本發(fā)明涉及一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的試劑盒，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：已發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的的疾病與所謂的體內(nèi)活性氧水平失調(diào)有關(guān)，但目前體內(nèi)活性氧水平相關(guān)的動(dòng)物模型多為小鼠，導(dǎo)致研究周期長(zhǎng)、費(fèi)用高，而且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量。大家急需一種簡(jiǎn)便、低費(fèi)用，且可實(shí)現(xiàn)高通量的體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒。新模式生物秀麗隱桿線蟲的isp-1基因編碼線粒體呼吸鏈復(fù)合體III的Rieske鐵硫蛋白(Rieskeironsulphurprotein,ISP)催化亞基，該復(fù)合體主要催化電子由泛醌傳遞到細(xì)胞色素c(cytochromec,cytc)，該基因部分功能缺失會(huì)引起電子傳遞減弱，體內(nèi)活性氧水平下降，個(gè)體的壽命延長(zhǎng)。該亞基的序列在所有線粒體及好氧細(xì)菌中高度保守。研究表明，isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲表現(xiàn)低耗氧，長(zhǎng)壽，發(fā)育緩慢等特征。因此如果能建立以isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲為模型的試劑盒，則可建成一種簡(jiǎn)便、低費(fèi)用，且可實(shí)現(xiàn)高通量的體內(nèi)活性氧水平下降的動(dòng)物模型試劑盒，這將極大方便科研人員研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病。本發(fā)明利用秀麗隱桿線蟲作為模式生物，構(gòu)建isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的試劑盒。本發(fā)明建立的以秀麗隱桿線蟲為體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的試劑盒，該試劑盒中的秀麗隱桿線蟲可以模擬動(dòng)物體內(nèi)總活性氧含量降低的狀態(tài)，可用于研究體內(nèi)活性氧水平失調(diào)對(duì)機(jī) 體各種生理生化代謝過(guò)程的影響，為研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病的科研工作者提供了一種工具。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明主要提供一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的試劑盒，該試劑盒使用方法簡(jiǎn)單易行、成本低廉，本發(fā)明建立的以秀麗隱桿線蟲為體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的試劑盒，該試劑盒中的秀麗隱桿線蟲可以模擬動(dòng)物體內(nèi)活性氧含量降低的狀態(tài)，可用于研究體內(nèi)活性氧水平失調(diào)對(duì)機(jī)體各種生理生化代謝過(guò)程的影響，為研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病的科研工作者提供了一種工具。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供上述體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒的使用方法，本發(fā)明利用isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲作為動(dòng)物模型，操作簡(jiǎn)單、快速。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的試劑盒，所述試劑盒包括的材料為：①isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲；②NGM培養(yǎng)基；③大腸桿菌OP50。所述的isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲是通過(guò)分子生物學(xué)手段將秀麗隱桿線蟲isp-1基因片段插入到質(zhì)粒載體上，并將其轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，構(gòu)建克隆菌，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的克隆菌表達(dá)isp-1的dsRNA，給秀麗隱桿線蟲飼喂克隆菌，即建立isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲。其中，所述isp-1基因片段是用PCR的方法從秀麗隱桿線蟲基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)的。其中，所述質(zhì)粒載體為質(zhì)粒L4440(pPD129.36)，宿主細(xì)胞為大腸桿菌 HT115(DE3)。其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法為：將isp-1基因片段插入到質(zhì)粒L4440(pPD129.36)兩個(gè)反向T7啟動(dòng)子之間的多克隆位點(diǎn)處構(gòu)建重組質(zhì)粒。其中，所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的重組克隆菌時(shí)所用的誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。本發(fā)明還提供一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒在篩選治療體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病藥物中的應(yīng)用，所述活性氧水平失調(diào)是由活性氧下降引起的。本發(fā)明還提供一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒在篩選治療體內(nèi)代謝異常藥物中的應(yīng)用，所述代謝異常是活性氧下降所引起的。本發(fā)明還提供一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒在研究體內(nèi)活性氧升高對(duì)機(jī)體各種生理生化代謝過(guò)程的影響中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供上述體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒的使用方法，將isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲用鎳鉻絲挑針?lè)謩e轉(zhuǎn)移到含有待測(cè)化合物的NGM培養(yǎng)基平板和不含有待測(cè)化合物的NGM培養(yǎng)基平板上，不含有待測(cè)化合物的NGM培養(yǎng)基平板作為空白對(duì)照組，每塊平板上接種25條isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲，待測(cè)化合物組與空白對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行，上述平板均接種大腸桿菌OP50作為秀麗隱桿線蟲食物，每天計(jì)數(shù)待測(cè)化合物組與空白對(duì)照組的秀麗隱桿線蟲的存活條數(shù)，直至平板上所有的秀麗隱桿線蟲全部死亡，計(jì)算待測(cè)化合物組與空白對(duì)照組中秀麗隱桿線蟲的壽命。同以前的方法相比，本發(fā)明存在以下優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明利用秀麗隱桿線蟲作為模式生物，構(gòu)建isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒，該藥物試劑盒具有操作簡(jiǎn)單、 快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，為研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病的科研工作者提供了一種工具。附圖說(shuō)明圖1為質(zhì)粒L4440的圖譜。圖2為秀麗隱桿線蟲isp-1基因RNAi后對(duì)應(yīng)基因mRNA表達(dá)量的變化。圖3秀麗隱桿線蟲isp-1基因RNAi后體內(nèi)活性氧含量的變化。圖4為PQ對(duì)isp-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命的影響。圖5為NAC對(duì)isp-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命的影響。圖6為PQ對(duì)isp-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響。圖7為NAC對(duì)isp-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響。圖8為PQ對(duì)isp-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力的影響。圖9為NAC對(duì)isp-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力的影響。具體實(shí)施方式以下提供具體實(shí)施例以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的試劑盒，但不限于這些實(shí)施例。1.生物材料(1)秀麗隱桿線蟲株系：秀麗隱桿線蟲野生型N2，購(gòu)自CaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。(2)大腸桿菌：E.coliHT115(DE3)，作為重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，CaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)；E.coliOP50，作為秀麗隱桿秀麗隱桿線蟲正常的食物，購(gòu)自CaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。(3)質(zhì)粒載體：L4440(pPD129.36)，RNAi質(zhì)粒載體，購(gòu)于Addgene。2.試劑(1)50×TAEBuffer：242gTris堿，57mL乙酸，100mL0.5mol/L的EDTA(pH8.0)，用蒸餾水定容至1000mL，使用時(shí)根據(jù)要求用蒸餾水進(jìn)行稀釋。(2)1％瓊脂糖粉：將1g瓊脂糖粉溶于100mL1×TAEBuffer中，用微波爐加熱，使瓊脂糖粉完全溶解，室溫冷卻至60℃左右時(shí)加入適量溴化乙錠(EB)，充分混勻后倒入膠槽，插入合適的梳子，待凝膠完全凝固后拔去梳子即可使用。(3)鹽酸四環(huán)素(TetracyclineHydrochloride，Tet)：水溶，過(guò)濾除菌，母液濃度為25mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(4)氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)：水溶，過(guò)濾除菌，母液濃度為100mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(5)CaCl2：水溶，高溫高壓(121℃，20min)滅菌，儲(chǔ)存濃度為1mol/L，4℃保存。(6)限制性內(nèi)切酶：BglII、XhoI、HindIII(購(gòu)自TaKaRa公司)(7)T4連接酶(購(gòu)自TaKaRa)(8)DL-2000DNAmaker和DL-10000DNAmaker(購(gòu)自TaKaRa)(9)6×LoadingBuffer(購(gòu)自TaKaRa)(10)膽固醇(Cholesterol)：醇溶，過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存濃度為5mg/mL，4℃避光保存(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。(11)MgSO4：水溶，高溫高壓(121℃，20min)滅菌，儲(chǔ)存濃度為1mol/L，室溫保存。(12)S基礎(chǔ)液：NaCl0.585g，K2HPO40.1g，KH2PO40.6g，用蒸餾水 定容至100mL。(13)半飽和KCl溶液：向適量體積的蒸餾水中加入過(guò)量KCl，充分?jǐn)嚢瑁谷芤哼_(dá)到飽和狀態(tài)，過(guò)濾上清，將濾液與蒸餾水按照1:1(v:v)的比例混勻，即為半飽和KCl溶液。(14)連二亞硫酸鈉：保險(xiǎn)粉，分子式：NaO2SSO2Na。(15)4％Na2CO3溶液：4gNa2CO3溶解于100mL蒸餾水中，室溫保存。(16)2％NaOH溶液：0.8gNaOH溶解于100mL蒸餾水中，室溫保存。(17)0.04mol/LCuSO4溶液：1g硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100ml蒸餾水中，室溫保存。(18)0.1mol/L酒石酸鉀溶液：2g酒石酸鉀溶解于100ml蒸餾水中，室溫保存。(19)Folin-Ciocalteu’s：福林酚試劑(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(20)M9緩沖液：NaCl5g，Na2HPO46g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O0.25g，用蒸餾水定容至1000mL。(21)堿性硫酸銅溶液：(A)將0.1mol/L酒石酸鉀溶液和0.04mol/LCuSO4溶液等體積混合均勻，(B)將4％Na2CO3溶液和2％NaOH溶液等體積混合均勻，然后將(A)液和(B)液按照50:1(v:v)的比例混合即可。現(xiàn)配現(xiàn)用。3.試劑盒(1)基因組提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)(2)質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(PlasmidMiniKitI,TaKaRa)(3)DNA膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKit,購(gòu)自TaKaRa)(4)總RNA提取試劑盒(RNAisoPlus,購(gòu)自TaKaRa)(5)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRTreagentKit,購(gòu)自TaKaRa)(6)熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(PremixExTaqTMII,購(gòu)自TaKaRa)4.培養(yǎng)基(1)NGM(NematodeGrowthMedium)培養(yǎng)基：配制如下(500mL):NaCl1.52gKH2PO48.52gK2HPO41.15g胰蛋白胨1.36g瓊脂粉8.58g配制方法：稱取上述物質(zhì)(除瓊脂粉之外)于錐形瓶中，加入500mL蒸餾水，使各組分充分溶解，再加入瓊脂粉。高溫高壓(121℃，20min)滅菌，分別加入1mol/L的MgSO4500μL，1mol/L的CaCl2500μL，5mg/mL的膽固醇500μL，充分搖勻，待瓶?jī)?nèi)泡沫消失后倒板。如需NGM(RNAi誘導(dǎo))培養(yǎng)基，在NGM培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓(121℃，20min)滅菌后，分別加入500μL1mol/L的MgSO4，500μL1mol/L的CaCl2，500μL5mg/mL的膽固醇，待培養(yǎng)基冷卻至60-70℃時(shí)加入100mg/mLAmp母液至終濃度為100μg/mL，25mg/mLTet母液至終濃度為5μg/mL，1mol/LIPTG母液至終濃度為0.1mmol/L，充分搖勻，待瓶?jī)?nèi)泡沫消失后倒板。(2)LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：配置如下(50mL)NaCl0.50g胰蛋白胨0.50g酵母膏0.25g配制方法：稱取上述物質(zhì)于錐形瓶中，加入50mL蒸餾水，使各組分充分溶解，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，高溫高壓(121℃，20min)滅菌，4℃保存。如需LB固體培養(yǎng)基，按1.6-1.8％(w:v)的比例加入AgarPowder即可。如需LB(Amp+Tet)液體培養(yǎng)基，在LB液體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓(121℃，20min)滅菌后，冷卻至60-70℃時(shí)加入100mg/mLAmp母液至終濃度為100μg/mL，25mg/mLTet母液至終濃度為5μg/mL。4℃保存。如需LB(Amp+Tet)固體培養(yǎng)基，在LB固體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓(121℃，20min)滅菌后，冷卻至60-70℃時(shí)加入100mg/mLAmp母液至終濃度為100μg/mL，25mg/mLTet母液至終濃度為5μg/mL，充分搖勻，待瓶?jī)?nèi)泡沫消失后倒板。5.主要儀器超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(日立)；恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科技有限公司)；微量移液器(Eppendorf)；PCR儀(ABI公司)；水平電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GE公司)；超純水儀(Millipore)；恒溫金屬浴(北京鼎昊源科技有限公司)；連續(xù)變倍體視顯微鏡(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(上海精科)；液態(tài)氧電極(Hansatech公司)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad公司)；實(shí)施例1秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的建立1.線粒體呼吸鏈isp-1基因RNAi克隆菌的構(gòu)建(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)Wormbase數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)序列信息設(shè)計(jì)合成isp-1基因的特異性的 引物。具體序列如下：表1目的基因片段擴(kuò)增引物isp-1基因的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1074bp，其余為酶切位點(diǎn)。(2)秀麗隱桿線蟲基因組DNA的提取用基因組提取試劑盒提取秀麗隱桿線蟲基因組DNA。具體操作步驟詳見試劑盒說(shuō)明書。(3)isp-1基因片段的擴(kuò)增使用表1中的引物，利用PCR技術(shù)從秀麗隱桿線蟲基因組DNA中擴(kuò)增isp-1基因的片段。PCR反應(yīng)體系如下：表2擴(kuò)增isp-1基因片段的PCR反應(yīng)體系PCR的反應(yīng)程序如下：94℃3min；之后進(jìn)入PCR循環(huán)，具體為：94℃30s，55℃30s，72℃1min，總共進(jìn)行30個(gè)cycles；72℃5min；4℃保存。1.0％的Agarosegel電泳鑒定PCR后得到的isp-1基因片段的純度和濃度。(4)isp-1基因片段的雙酶切使用BglII和XhoI限制性內(nèi)切酶對(duì)上一步驟中得到的isp-1基因片段進(jìn)行雙酶切。isp-1基因雙酶切體系如下：表3isp-1基因片段的雙酶切體系37℃進(jìn)行酶切2小時(shí)，將雙酶切的產(chǎn)物進(jìn)行1.0％的Agarosegel電泳，再用DNA膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKit,TaKaRa)回收酶切產(chǎn)物片段。(5)質(zhì)粒L4440的制備將帶有L4440質(zhì)粒的E.coliHT115(DE3)菌株在LB(Amp+Tet)固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)16h，挑取平板上培養(yǎng)出的單菌落于5mlLB(Amp+Tet)液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，震蕩培養(yǎng)16h，用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(PlasmidMiniKitI,TaKaRa)提取質(zhì)粒。將提取的pPD129.36(L4440)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。isp-1基因?yàn)檫B接對(duì)象，雙酶切體系如下：表4與isp-1基因片段連接的質(zhì)粒L4440的雙酶切體系37℃進(jìn)行酶切2小時(shí)，將雙酶切的產(chǎn)物進(jìn)行1.0％的Agarosegel電泳，用DNA膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKit,TaKaRa)回收酶切產(chǎn)物中的目的基因片段。(6)isp-1基因片段和質(zhì)粒的連接通過(guò)1.0％的Agarosegel電泳鑒定質(zhì)粒和目的片段之間的摩爾數(shù)關(guān)系，雙酶切后回收的載體片段與回收的目的基因片段之間的摩爾數(shù)比以1:10為宜，然后在連接酶的作用下將載體與isp-1基因片段連接。連接體系如下：表5連接體系16℃連接4h即完成連接，得到連接產(chǎn)物。(7)E.coliHT115(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，制備感受態(tài)細(xì)胞，具體操作如下：1、取HT115(DE3)菌液1.5ml于離心管中，4℃4000rpm離心5min，棄上清，重復(fù)此過(guò)程兩次。2、向留有沉淀的試管中加入預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液800μL，清洗菌體，4℃4000rpm離心5min。3、徹底除去殘液，向試管內(nèi)加入預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液200μl，懸浮菌體。即感受態(tài)細(xì)胞制備完成。(8)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliHT115(DE3)、篩選陽(yáng)性克隆及其鑒定將10μL連接產(chǎn)物加入到200μL冰浴上放置的E.coliHT115(DE3)感受態(tài)細(xì)胞溶液中，42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min。向試管中加入800μLLB液體培養(yǎng)基，37℃，150rpm復(fù)蘇1h，再將培養(yǎng)物涂到LB(Amp+Tet)固體平板上，37℃培養(yǎng)16h，之后挑單菌落于1mlLB液體(Amp+Tet)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)5h，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將得到的菌液進(jìn)行菌液PCR。PCR反應(yīng)體系如下：表6菌液PCR驗(yàn)證體系PCR的反應(yīng)程序如下：94℃5mim；之后進(jìn)入PCR循環(huán)，具體為：94℃15s，55℃15s，72℃1min，總共進(jìn)行30個(gè)cycles；72℃15min；4℃保存。將上述鑒定的PCR陽(yáng)性克隆菌液用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(PlasmidMiniKitI,TaKaRa)提取質(zhì)粒，然后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。不同基因陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒使用不同的限制性內(nèi)切酶。isp-1基因酶切體系如下：表7經(jīng)菌液PCR鑒定的isp-1陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒酶切驗(yàn)證體系1.0％Agarosegel電泳鑒定，分子量大小與理論推斷相符合，將樣品送出測(cè)序，經(jīng)blast在線比對(duì)，結(jié)果表明測(cè)序結(jié)果與已知的isp-1序列一致。即證明RNAi克隆菌(L4440-isp-1-HT115)構(gòu)建完成。isp-1測(cè)序結(jié)果AGATATACGACTCCTATAGGGAGACCGGCAGATCTACGTCCAGAAGCGTCGTAGTGAGATCCGTGACAAGGGCAGTAATAACCTCCGTAATCTCCAGCATCGGCTGAAAATTCAAAATATGATTTCAAAAATTCAGGAGAAAAAAGACTGCATACCAATTGGGACACATCCAAGATGGGTGCACACTCCAATGACAACGGACCATTCATCTTTCTGCACACGTTCGTCGTCATGTTGTGGATGACGGAGATCGGCGACAGGGACGGCCTTTTCCTTGGCAATCTCAGCCTTGGTACGATGTTTGACGAAGACTGGCTTTCCACGCCATTCGAATGTCTTTGTTTTTCCTTCTGGAATATCAGCCATGTTGATTTCGATCGAAGCCAAGGCACGTTGATCAGCTGCCATAGCCTGGAAAAATTAATTTAAAAACGGTGTAATGGAAATTCAACATACTTTGTAAGAAACAAGAGTCTGTACAACTTCCTTTCCGGCCCACAAAGATAGAACTCCTCCAGCTGTAATAAAACAATGTTTAGACCGAATAAAAAATAATTCGAACCTCCATAATACAGAGCAGTTGGAAGAGCACGACGTTGATCCTCGGTGTCACGGGCTGGCACTTGAGTGTTCTTTGTAGAATCACGACGATAGTTTGACATATCGGGGAATGTCACATCAGTGTGAGCCAAACGGCGAGAGGTGACTTAAAAATTAATGAATTAATATATTAAATTCAATTTCAAATACCATTGATTCCCTTGACAGCAAGTCCATTGGTGAAGACACCTCCGGTGCTGTGACTAACAGCGGCTTGACGAGCTTCAGCCGTGGAGAACTCAGCTGGAACATCGCGGAAAGCAGCGACCTGGATACTAGACAATAAAATAATATTCTGCAACTTTAAATACTTACATTATCGGCGGCTGGTGTTGCGGCAACAAAGTTTACATGTTGCTGGGATCCGCTGATCTGAAAGAAAACTATTTATAAACTATTGGACAAATTTTAGAACTGTAATCGATATCTTAATCATTTCGACACCGTCCAGTGTTTTGGAACGAGAATAGTTTAAACAAATACATTTTAAACAAAATTTTCGAACCGCGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATT CGCCCTAAAGTGGAGTCGAAT2.秀麗隱桿秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型的建立(1)秀麗隱桿線蟲的同步化①挑選成熟的秀麗隱桿線蟲至裝有1mlM9液的2ml離心管中，4000rpm離心5分鐘，去上清；②向離心管中加入500μL1M氫氧化鈉，500μL6.4％(V/V)次氯酸鈉，震蕩裂解；③去掉上清，向沉淀中加入1.5μLM9液，搖勻，4000rpm離心5分鐘，重復(fù)該步驟三次；④向洗凈的卵中加入500μLM9液，18℃24小時(shí)孵化成L1期秀麗隱桿線蟲。(2)秀麗隱桿線蟲的RNAi處理使用NGM(RNAi誘導(dǎo))培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基表面均勻涂布RNAi克隆菌(L4440-isp-1-HT115)，37℃培養(yǎng)16h，然后將同步化的L1期N2秀麗隱桿線蟲定量接到涂有RNAi克隆菌的NGM(RNAi誘導(dǎo))平板上(秀麗隱桿線蟲以大腸桿菌作為唯一食物)，20℃培養(yǎng)至成蟲,即得到體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的動(dòng)物。(3)秀麗隱桿線蟲總RNA的提取收集經(jīng)RNAi處理的秀麗隱桿線蟲，用M9緩沖液清洗秀麗隱桿線蟲3次，盡量除去秀麗隱桿線蟲體壁附著的RNAi克隆菌。然后按照總RNA提取試劑盒(RNAisoPlus,TaKaRa)的說(shuō)明書提取秀麗隱桿線蟲的總RNA，取2μL所提的總RNA樣品，加2μLddH2O，1μL6×LoadingBuffer，共5μL加入點(diǎn)樣空，1.0％的Agarosegel電泳。將本步驟中驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆樣品進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)blast在線比對(duì)，結(jié)果表明 測(cè)序結(jié)果與已知的isp-1序列一致。(4)cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRTreagentKit,TaKaRa)的說(shuō)明書將(3)中提取的秀麗隱桿線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。共兩個(gè)反應(yīng)，即去除基因組DNA反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序按照說(shuō)明書進(jìn)行。將得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放在4℃保存。如需長(zhǎng)期保存，可放在-20℃。(5)引物設(shè)計(jì)通過(guò)Wormbase數(shù)據(jù)庫(kù)(www.wormbase.org)檢索C.elegans的isp-1及內(nèi)參β-actin基因的序列，用PrimerPremier5.0，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物。所設(shè)計(jì)的引物序列見表8。表8實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因擴(kuò)增引物(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線的驗(yàn)證將秀麗隱桿線蟲cDNA以10倍稀釋倍數(shù)稀釋六個(gè)濃度，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，并以這些梯度cDNA作為模板，用isp-1及β-actin的引物，做熒光實(shí)時(shí)定量PCR，得到對(duì)應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為：表9實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：1)STAGE1，95℃預(yù)變性2min2)STAGE2，95℃變性10s3)STAGE3，50℃退火30sSTAGE2和STAGE3循環(huán)38次，并檢測(cè)熒光；4)STAGE4，60℃升溫至95℃，每3s升溫0.5℃；分析溶解曲線，記錄熒光值；5)STAGE5，95℃10s6)STAGE6，60℃30s7)STAGE7，4℃∞結(jié)果表明：所有基因的擴(kuò)增效率均達(dá)到100％±10％，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值也達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求。isp-1及內(nèi)參基因β-actin的溶解曲線均為單一對(duì)稱峰，無(wú)引物二聚體，擴(kuò)增反應(yīng)特異性良好。(7)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量以(4)得到的cDNA為模板，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量。(8)isp-1基因的相對(duì)表達(dá)量以處理組的cDNA為模板進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。β-actin作為內(nèi)參基因，2-△△Ct計(jì)算方法計(jì)算基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t法計(jì)算公式為：相對(duì)含量％＝2-△△Ct△Ct＝CT待測(cè)樣品-CT對(duì)照樣品△△Ct＝△Ct靶基因-△Ct內(nèi)參基因利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)秀麗隱桿線蟲isp-1基因RNAi的效率。秀麗隱桿線蟲RNAi空載體組為陰性對(duì)照組，isp-1基因表達(dá)量與喂食E.coliOP50的空白組秀麗隱桿線蟲相關(guān)基因表達(dá)量相比無(wú)明顯變化，這說(shuō)明飼喂帶有空載體L4440的E.coliHT115菌并不影響秀麗隱桿線蟲中isp-1的基因表達(dá)。從圖2中可以看出，isp-1基因被沉默之后，其mRNA的表達(dá)量只有陰性對(duì)照組的19.76％，干擾效率達(dá)到了80.24％。實(shí)施例2體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒的裝配本發(fā)明所述的體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒，所述試劑盒包括的材料為：①isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲；②NGM培養(yǎng)基；③大腸桿菌OP50。其中，所述秀麗隱桿線蟲的濃度為100條/20μl，大腸桿菌OP50的濃度為10mg/ml。將以上試劑分裝于合適的容器中，放置到外包試劑盒中，其中M9緩沖液、S緩沖液、LB培養(yǎng)基詳細(xì)記載于使用說(shuō)明書中。實(shí)施例3秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)模型的驗(yàn)證1.秀麗隱桿線蟲mev-1基因RNAi后總活性氧含量的測(cè)定(1)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)總活性氧含量的檢測(cè)取實(shí)施例1構(gòu)建的體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的動(dòng)物模型，用M9緩沖液清洗秀麗隱桿線蟲3次，盡量洗去秀麗隱桿線蟲蟲體上的RNAi克隆菌。將每個(gè)處理組的秀麗隱桿線蟲用S基礎(chǔ)液進(jìn)行稀釋，使每20μL中含有25條秀麗隱桿線蟲，將每個(gè)處理組的稀釋好的秀麗隱桿線蟲液準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移至底透384微孔板中，每個(gè) 孔加40μL秀麗隱桿線蟲液，每個(gè)處理組做3個(gè)復(fù)孔，然后在避光條件下加活性氧熒光染料H2DCF-DA，染料濃度為50mmol/L，每個(gè)孔準(zhǔn)確加入10μL。暗室反應(yīng)15min后，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為504nm，發(fā)射波長(zhǎng)為529nm，檢測(cè)溫度為28℃。秀麗隱桿線蟲RNAi空載體組為陰性對(duì)照組，按上面方法做同樣處理，測(cè)定總活性氧含量。(2)秀麗隱桿線蟲isp-1基因RNAi后體內(nèi)總活性氧含量的變化用ROS熒光探針H2DCF-DA檢測(cè)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)總活性氧含量的變化，結(jié)果如圖3所示：isp-1基因被干擾之后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧含量顯著降低(p＜0.05)。實(shí)施例4體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒的使用方法和可靠性驗(yàn)證體內(nèi)活性氧水平失調(diào)相關(guān)疾病研究的一個(gè)重要內(nèi)容是篩選出能夠回調(diào)體內(nèi)活性氧水平的新化合物，這些化合物具有成為治療體內(nèi)活性氧水平失調(diào)相關(guān)疾病的潛力。本實(shí)施例就驗(yàn)證了體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒在這方面的應(yīng)用。本實(shí)施例以抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸、氧化劑百草枯作為供試樣品驗(yàn)證體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動(dòng)物模型試劑盒的可靠性。1.試劑1)抗氧化劑：N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)：水溶，過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存濃度為1mol/L，-20℃避光保存(購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)。2)氧化劑：百草枯(Paraquat，PQ)：水溶，過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存濃度為50mmol/L，-20℃避光保存(購(gòu)自Sigma公司)。1.實(shí)驗(yàn)方法：(1)PQ及NAC對(duì)RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命的影響將isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲用鎳鉻絲挑針?lè)謩e轉(zhuǎn)移到NGM(0.1mmol/LPQ)，NGM(0.5mmol/LPQ)，NGM(0.4mmol/LNAC)，NGM(2.0mmol/LNAC)和NGM培養(yǎng)基上，不含有待測(cè)化合物的NGM培養(yǎng)基平板作為空白對(duì)照組，每塊平板上接種25條isp-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲，待測(cè)化合物組與空白對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行，每天計(jì)數(shù)待測(cè)化合物組與空白對(duì)照組的秀麗隱桿線蟲的存活條數(shù)，直至平板上所有的秀麗隱桿線蟲全部死亡，計(jì)算待測(cè)化合物組與空白對(duì)照組中秀麗隱桿線蟲的壽命。為防止世代交替，在線蟲產(chǎn)卵期期間每隔一天將秀麗隱桿線蟲挑到新的處理板上。計(jì)算待測(cè)化合物組與空白對(duì)照組中秀麗隱桿線蟲的壽命。同時(shí)設(shè)定L4440組，L4440組接入的秀麗隱桿線蟲為轉(zhuǎn)入空載體L4400(不含有isp-1基因片段)的N2秀麗隱桿線蟲，將含有空載體L4400的N2秀麗隱桿線蟲接入到NGM培養(yǎng)基(不含有待測(cè)物)上，其他操作同上。用SPSS軟件進(jìn)行Kaplan-Meier壽命分析，抗氧化劑NAC對(duì)isp-1RNAi后線蟲的壽命無(wú)顯著影響(p>0.05)；氧化劑PQ可使isp-1RNAi秀麗隱桿線蟲的壽命顯著延長(zhǎng)(p<0.05)，兩兩比較(PairwiseComparisons)比較結(jié)果如下：表10PQ處理isp-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命結(jié)果兩兩比較L4440isp-1RNAiisp-1RNAi+0.1PQisp-1RNAi+0.5PQL4440isp-1RNAip＝0.035isp-1RNAi+0.1PQp＝0.000p＝0.022isp-1RNAi+0.5PQp＝0.000p＝0.005p＝0.925從表10中可以看出，isp-1RNAi處理組秀麗隱桿線蟲的壽命明顯大于L4440組，該結(jié)果與已有文獻(xiàn)中的報(bào)道相符合。用PQ處理isp-1RNAi后的秀麗隱桿線蟲，秀麗隱桿線蟲的壽命相比isp-1RNAi處理組顯著延長(zhǎng)(p<0.05)，在一定濃度范圍內(nèi)，這種作用與PQ的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。秀麗隱桿線蟲經(jīng)過(guò)isp-1RNAi處理之后，其中位生存時(shí)間和平均壽命都有所增加；PQ(0.1mmol/L和0.5mmol/L)能進(jìn)一步延長(zhǎng)isp-1RNAi秀麗隱桿線蟲的中位生存時(shí)間和平均壽命。如表11所示，PQ(0.1mmol/L)使isp-1RNAi秀麗隱桿線蟲的中位生存時(shí)間和平均壽命延長(zhǎng)了30.0％和23.8％；PQ(0.5mmol/L)使isp-1RNAi線蟲的中位生存時(shí)間和平均壽命大約延長(zhǎng)了40.0％和29.7％。表11PQ作用isp-1基因RNAi秀麗隱桿線蟲后壽命的中位生存時(shí)間和平均壽命組別中位生存時(shí)間平均壽命L44408.0±0.98.2±0.5isp-1RNAi10.0±1.210.1±0.7isp-1RNAi+0.1PQ13.0±0.912.5±0.8A％130.0123.8isp-1RNAi+0.5PQ14.0±0.813.1±0.7B％140.0129.7A％＝(isp-1RNAi+0.1PQ)/isp-1RNAi；B％＝(isp-1RNAi+0.5PQ)/isp-1RNAi(2)PQ及NAC對(duì)RNAi后秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響將經(jīng)過(guò)isp-1RNAi處理的N2成蟲用鎳鉻絲挑針?lè)謩e轉(zhuǎn)移到NGM(0.1mmol/LPQ)，NGM(0.5mmol/LPQ)，NGM(0.4mmol/LNAC)，NGM(2.0mmol/LNAC)和NGM培養(yǎng)基上，計(jì)數(shù)10日齡成蟲的運(yùn)動(dòng)能力。運(yùn)動(dòng)能力的評(píng)價(jià)分為MotionA和MotionB兩個(gè)等級(jí)，其中MotionA為線蟲表現(xiàn)非常活躍，運(yùn)動(dòng) 軌跡呈正常的正弦曲線；MotionB為線蟲在培養(yǎng)基上行動(dòng)緩慢，用鎳鉻絲輕觸線蟲身體，線蟲只是頭部擺動(dòng)。從圖6和圖7中可以看出，isp-1基因被干擾的線蟲與L4440對(duì)照組相比，其運(yùn)動(dòng)能力傾向于正常。用PQ(0.1mmol/L和0.5mmol/L)處理干擾后的線蟲，發(fā)現(xiàn)其運(yùn)動(dòng)能力相對(duì)干擾組的線蟲傾向于提高。用NAC處理isp-1基因被干擾的線蟲，各處理組之間沒(méi)有明顯變化，但是隨著NAC濃度的升高，isp-1基因被干擾的線蟲的運(yùn)動(dòng)能力有減弱的趨勢(shì)。(3)PQ及NAC對(duì)RNAi后秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力的影響將經(jīng)過(guò)isp-1RNAi處理的N2成蟲用鎳鉻絲挑針?lè)謩e轉(zhuǎn)移到NGM(0.1mmol/LPQ)，NGM(0.5mmol/LPQ)，NGM(0.4mmol/LNAC)，NGM(2.0mmol/LNAC)和NGM培養(yǎng)基上，3天之后將線蟲轉(zhuǎn)移至35℃，8小時(shí)之后，每隔半小時(shí)觀察對(duì)照組線蟲的存活率，當(dāng)對(duì)照組線蟲的死亡率大于50％時(shí)，開始計(jì)數(shù)其他所有組別線蟲的死亡率。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行統(tǒng)計(jì)30條線蟲。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，isp-1RNAi各處理組線蟲的熱脅迫時(shí)間為16.5h，此時(shí)L4440對(duì)照組的線蟲已全部死亡，所以在圖5中沒(méi)有顯示L4440對(duì)照組的結(jié)果。如圖8和圖9所示，PQ對(duì)isp-1基因被干擾的秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力沒(méi)有顯著影響(p>0.05)，而高濃度的NAC對(duì)isp-1基因被干擾的秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力產(chǎn)生負(fù)影響。用PQ處理之后，發(fā)現(xiàn)線蟲的壽命比空白對(duì)照組有所延長(zhǎng)，在一定濃度范圍內(nèi)，線蟲的壽命與PQ濃度成正相關(guān)，線蟲第十天運(yùn)動(dòng)能力在PQ的作用下相比對(duì)照組也有增強(qiáng)的趨勢(shì)，抗熱脅迫能力也有所改進(jìn)。用NAC處理之后，發(fā)現(xiàn)線蟲的壽命相比對(duì)照組無(wú)明顯變化，第十天運(yùn)動(dòng)能力隨NAC濃度的升高有減弱的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了PQ對(duì)體內(nèi)活性氧水平異常的治療效果，同時(shí)也證明了本發(fā)明公開的試劑盒的可靠性，能夠用于篩選治療體內(nèi)活性氧水平失調(diào)相關(guān)疾病的藥物。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3