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一種人乙型肝炎病毒重組載體及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11809256閱讀:329來源:國知局
一種人乙型肝炎病毒重組載體及其應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及基因工程、基因治療和生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種重組人乙型肝炎病毒載體及其在特異性地靶向肝臟或肝細胞導(dǎo)入外源基因中的應(yīng)用。



背景技術(shù):

文獻報道了肝臟疾病如慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、代謝障礙引起的肝病、藥物及其它原因引起的中毒性肝病、自身免疫性肝病等是臨床常見病,對機體健康危害極大,其中許多疾病尚沒有很有效的治療手段,迫切需要新型治療方法或藥物,而肝臟或肝細胞特異的基因治療方法在該方面具有潛在的應(yīng)用價值。

研究顯示,先天性或后天性功能基因缺陷,可導(dǎo)致血友病、胰島素依賴的I型糖尿病等由于血液中特定蛋白質(zhì)的缺乏而產(chǎn)生的嚴重疾病。肝臟由于其巨大的肝細胞數(shù)量以及與循環(huán)血液的密切接觸,是通過基因治療方法治療此類疾病的理想靶器官,從而使得肝臟或肝細胞特異的基因治療方法在此類疾病治療中亦具有廣泛的應(yīng)用前景。

基因治療最關(guān)鍵、同時也是最困難的問題在于如何將外源基因特異并高效地導(dǎo)入特定組織器官內(nèi)特定類型的靶細胞,并使其在靶細胞內(nèi)表達。對肝臟的特異性基因?qū)胗葹槔щy:由于肝內(nèi)kupffer(枯否氏)細胞的吞噬作用,用脂質(zhì)體方法很難有效地將外源基因?qū)敫螌嵸|(zhì)細胞;而使用常見的重組病毒載體如腺病毒載體、慢病毒載體等將外源基因?qū)氲礁螌嵸|(zhì)細胞的效果也不理想,原因至少可部分歸結(jié)于這些病毒的感染并不是肝特異性的。人乙型肝炎病毒(HBV)(以下簡稱乙肝病毒)具有高度的組織和細胞特異性,感染人時僅感染肝臟中的肝實質(zhì)細胞,因而以HBV為基礎(chǔ)、用于肝臟基因治療的重組病毒載體一直受到關(guān)注。

現(xiàn)有技術(shù)公開了乙肝病毒具有部分環(huán)狀雙鏈的DNA基因組,長度約為3.2kb,含有四個不同程度相互重疊開放閱讀框架,它們分別是C基因,編碼核心蛋白(核心抗原)和分泌的e蛋白(e抗原);S基因,編碼大、中和小表面蛋白(表面抗原),大蛋白和中蛋白相比小蛋白,在氨基端分別多preS(由preS1+preS2組成)和preS2;P基因,編碼聚合酶;X基因,編碼X蛋白。

研究顯示,乙肝病毒的感染始于病毒附著在肝細胞上,通過特異性受體的識別,病毒外膜與細胞膜發(fā)生融合,病毒核衣殼釋放到細胞質(zhì)中并解聚,病毒基因組轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi),在細胞修復(fù)酶的作用下形成共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA),隨后,病毒以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生四種mRNA,分別是3.5kb前基因組RNA(pgRNA)、2.4kb mRNA、2.1kb mRNA和0.8kb mRNA。2.4kb和2.1kb的mRNA指導(dǎo)表面蛋白的翻譯,0.8kb mRNA指導(dǎo)X蛋白的 翻譯,而3.5kb pgRNA除了指導(dǎo)核心蛋白和聚合酶的翻譯外,還作為病毒的前基因組RNA在其翻譯產(chǎn)生的聚合酶順式作用下起始反轉(zhuǎn)錄;進而前基因組RNA、聚合酶以及新生負鏈DNA被新產(chǎn)生的核心蛋白包裹形成新的核衣殼,該步驟為基因組復(fù)制后續(xù)步驟發(fā)生的必要前提,在核衣殼中,病毒聚合酶以pgRNA為模板完成反轉(zhuǎn)錄并進而以負鏈DNA為模板合成正鏈DNA組成子代病毒基因組;最終,核衣殼被表面蛋白包裹,形成成熟的病毒粒子,分泌出細胞,開始新的感染周期。

研究顯示,乙肝病毒的聚合酶在病毒DNA的復(fù)制中占有核心地位。聚合酶可分為四個結(jié)構(gòu)域,分別為末端蛋白(TP)、間隔區(qū)(Spacer或SP)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)和核酸酶H(RNaseH)。TP、RT和RNaseH活性在乙肝病毒DNA的復(fù)制中都不可缺少,而SP的功能尚不清楚,可能主要起連接TP和RT的作用;不同基因型的乙肝病毒的聚合酶大小稍有差異,差異主要來自SP區(qū)的長度。

乙肝病毒的嗜肝性主要體現(xiàn)在感染進入靶細胞和細胞內(nèi)病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩個層面上。首先,乙肝病毒高度選擇性地感染人肝細胞;其次,乙肝病毒基因的轉(zhuǎn)錄受到病毒攜帶的四個啟動子和兩個增強子的調(diào)控,許多肝細胞特異或富集的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與調(diào)節(jié)這些元件的活性〔Seeger C and Mason W,2000.Microbiol.Mol.Biol.Rev.64:51-68〕。

乙肝病毒的嗜肝性使其在理論上有可能成為肝臟基因治療的理想病毒載體。但是,由于乙肝病毒的基因組很小,僅為3.2kb,病毒基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)之間高度相互重疊,病毒核衣殼的容量又極為有限(實驗證明基因組DNA若大于3.5kb就無法檢測到病毒的復(fù)制),因此,對乙肝病毒基因組進行人工改造使其能夠容納一定長度的外源基因,且不影響病毒的高效復(fù)制就顯得非常困難,國際上早期的一些嘗試均未能獲得成功(Chaisomchit S,Tyrrell D,Chang L,1997.Gene Therapy.4:1330-1340)。中國發(fā)明專利《一種高效復(fù)制的人乙型肝炎病毒重組載體及其應(yīng)用》(CN 102643858B,2014.04.02)公開了一種人乙型肝炎病毒重組載體(下文簡稱5c3c)的設(shè)計、構(gòu)建及應(yīng)用,該重組基因組特點在于相對于野生型人乙型肝炎病毒基因組,缺失了聚合酶的部分間隔區(qū)(A、B、C、F、H基因型的人乙型肝炎病毒聚合酶的間隔區(qū)的SP15-SP143的部分或者全部);5c3c的聚合酶間隔區(qū)缺失位點處可插入特定的外源序列并仍保持高效的基因組復(fù)制能力,以及實現(xiàn)外源基因的表達。但由于5c3c中外源序列的插入位點位于乙型肝炎病毒聚合酶中的間隔區(qū),為不破壞前基因組RNA順式翻譯有功能聚合酶的能力從而保持重組病毒載體的高效復(fù)制能力,外源序列的插入不可導(dǎo)致在聚合酶編碼序列中引入終止密碼子,為此外源序列可能需要進行人工突變。而即使外源序列插入5c3c不導(dǎo)致聚合酶翻譯提前終止,由于外源序列插入必然導(dǎo)致聚合酶間隔區(qū)出現(xiàn)無關(guān)序列,仍有可能影響聚合酶活性并進而導(dǎo)致重組病毒載體復(fù)制能力低下。由于上述原因,已公開的5c3c人乙型肝 炎病毒重組載體對可插入的外源序列存在一定限制,一定程度上影響了實施應(yīng)用。另一方面,5c3c載體編碼完整的病毒核心蛋白和有功能的病毒聚合酶,無需其它協(xié)助即可獨立完成從病毒前基因組RNA開始的病毒基因組復(fù)制過程,僅在形成完整感染性病毒粒子時需要提供野生型病毒被膜蛋白輔助。對于體內(nèi)基因治療應(yīng)用而言,具備獨立復(fù)制能力的病毒載體發(fā)生不可預(yù)見后果的可能性更高,長期安全性較不具備獨立復(fù)制能力的病毒載體更易受到質(zhì)疑。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,提供一種易用性和安全性得到顯著改善的、在肝臟細胞中特異性表達外源基因的重組乙肝病毒載體。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體在基因治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明基于,利用乙肝病毒的嗜肝性可以將其開發(fā)為肝臟特異的重組病毒載體,關(guān)鍵技術(shù)是如何在乙肝病毒基因組中尋找合適的外源基因插入位點,同時維持病毒的高效復(fù)制。中國發(fā)明專利《一種高效復(fù)制的人乙型肝炎病毒重組載體及其應(yīng)用》(CN 102643858 B,2014.04.02)公開的5c3c重組病毒載體中外源序列的插入位點位于乙型肝炎病毒聚合酶間隔區(qū),對可插入的外源序列存在特定限制;此外由于5c3c載體編碼完整的病毒核心蛋白和有功能的病毒聚合酶,可獨立進行病毒基因組復(fù)制,長期安全性存疑。在本發(fā)明中,以5c3c為基礎(chǔ),對病毒核心蛋白做最大缺失以造成重組病毒載體無法獨立進行基因組復(fù)制,缺失位點并可用于外源序列插入;同時,為減少上游序列變化對病毒聚合酶翻譯的影響,在病毒聚合酶起始密碼子前插入核糖體進入位點(IRES)序列。本發(fā)明對在5c3c載體核心蛋白編碼序列中引入缺失、進而在缺失部位插入外源序列后病毒基因組的復(fù)制能力、復(fù)制條件以及外源基因的表達進行了詳盡研究,研究結(jié)果顯示,刪除5c3c載體核心蛋白編碼序列中第109-406位核苷酸導(dǎo)致重組病毒載體基因組完全失去獨立復(fù)制能力,但在反式提供以野生型病毒核心蛋白時,重組病毒載體基因組能夠高效復(fù)制,而在病毒聚合酶起始密碼子之前引入IRES序列可進一步提高復(fù)制效率;在核心蛋白缺失部位處直接插入多種序列未經(jīng)修改的外源基因,所獲得的重組病毒載體仍具有在反式提供有野生型病毒核心蛋白時高效復(fù)制的能力,并且插入的外源基因也能有效表達,顯示該重組病毒基因組具有作為重組乙肝病毒載體的良好性質(zhì)。

本發(fā)明一方面提供了一種基于人乙型肝炎病毒的重組載體,所述病毒基因組相對于已公開的5c3c載體,缺失核心蛋白的部分并在聚合酶起始密碼子之前插入IRES序列。

具體而言,所述病毒基因組含有以下的結(jié)構(gòu)之一:

附圖1和圖2中所示的結(jié)構(gòu)及所示部位的缺失,缺失范圍位于人乙型肝炎病毒聚合酶的間隔區(qū)(SP區(qū)域)和核心蛋白區(qū),同時在病毒聚合酶起始密碼子ATG前插有IRES序列;

含有附圖1和圖2中所示的結(jié)構(gòu)及所示部位的缺失,缺失范圍包括所示缺失部位全部或者部分的任意缺失,同時在病毒聚合酶起始密碼子ATG前插有IRES序列;

在(a)(b)所述結(jié)構(gòu)中的所示缺失部位插入了任意外源序列的結(jié)構(gòu)。

目前已知人乙肝病毒有8個基因型(A-H);各基因型聚合酶的RT和RNaseH區(qū)大小完全相同,而TP和SP區(qū)大小稍有區(qū)別,國際標準將各結(jié)構(gòu)域分別計數(shù)。具體就SP而言:A、B、C、F、H基因型為169個殘基,E、G基因型為168個殘基,D基因型為158個殘基。按照國際標準計數(shù)規(guī)則,以A、B、C、F、H基因型的169殘基大小為基準,所述的聚合酶缺失是A、B、C、F、H基因型的乙型肝炎病毒聚合酶的間隔區(qū)的SP15-SP143的部分或者全部。對于核心蛋白,B、C、D、E、F、H基因型有552bp(184aa),A基因型有558bp(186aa),G基因型有585bp(195aa)。按照國際標準計數(shù)規(guī)則,所述的核心蛋白缺失相當(dāng)于基因型A、B、C、F、H的第109至406位核苷酸的部分或者全部。

本發(fā)明的重組載體的制備方法包括:去除乙型肝炎病毒聚合酶間隔區(qū)和核心蛋白上述區(qū)段的部分或者全部;例如,擴增獲得不含有乙型肝炎病毒聚合酶間隔區(qū)和核心蛋白上述區(qū)段的部分或者全部的乙肝病毒載體序列,然后依次拼接。

本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建物,所述構(gòu)建物可轉(zhuǎn)錄出上述重組人乙肝病毒載體的前基因組RNA。

另一方面,本發(fā)明提供了一種細胞,該細胞含有上述的重組人乙肝病毒載體或上述的構(gòu)建物。

利用本發(fā)明提供的重組人乙肝病毒載體、構(gòu)建物或細胞可以制備得到不具備自主復(fù)制能力,但在反式提供野生型乙肝病毒核心蛋白的條件下高效復(fù)制其基因組,在進一步反式提供野生型乙肝病毒被膜蛋白時包裝形成完整感染性病毒粒子,并可在感染細胞中表達外源基因的重組乙肝病毒。

由于反式提供的乙肝病毒核心蛋白和被膜蛋白均為野生型乙肝病毒蛋白,上述重組乙肝病毒粒子與天然乙肝病毒結(jié)構(gòu)成分完全相同,僅內(nèi)含的基因組缺失了乙肝病毒聚合酶間隔區(qū)的SP15-SP143和核心蛋白第109-406位核苷酸的部分或者全部序列。所述缺失序列均位于乙肝病毒調(diào)控區(qū)(啟動子、增強子)以及前基因組RNA包裝信號等重要元件之外,相應(yīng)區(qū)段的缺失對乙肝病毒感染肝細胞和在肝細胞內(nèi)特異地基因轉(zhuǎn)錄都沒有影響〔Seeger C and Mason W,2000.Microbiol.Mol.Biol.Rev.64:51-68〕。此外由于缺少核心蛋白,該重組乙肝病毒在不表達野生型乙肝病毒核心蛋白或被膜蛋白的肝細胞內(nèi),不能自主進行病毒基因組的復(fù)制。因此,該重組乙肝病毒顆粒在具備此前公開的5c3c載體的肝臟或肝細胞特異性的基因?qū)肽芰Φ幕A(chǔ)上,提高了安全性。

例如,將外源基因與本發(fā)明的重組乙肝病毒載體或者所述的構(gòu)建物連接,并轉(zhuǎn)入肝細胞。本發(fā)明的重組乙肝病毒載體可以在核心蛋白缺失區(qū)、即IRES序列上游插入外源序列,除乙肝病毒基因組長度限制外,對插入外源序列的其它性質(zhì)沒有特殊限制。而此前公開的5c3c載體由于外源序列插入位點位于病毒聚合酶間隔區(qū),除乙肝病毒基因組長度限制外,插入序列還不可在聚合酶編碼序列中引入終止密碼子導(dǎo)致聚合酶編碼序列提前終止,從而對外源基因的選擇造成了限制。因此,本發(fā)明的重組乙肝病毒載體在具備此前公開的5c3c載體的基礎(chǔ)上,還提高了易用性。

同時,本發(fā)明提供了一種用于肝臟靶向的基因治療藥物,所述藥物包含上述的重組載體或構(gòu)建物。所述藥物可以是外源基因編碼序列與本發(fā)明的重組載體或構(gòu)建物連接構(gòu)成。

本發(fā)明中,術(shù)語“缺失”指的是本發(fā)明所述的重組人乙肝病毒載體,其基因組與野生型乙肝病毒基因組相比較,缺少特定序列,而缺少序列的具體位置,如附圖1和圖2所示。

本發(fā)明另一方面還涉及含有上述重組人乙肝病毒載體基因組的構(gòu)建物,所述構(gòu)建物可以是DNA形式或RNA形式。

本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體基因組通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法,可根據(jù)本發(fā)明所公開的重組乙肝病毒載體基因組結(jié)構(gòu)以及公共數(shù)據(jù)庫中的野生型或突變株乙肝病毒基因組序列設(shè)計引物,擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時,通??赏ㄟ^重疊擴增,例如進行兩次或多次PCR擴增,然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列,就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其插入克隆載體,再轉(zhuǎn)入細胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。

上述的“克隆載體”指本領(lǐng)域熟知的原核或真核表達質(zhì)粒?!翱寺≥d體”包含一個或多個選擇性標記基因,以用于選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞的表型,如真核細胞使用的新霉素抗性,大腸桿菌使用的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。

在本發(fā)明中,使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法將包含本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體基因組插入到克隆載體中。這些方法包括但不限于體外重組DNA技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambrook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。

本文所指的“構(gòu)建物”是指包含本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體基因組以及指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄起始、翻譯起始、轉(zhuǎn)錄終止和翻譯終止的調(diào)控序列的表達質(zhì)粒。

上述表達質(zhì)??捎糜谵D(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)恼婧思毎允蛊淠軌蜣D(zhuǎn)錄出本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體基因組中含有的病毒基因特別是前基因組RNA。宿主細胞如哺乳動物HuH7、HepG2 細胞等??刹捎玫霓D(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染方法包括但并不限于:磷酸鈣共沉淀法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)等。

本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體可在細胞內(nèi)表達并分泌到細胞外。如果需要,可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種方法分離和純化表達產(chǎn)物。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:密度梯度離心、PEG沉淀等。

本發(fā)明還涉及上述重組人乙肝病毒載體、構(gòu)建物或細胞在制備基因治療藥物中的用途,包括但不限于將其與藥學(xué)上可接受的物質(zhì)混合包括糖類,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纖維素及其衍生物,如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素;西黃蓍膠粉末;麥芽;明膠;滑石;固體潤滑劑,如硬脂酸和硬脂酸鎂;硫酸鈣;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化劑,如Tween;潤濕劑,如月桂基硫酸鈉;著色劑;調(diào)味劑;壓片劑、穩(wěn)定劑;抗氧化劑;防腐劑;無熱原水;等滲鹽溶液;磷酸鹽緩沖液等。

附圖說明

圖1和圖2顯示重組乙肝病毒載體基因組中相對于野生型乙肝病毒基因組的缺失部位,

圖1中,上圖為野生型乙肝病毒基因組的示意圖,本發(fā)明重組乙肝病毒載體相對于野生型乙肝病毒基因組在聚合酶間隔區(qū)(中圖)以及核心蛋白編碼區(qū)(下圖)的缺失部位分別以扇形框標示;

圖2顯示缺失部位的具體位置;目前已知人乙肝病毒有8個基因型(A-H),各基因型聚合酶的RT和RNaseH區(qū)大小完全相同,而TP和SP區(qū)大小稍有區(qū)別,國際標準將各結(jié)構(gòu)域分別計數(shù),具體就SP而言:A、B、C、F、H基因型為169個殘基,E、G基因型為168個殘基,D基因型為158個殘基;按照國際標準計數(shù)規(guī)則,以A、B、C、F、H基因型的169殘基大小為基準,所述的聚合酶缺失是A、B、C、F、H基因型的乙型肝炎病毒聚合酶的間隔區(qū)的SP15-SP143的部分或者全部(上圖);對于核心蛋白,B、C、D、E、F、H基因型有552bp(184aa),A基因型有558bp(186aa),G基因型有585bp(195aa);按照國際標準計數(shù)規(guī)則,所述的核心蛋白缺失相當(dāng)于基因型A、B、C、F、H的第109至406位核苷酸的部分或者全部(下圖)。

圖3為實施例中使用的各種構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)示意圖,其中,WT:約1.1拷貝的野生型HBV基因組裝配到CMV啟動子下游,由后者驅(qū)動病毒前基因組RNA轉(zhuǎn)錄并進而作為復(fù)制模板進行子代病毒基因組復(fù)制;5c3c:中國發(fā)明專利《一種高效復(fù)制的人乙型肝炎病毒重組載體及 其應(yīng)用》(CN 102643858B,2014.04.02)公開的重組人乙肝病毒載體的基因組結(jié)構(gòu),病毒聚合酶間隔區(qū)缺失部位(SP15-SP143)采用折線標出;5c3c-ΔC:在5c3c基礎(chǔ)上,在核心蛋白中引入第109至406位核苷酸缺失,缺失部位用空白缺口表示;5c3c-ΔC-Gtx IRES(5dCG):在5c3c-ΔC基礎(chǔ)上,在核心蛋白缺失部位、聚合酶起始密碼子上游插入Gtx IRES序列(Chappell,S.A.,et al.2000.Proc Natl Acad Sci U S A 97:1536-1541),得到本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體的基因組結(jié)構(gòu),IRES以斜線填充方框表示;5dCG-ZeoR:5dCG中插入博來霉素抗性蛋白基因ZeoR;5dCG-NLuc:5dCG中插入熒光素酶NanoLuc(Promega)蛋白基因NLuc;5dCG-sNLuc:5dCG中插入分泌型NanoLuc蛋白基因sNLuc;5dCG-DsRed:5dCG中插入紅色熒光蛋白基因DsRed;5dCG-EGFP:5dCG中插入插入綠色熒光蛋白基因EGFP;pC:用于反式提供野生型乙肝病毒核心蛋白的質(zhì)粒示意圖;pLMS:用于反式提供野生型乙肝病毒表面蛋白的質(zhì)粒示意圖。

圖4為本發(fā)明重組人乙肝病毒載體的復(fù)制條件及復(fù)制效率研究結(jié)果,其中,5c3c、5c3c-ΔC與5dCG分別單獨轉(zhuǎn)染或者與表達野生型乙肝病毒核心蛋白的輔助質(zhì)粒pC共同轉(zhuǎn)染培養(yǎng)肝癌細胞株Huh7,以核酸雜交方法檢測胞內(nèi)病毒復(fù)制中間體。

圖5為本發(fā)明重組人乙肝病毒載體插入外源序列后的復(fù)制情況,其中,

Patient serum:由病人血清抽提得到的人乙肝病毒的基因組核酸,用作marker;WT:用CMV啟動子啟動的1.1拷貝野生型人乙肝病毒的復(fù)制情況;5c3c:中國發(fā)明專利《一種高效復(fù)制的人乙型肝炎病毒重組載體及其應(yīng)用》(CN 102643858B,2014.04.02)公開的重組人乙肝病毒載體的復(fù)制情況;5dCG:本發(fā)明重組人乙肝病毒載體的復(fù)制情況;5dCG-ZeoR:5dCG插入外源基因ZeoR后重組乙肝病毒的復(fù)制情況;5dCG-NLuc:5dCG插入外源基因NLuc后重組乙肝病毒的復(fù)制情況;5dCG-sNLuc:5dCG插入外源基因sNLuc后重組乙肝病毒的復(fù)制情況;5dCG-DsRed:5dCG插入外源基因DsRed后重組乙肝病毒的復(fù)制情況;5dCG-EGFP:5dCG插入外源基因EGFP后重組乙肝病毒的復(fù)制情況;除病人血清樣品外,所有復(fù)制實驗均在培養(yǎng)肝癌細胞株Huh7中實施,其中除WT和5c3c外,5dCG及5dCG插入外源基因的構(gòu)建物均同時共轉(zhuǎn)染表達野生型乙肝病毒核心蛋白的輔助質(zhì)粒pC。

圖6和圖7為外源基因的表達情況,其中,

圖6顯示了本發(fā)明重組人乙肝病毒載體5dCG載體中插有有外源基因NLuc和sNLuc的重組乙肝病毒基因組的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,無論是否有表達野生型乙肝病毒核心蛋白的輔助質(zhì)粒pC共同轉(zhuǎn)染,細胞裂解液(Intracellular)和細胞培養(yǎng)液(Supernatant)里均可檢測到顯著的熒光素酶表達(以Promega公司NanoLuc檢測試劑盒檢測);pNL-blank:陰性對照質(zhì)粒pNL-blank與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素 酶表達情況;pNL-sNLuc:分泌型NanoLuc陽性對照質(zhì)粒(Promega)pNL-sNLuc與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素酶表達情況;5dCG:5dCG轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素酶表達情況;5dCG+pC:5dCG與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素酶表達情況;5dCG-NLuc:5dCG-NLuc轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素酶表達情況;5dCG-NLuc+pC:5dCG-NLuc與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素酶表達情況;5dCG-sNLuc:5dCG-sNLuc轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素酶表達情況;5dCG-sNLuc+pC:5dCG-sNLuc與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液里的熒光素酶表達情況;

圖7顯示了攜帶有外源基因Ds-Red或EGFP的重組乙肝病毒載體5dCG構(gòu)建物轉(zhuǎn)染Huh7細胞后紅色(Ds-Red)或綠色(EGFP)熒光蛋白的表達情況,明場視野(Bright Field)為對照;5dCG:5dCG轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞紅、綠熒光蛋白的表達情況;5dCG+pC:5dCG與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞紅、綠熒光蛋白的表達情況;5dCG-EGFP:5dCG-EGFP轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞紅、綠熒光蛋白的表達情況;5dCG-EGFP+pC:5dCG-EGFP與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞紅、綠熒光蛋白的表達情況;5dCG-DsRed:5dCG-DsRed轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞紅、綠熒光蛋白的表達情況;5dCG-DsRed+pC:5dCG-DsRed與pC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Huh7細胞后,細胞紅、綠熒光蛋白的表達情況。

圖8:為細胞內(nèi)及培養(yǎng)基中的重組乙肝病毒,其中,通過用PreS1的抗體做pull-down實驗,證明本發(fā)明的重組乙肝病毒載體5dCG以及5dCG插入外源基因NLuc和sNLuc的重組乙肝病毒構(gòu)建物5dCG-NLuc和5dCG-sNLuc,不僅均能在反式提供野生型乙肝病毒核心蛋白(pC質(zhì)粒共轉(zhuǎn))的情況下,完成基因組復(fù)制,而且均能在反式提供野生型乙肝病毒表面蛋白(pLMS質(zhì)粒共轉(zhuǎn))的情況下,包裝出完整病毒顆粒并分泌至轉(zhuǎn)染細胞上清中;野生型人乙肝病毒質(zhì)粒(WT)、5c3c載體質(zhì)粒單獨或與pLMS共轉(zhuǎn)分別作為對照。Intracellular capsid-associated HBV DNA:轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)核心顆粒包裹的乙肝病毒基因組復(fù)制中間體;Supernatant HBV DNA:轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中總病毒核酸;Supernatant HBV DNA anti-PreS1pulldown:利用PreS1抗體pulldown上清中的成熟病毒粒子抽提其中病毒基因組。

具體實施方式

本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述,本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù),這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻中有完整的描述:例如,Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989);《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯,1985);《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯,1984);《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯,1984);《蛋白質(zhì)純化:原理和實踐》第2版(Springer-Verlag,N.Y.),以及《實驗免疫學(xué)手冊》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯,1986)?;蛘撸砂凑赵噭┥a(chǎn)商所提供的說明書進行。

實施例1:重組人乙肝病毒載體的復(fù)制條件與復(fù)制能力

下面以含1.1拷貝的重組人乙肝病毒載體基因組的表達質(zhì)粒5dCG(圖3)為例說明本發(fā)明中重組病毒載體的構(gòu)建方法。首先以中國發(fā)明專利《一種高效復(fù)制的人乙型肝炎病毒重組載體及其應(yīng)用》(CN 102643858B,2014.04.02)公開的重組人乙肝病毒載體構(gòu)建物,含有1.1拷貝的、聚合酶間隔區(qū)有384bp缺失的乙肝病毒基因組的質(zhì)粒5c3c(圖3)為模板,通過反向PCR擴增得到缺失核心蛋白基因第109-406位核苷酸的含1.1拷貝的重組人乙肝病毒載體基因組質(zhì)粒5c3c-ΔC,接著通過PCR的方法擴增出Gtx IRES核糖體進入位點序列(Chappell,S.A.,et al.2000.Proc Natl Acad Sci U S A 97:1536-1541)插入5c3c-ΔC中聚合酶起始密碼子上游位置,得到含1.1拷貝的本發(fā)明重組人乙肝病毒載體基因組質(zhì)粒5c3c-ΔC-Gtx IRES(5dCG)。

5c3c、5c3c-ΔC及5dCG分別與空質(zhì)粒對照或表達野生型乙肝病毒核心蛋白的輔助質(zhì)粒pC共轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,轉(zhuǎn)染96小時后,收獲并破碎細胞,經(jīng)DNA酶消化,蛋白酶K消化,酚氯仿抽提,乙醇沉淀后,southern blot方法檢測胞內(nèi)病毒復(fù)制中間體以研究不同載體的復(fù)制條件與復(fù)制水平。如附圖4所示,5c3c載體由于自身表達野生型乙肝病毒核心蛋白,無論是否共轉(zhuǎn)pC輔助質(zhì)粒,均能有效復(fù)制其基因組;而5c3c-ΔC及5dCG由于自身缺失表達野生型乙肝病毒核心蛋白的能力,在無pC輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)時,沒有基因組復(fù)制能力,僅當(dāng)有pC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)提供核心蛋白時可以進行基因組復(fù)制;然而考察三個構(gòu)建物的復(fù)制效率可知,5c3c-ΔC及5dCG在共轉(zhuǎn)pC輔助質(zhì)粒條件下復(fù)制強于5c3c,而其中5dCG又強于5c3c-ΔC。

實施例2:重組人乙肝病毒的復(fù)制能力

含1.1拷貝的重組人乙肝病毒載體基因組的質(zhì)粒5dCG,在病毒核心蛋白缺失部位插入了未經(jīng)修改的ZeoR、NLuc、sNLuc、DsRed及EGFP蛋白編碼序列后得到重組病毒質(zhì)粒5dCG-ZeoR、5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc、5dCG-DsRed及5dCG-EGFP,上述質(zhì)粒與載體質(zhì)粒5dCG分別與表達野生型乙肝病毒核心蛋白的輔助質(zhì)粒pC共同轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,轉(zhuǎn)染96小時后,收獲并破碎細胞,經(jīng)DNA酶消化,蛋白酶K消化,酚氯仿抽提,乙醇沉淀后,southern blot方法檢測胞內(nèi)病毒復(fù)制中間體。作為對照,CMV啟動子驅(qū)動的1.1拷貝野生型人乙肝病毒質(zhì)粒WT及CMV啟動子驅(qū)動的1.1拷貝5c3c重組病毒質(zhì)粒亦分別轉(zhuǎn)染Huh7細胞后同樣抽提胞內(nèi)復(fù)制中間體檢測。同時以人乙肝病毒感染病人血清中抽提得到的病毒基因組為分子量對照。如附圖5所示,本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體5dCG插入從375bp(ZeoR)到747bp的(Ds-Red)的外源基因編碼序列后得到的重組乙肝病毒,在反式提供野生型病毒核心蛋白時都能高效復(fù)制,復(fù)制效率雖略有差異,但均接近或高于野生型病毒基因組(WT)的復(fù)制水平。

實施例3:重組人乙肝病毒有效表達外源基因

以本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體質(zhì)粒5dCG和在其基礎(chǔ)上攜帶有NLuc、sNLuc基因的重組乙肝病毒質(zhì)粒5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,或者與表達野生型病毒核心蛋白的輔助質(zhì)粒pC共同轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,轉(zhuǎn)染后48h分別收集細胞上清和細胞,檢測熒光素酶的表達情況,并用生產(chǎn)廠商提供的陽性對照質(zhì)粒pNL-sNLuc和相應(yīng)去除sNLuc編碼序列的隱形對照質(zhì)粒pNL-blank分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,作為陰性對照和陽性對照。結(jié)果如附圖5所示,無論有無共同轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒pC,5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc中的NLuc和sNLuc蛋白均可以有效的表達。此外,以本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體質(zhì)粒5dCG和在其基礎(chǔ)上攜帶有紅色和綠色熒光蛋白基因的重組乙肝病毒質(zhì)粒5dCG-DsRed及5dCG-EGFP分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,或者與表達野生型病毒核心蛋白的輔助質(zhì)粒pC共同轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,轉(zhuǎn)染后48h用熒光顯微鏡觀察,并用5dCG做陰性對照。結(jié)果如如附圖6所示,無論有無共同轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒pC,本發(fā)明的重組乙肝病毒載體5dCG攜帶的外源基因編碼的紅色和綠色熒光蛋白均可以有效表達。

實施例4:檢測重組病毒顆粒的完整性

本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體5dCG質(zhì)粒及5dCG中插入NLuc和sNLuc編碼序列的重組乙肝病毒質(zhì)粒5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc與乙肝病毒表面蛋白表達質(zhì)粒pLMS及核心蛋白表達質(zhì)粒pC共同轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Huh7細胞,轉(zhuǎn)染后72h收集細胞上清,用抗PreS1(位于 大表面蛋白的氨基端)的抗體做pulldown實驗,并利用核酸雜交的方法檢測是否有包含病毒基因組DNA的成熟病毒粒子被pulldown。5dCG、5dCG-NLuc和5dCG-sNLuc單獨轉(zhuǎn)染的細胞上清作為對照,用轉(zhuǎn)染野生型乙肝病毒質(zhì)粒WT、以及5c3c載體單獨或與pLMS共轉(zhuǎn)的細胞上清作為另一組對照。如附圖8所示,在有pC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)條件下,5dCG及其攜帶外源序列的衍生構(gòu)建物不論是否與pLMS共轉(zhuǎn),重組病毒基因組均能復(fù)制,但只有在反式提供表面蛋白的情況下,才能形成并分泌可以被PreS1抗體pulldown的完整病毒顆粒。5c3c載體基因組復(fù)制不需要共轉(zhuǎn)pC質(zhì)粒,但完整病毒粒子形成與分泌同樣依賴于pLMS質(zhì)粒反式提供表面蛋白。野生型病毒質(zhì)粒則可以獨立完成基因組復(fù)制和完整病毒粒子形成與分泌。

實驗結(jié)果表明,本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體能使插入的外源基因表達,對插入序列特征無特殊要求,重組乙肝病毒基因組當(dāng)且僅當(dāng)存在野生型核心蛋白輔助時可高效復(fù)制,并當(dāng)且僅當(dāng)同時還存在野生型表面蛋白輔助的情況下,有效形成并分泌完整的重組乙肝病毒顆粒,相對于已公開的重組人乙肝病毒載體5c3c顯著提高了易用性和安全性,表明本發(fā)明的重組人乙肝病毒載體作為肝臟特異性的基因?qū)胼d體具有良好應(yīng)用前景。

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