirna至終濃度為50nm，并充分混勻；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入sirna預混液(1:1)，室溫孵育5min；最后將sirna-脂質(zhì)體復合物加入細胞中，37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)。48h后檢測eya2mrna表達，72h后檢測eya2蛋白表達。

三、實時熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測eya2基因mrna表達

檢測步驟同前，采用2-△ct法計算各組樣本中eya2mrna的表達量。

結果：如圖3所示，a2780/taxol細胞分別轉染s1、s2、s3后，eya2mrna的表達均有明顯下降，其中s1干擾效果與陰性對照組比較，eya2mrna下調(diào)了77.76％，與s2(42.31％)和s3(51.84％)相比，有顯著差異(p＜0.05)。結果表明，s1對eya2有最好的干擾效果。

四、westernblotting檢測eya2蛋白表達

檢測步驟同前，ecl顯影后，用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對圖象掃描處理。

結果：如圖4所示，與陰性對照相比，s1轉染后，a2780/taxol細胞中eya2蛋白表達顯著下降(p﹤0.05)，且與s2和s3相比有顯著差異(p﹤0.05)。結果表明，在紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，s1對eya2的蛋白表達具有最好的干擾效果。故經(jīng)過篩選，s1被選擇作為后續(xù)研究的sirna。

實施例4.真核載體plko.1-eya2-sh1的構建及對eya2基因表達的干擾效果檢測

一、實驗分組：

1.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

2.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

3.a2780/taxol實驗組1(轉染plko.1-eya2-sh1)，以下稱作ar-sh1；

二、合成eya2-s1片段

選擇agei和ecori兩個酶切位點，根據(jù)s1的序列，設計其shrna序列并構建到真核表達載體plko.1puro中。序列如下：

正義鏈：

5’-ccggactagttctaccatttccttgtattcaagagatacaaggaaatggtagaactagtttttttggtacc-3’(seqidno.7)；

反義鏈：

5’-aattggtaccaaaaaaactagttctaccatttccttgtatctcttgaatacaaggaaatggtagaactagt-3’(seqidno.8)；

三、真核載體plko.1-eya2-sh1的構建

用真核表達載體plko.1puro構建plko.1-eya2-sh1重組表達載體(圖5和6)，具體方法參見美國冷泉港出版社《分子克隆實驗指南》。

將eya2-s1正義鏈和反義鏈經(jīng)退火程序(95℃變性2min；緩慢冷卻退火至25℃)，4℃保存。agei和ecori完全酶切載體plko.1puro，37℃過夜；酶切產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒回收dna。退火產(chǎn)物與載體酶切回收片段進行連接反應，反應體系(10ul)：t4連接酶1ul，t4連接酶緩沖液1ul，退火產(chǎn)物與載體酶切回收片段混合物(摩爾比3:1)；去離子水補至10ul，16℃連接過夜；取5ul連接產(chǎn)物置于100uljm109感受態(tài)細菌中，冰浴30min，42℃熱休克90s，冰浴5min，加lb培養(yǎng)基1000ul，37℃搖床培養(yǎng)30min，5000rpm離心5min，棄上清，將細菌均勻涂布于lb平板上(含50ug/ml氨芐青霉素)，37℃倒置培養(yǎng)過夜；挑選若干獨立菌落接種于含相應抗性的lb培養(yǎng)基中，37℃震蕩過夜擴菌；收集細菌，用質(zhì)粒dna純化試劑盒抽提獲得質(zhì)粒dna，kpni酶切鑒定，獲得plko.1-eya2-sh1重組質(zhì)粒。

四、plko.1-eya2-sh1重組質(zhì)粒轉染細胞后觀察干擾效果

將plko.1-eya2-sh1轉染入對數(shù)生長期的a2780/taxol細胞中。轉染參照lipofectamine3000操作說明書，每孔用125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻；在125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基中加入5ug重組質(zhì)粒dna，加入p3000試劑10ul，充分混勻，制備重組質(zhì)粒預混液；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入重組質(zhì)粒預混液(1:1)，室溫孵育5mim；最后將重組質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物250ul加入細胞中，37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)。72h后檢測eya2蛋白表達。

如圖7所示，轉染plko.1-eya2-sh1重組質(zhì)粒后，與陰性對照(轉染空質(zhì)粒)相比，a2780/taxol細胞中eya2蛋白表達顯著下降(p﹤0.05)，結果表明，轉染plko.1-eya2-sh1重組質(zhì)粒能有效干擾eya2的蛋白表達。

實施例5.轉染plko.1-eya2-sh1特異性阻斷eya2表達后對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

一、實驗分組：

1.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

2.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

3.a2780/taxol實驗組(轉染plko.1-eya2-sh1)，以下稱作ar-sh1。

二、分組轉染

轉染步驟同前，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞，用于檢測細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

三、細胞增殖試驗

細胞在96孔板中轉染plko.1-eya2-sh1后繼續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入10ulbrdu標記液至brdu終濃度為10um，37℃孵育2h；吸除brdu標記液，每孔加入200ulfixdenat，20℃孵育30min；吸除fixdenat，每孔加入100ulanti-brdu-pod，20℃孵育90min；每孔200ulwashingsolution洗滌3次；加入100ul/孔底物溶液，20℃孵育20min，檢測波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a)，細胞增殖的能力用a實驗組/a對照組表示。

結果如圖8和圖9所示，a2780/taxol細胞轉染plko.1-eya2-sh1后，相差顯微鏡下實驗組細胞數(shù)量明顯減少，呈圓形，細胞較少有觸角伸展，細胞碎片增多；溴標法測試細胞增殖結果顯示：與陰性對照相比，實驗組細胞增殖能力下降了54.82％有顯著性差異(p＜0.05)。說明特異性阻斷eya2的表達后，能抑制腫瘤細胞增殖。

四、caspase3活性檢測細胞凋亡

轉染72h后收集細胞，裂解液調(diào)整細胞密度為1×10⁸/ml，冰上裂解15min，15000g×20min，收集上清。按照caspaceassaysystem(colorimetric)說明書同時制備陽性和陰性對照樣品，測定并調(diào)整各組蛋白濃度相同。96孔板中每孔加入caspaceassaybuffer32ul，dmso2ul，100nmdtt10ul，去離子水調(diào)整體積為98ul，加入2uldevd-pna底物，37℃孵育4h，檢測波長405nm測吸光度，用δa法計算每組樣品caspase3活性。

結果如圖10所示，a2780/taxol細胞轉染plko.1-eya2-sh1后，caspase3活性增加了2.15倍，與陰性對照比較，有顯著性差異(p＜0.05)，說明特異性阻斷eya2的表達后，能促進腫瘤細胞凋亡。

五、細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力

在六孔板背后用直尺均勻劃橫線，約0.5cm劃一道，橫穿過孔，每孔至少有6條橫線。細胞轉染plko.1-eya2-sh1后，繼續(xù)培養(yǎng)24h細胞融合成單層狀態(tài)時，在選定區(qū)域用200ul的槍頭在六孔板中垂直劃痕，pbs洗3次去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。0h，24h，48h時間點拍照，隨機選取6條水平線，計算細胞間距離均值。

結果如圖11所示，plko.1-eya2-sh1轉染細胞24h和48h后，a2780/taxol細胞間距離顯著大于陰性對照組，細胞劃痕后愈合能力顯著下降，說明特異性阻斷eya2的表達，能抑制腫瘤細胞的遷移。

六、transwell試驗檢測細胞遷移能力

細胞轉染48h后，用胰酶消化收集，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×10⁵/ml，上室加2ml細胞懸液，下室加10％fbs完全培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出小室，pbs洗3次，用棉簽小心去除上室上層表面的細胞，倒置晾干，95％乙醇固定25min，蘇木素染色，顯微鏡下觀察、計數(shù)、拍照。每個小室計數(shù)10個視野，取平均值統(tǒng)計并分析細胞遷移能力的改變。

細胞遷移實驗結果如圖12a所示，轉染plko.1-eya2-sh1后，a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數(shù)量分別是103±15與284±29，兩者有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)；該結果表明，特異性阻斷eya2的表達后，能抑制腫瘤細胞的遷移。

七、transwell試驗檢測細胞侵襲能力

將-20℃保存的基質(zhì)膠先在4℃復溫液化，取基質(zhì)膠與opti-mem以1:6冰上混勻稀釋，包被小室底部膜的上室面，37℃固化30min，吸除小室內(nèi)析出的液體?；|(zhì)膠包被后其余步驟同上，每個小室計數(shù)10個視野，取平均值統(tǒng)計并分析細胞侵襲能力的改變。

細胞侵襲實驗結果如圖12b所示，a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數(shù)量分別是82±15與179±24，兩者有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)；該結果表明，特異性阻斷eya2的表達后，能抑制腫瘤細胞浸潤。

實施例6.plko.1-eya2-sh1特異性阻斷eya2表達后對卵巢癌耐藥的逆轉作用

一、實驗分組：

1.a2780正常組(不轉染任何載體)，以下稱作a；

2.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

3.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

4.a2780/taxol實驗組(轉染plko.1-eya2-sh1)，以下稱作ar-sh1。

二、分組轉染

轉染步驟同前，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24h。

三、轉染plko.1-eya2-sh1后細胞對紫杉醇敏感性的檢測

各組取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后細胞重懸，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞懸液的密度為1×10⁵/ml，接種到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h。次日，各組中加入紫杉醇，濃度梯度分別設200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml，0ug/ml，作用24h后，用溴標法在波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a)，計算紫杉醇對每組細胞的抑制率，抑制率＝a實驗組/a陰性對照組。每個濃度設3個復孔，取平均值。

抑制率為50％時的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度(ic50)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其親本細胞株a2780的ic50的比值為耐藥倍數(shù)(resistantfolder,rf)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其轉染plko.1-eya2-sh1(逆轉劑)后的ic50的比值為耐藥逆轉指數(shù)(reversalindex,ri)。

結果如表2、表3、圖13所示，a2780/taxol對紫杉醇的ic50(40.33±4.57ug/ml)顯著高于親本a2780對紫杉醇的ic50(1.24±0.46ug/ml)，耐藥倍數(shù)高達32.52，提示a2780/taxol對紫杉醇的敏感性顯著低于親本細胞a2780，高度耐藥。而當a2780/taxol轉染plko.1-eya2-sh1之后，對紫杉醇的敏感性明顯提高(5.79±1.23ug/ml)，轉染plko.1-eya2-sh1對a2780/taxol紫杉醇耐藥的逆轉效果非常明顯，逆轉指數(shù)為6.67。

表2.a2780及a2780/taxol對紫杉醇的藥物敏感性

表3.轉染plko.1-eya2-sh1后a2780/taxol對紫杉醇藥物敏感性的逆轉

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<110>浙江大學

<120>特異性抑制eya2基因表達的sirna及其重組載體和應用

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