相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2014年9月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/054,073的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于對(duì)抗動(dòng)物中的口蹄疫病毒(fmdv)感染的組合物。本發(fā)明提供包含fmdv抗原的藥物組合物、抗fmdv的疫苗接種方法以及用于此類方法和組合物的試劑盒。發(fā)明背景口蹄疫(fmd)是影響農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的最具毒性和傳染性的疾病之一。該疾病在世界許多國(guó)家是地方性的，特別是在非洲、亞洲和南美洲。另外，疫情爆發(fā)也可以定期發(fā)生。在國(guó)家中的存在該疾病可能會(huì)由于生產(chǎn)力的喪失、感染畜群的體重和產(chǎn)奶量以及對(duì)這些國(guó)家的貿(mào)易禁運(yùn)而造成非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)后果。針對(duì)該疾病采取的措施包括嚴(yán)格執(zhí)行進(jìn)口限制、衛(wèi)生控制和檢疫、屠宰生病的動(dòng)物和使用滅活疫苗的疫苗接種程序，作為國(guó)家或區(qū)域一級(jí)的預(yù)防措施，或在疫情爆發(fā)時(shí)定期進(jìn)行。fmd的特點(diǎn)是其潛伏期短、傳染性強(qiáng)、口中和蹄上形成潰瘍以及有時(shí)候年輕動(dòng)物的死亡。fmd影響許多動(dòng)物物種，特別是牛、豬、綿羊和山羊。導(dǎo)致該疾病的介質(zhì)(agent)是屬于小核糖核酸病毒(picornaviridae)科家族的口蹄疫病毒(aphthovirus)屬的核糖核酸(rna)病毒(cooperetal.,intervirology,1978,10,165-180)。目前，已知至少有七種類型的口蹄疫病毒(fmdv)：歐洲型(a、o和c)、非洲型(sat1、sat2和sat3)和亞洲型(asia1)。還已經(jīng)區(qū)分了許多子類型(kleidetal.science(1981),214,1125-1129)。fmdv是直徑約25nm的裸露的二十面體病毒，其含有由約8500個(gè)核苷酸組成的具有正極性的單鏈rna分子。該rna分子包含單個(gè)開放閱讀框(orf)，其編碼單個(gè)多聚蛋白，其中尤其還含有衣殼前體，也稱為蛋白質(zhì)p1或p88。蛋白質(zhì)p1在其氨基末端被肉豆蔻酰化。在成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)p1被蛋白酶3c切割成稱為vp0、vp1和vp3的三個(gè)蛋白質(zhì)(或者分別為1ab、1d和1c；belshamg.j.，progressinbiophysicsandmolecularbiology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白質(zhì)vp0然后被切割成兩個(gè)蛋白質(zhì)vp4和vp2(或者分別為1a和1b)。將蛋白質(zhì)vp0轉(zhuǎn)化為vp4和vp2以及形成成熟病毒粒子的機(jī)制尚不清楚。蛋白質(zhì)vp1、vp2和vp3具有約26,000da的分子量，而蛋白質(zhì)vp4較小為約8,000da。衣殼蛋白的簡(jiǎn)單組合形成原聚體或5s分子，其是fmdv衣殼的基本組分。然后將該原聚體絡(luò)合成五聚體以形成12s分子。通過(guò)組裝12個(gè)12s五聚體從而構(gòu)成基因組rna分子，從而構(gòu)成146s顆粒，產(chǎn)生病毒粒子。也可以在其內(nèi)部不存在rna分子的情況下形成病毒衣殼(以下稱為“空衣殼”)?？找職ひ脖环Q為顆粒70s?？找職さ男纬煽梢栽诓《緩?fù)制過(guò)程中自然發(fā)生，或者可以通過(guò)化學(xué)處理人工產(chǎn)生。已經(jīng)對(duì)天然空衣殼進(jìn)行了一些研究。特別地，rowlands等人(rowlandsetal.,j.gen.virol.,1975,26,227-238)已經(jīng)顯示，a10口蹄疫病毒體主要包含四種蛋白質(zhì)vp1、vp2、vp3和vp4。相比之下，天然空衣殼(不是通過(guò)重組而是從a10口蹄疫病毒的培養(yǎng)物中純化得到的)基本上含有未切割的蛋白質(zhì)vp0；與a-pando口蹄疫病毒相同的結(jié)果由rweyemamu(rweyemamuetal.,archivesofvirology,1979,59,69-79)描述。在tris-edta存在下透析后并離心后得到的人造空衣殼不含蛋白質(zhì)vp4。根據(jù)rowlands等人，這些人造衣殼僅具有輕微的免疫原性，而如該作者注意到的，天然空衣殼僅在用甲醛處理以使其穩(wěn)定后具有免疫原性，而豚鼠的天然空衣殼誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答則是多變的。此外，rowlands等人和rweyemamu等人不同意需要穩(wěn)定天然空衣殼。對(duì)于rweyemamu等人，沒(méi)有用甲醛處理不會(huì)影響天然空衣殼的抗原性水平。免疫原性僅通過(guò)誘導(dǎo)豚鼠的中和抗體來(lái)測(cè)試。借助于昆蟲細(xì)胞中重組桿狀病毒將編碼該衣殼蛋白的前體p1的基因的表達(dá)與編碼與大腸桿菌(e.coli)中的蛋白酶3c相關(guān)的p1的基因的表達(dá)進(jìn)行比較(grubmanetal.,vaccine,1993,11,825-829；lewisetal.,j.virol.,1991,65,6572-6580)。大腸桿菌中p1和3c的共表達(dá)導(dǎo)致空衣殼70s的組裝。這兩種構(gòu)造的表達(dá)產(chǎn)物在豚鼠和豬中產(chǎn)生中和抗體。用p1/桿狀病毒構(gòu)造獲得的滴度低。這些相同的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)在豬中的部分保護(hù)。然而，受到免受該疾病侵害的保護(hù)的豬不能受到免受攻擊病毒的復(fù)制感染的保護(hù)。然而，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行肉豆蔻?；?，蛋白酶3c對(duì)該細(xì)胞有毒性。lewis等人得出結(jié)論，與病毒組成有關(guān)和在動(dòng)物中獲得最大保護(hù)所需的衣殼結(jié)構(gòu)的基本問(wèn)題尚未得到回答。此外，grubman等人認(rèn)為在配制疫苗之前需要穩(wěn)定空衣殼；在這一點(diǎn)上，他們同意關(guān)于從病毒培養(yǎng)物提取獲得的空衣殼所遇到的問(wèn)題(見(jiàn)上文)。含有蛋白質(zhì)p1的部分或全部的融合蛋白也已通過(guò)使用病毒載體即皰疹病毒或痘苗病毒獲得。ca-a-2,047,585特別描述了用于產(chǎn)生融合蛋白的牛皰疹病毒，所述融合蛋白含有與該牛皰疹病毒的糖蛋白gpiii融合的口蹄疫病毒的肽序列(結(jié)合于p1的氨基酸200至213的p1的氨基酸141至158)。病毒載體也已用于表達(dá)穩(wěn)定的fmdv空衣殼(us7,531,182)。最近，已將植物作為生產(chǎn)fmdv抗原的來(lái)源進(jìn)行了調(diào)查(us2011/0236416)。已經(jīng)發(fā)展了許多假設(shè)、研究路線和建議，試圖設(shè)計(jì)有效的抗fmd的疫苗。目前市場(chǎng)上僅有的疫苗含有滅活病毒。存在對(duì)fmdv疫苗安全性的擔(dān)憂，因?yàn)闅W洲fmd的爆發(fā)與疫苗制造的缺點(diǎn)有關(guān)(king,a.m.q.etal.,1981,nature293:479-480)。滅活的疫苗不賦予長(zhǎng)期免疫力，因此每年需要加強(qiáng)免疫注射，或者在發(fā)生疫情爆發(fā)時(shí)更頻繁。此外，在滅活疫苗的生產(chǎn)過(guò)程中存在與不完全滅活和/或病毒逃逸相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)(king,a.m.q.，出處同上)。本領(lǐng)域的目標(biāo)是構(gòu)建缺乏感染性fmdv基因組的構(gòu)象正確的免疫原，以制備有效且安全的疫苗。據(jù)報(bào)道，母體來(lái)源的抗體(mda)能夠抑制小牛(2歲以下的牛)抗fmd的疫苗接種的應(yīng)答(graves,1963,journalofimmunology91:251-256；brunetal.,1977,developmentsinbiologicalstandardisation,25:117-122)?？紤]到動(dòng)物(包括人，盡管很少)對(duì)fmdv的易感性，預(yù)防fmdv感染并保護(hù)動(dòng)物的方法是至關(guān)重要的。因此，需要抗fmdv的更有效且穩(wěn)定的疫苗。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含抗原性fmdv多肽及其片段和變體的組合物或疫苗，以及包含表達(dá)fmdv多肽及其片段和變體的重組病毒載體的組合物或疫苗。fmdv抗原及其片段和變體具有免疫原性和保護(hù)性的性質(zhì)。fmdv抗原可以由昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒表達(dá)載體產(chǎn)生。可以修飾fmdv抗原以增強(qiáng)fmdv空衣殼或fmdvvlp(病毒樣顆粒)的穩(wěn)定性。重組病毒載體可以是表達(dá)fmdv抗原的腺病毒載體?？乖嚯募捌淦魏妥凅w或重組病毒載體可以配制成疫苗和/或藥物組合物。這樣的疫苗或組合物可用于對(duì)動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種并給動(dòng)物提供免受同源和異源fmdv毒株的感染的保護(hù)。本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)保護(hù)普通動(dòng)物和母體來(lái)源的抗體陽(yáng)性(mda陽(yáng)性)動(dòng)物免受fmdv感染的方法。本發(fā)明還提供了包含至少一種抗原多肽或其片段或變體的試劑盒和使用說(shuō)明書。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明以下通過(guò)舉例的方式但并不旨在將本發(fā)明僅限于所描述的具體實(shí)施方案給出的發(fā)明詳述，可以結(jié)合附圖最好地理解，其中：圖1描繪了總結(jié)dna和蛋白質(zhì)序列的表。圖2代表表達(dá)的fmdv多聚蛋白和由3c的加工。圖3描繪了pmeb097的質(zhì)粒圖譜。圖4描繪了macmeb097的電鏡結(jié)果。圖5描繪了a24株的fmdv衣殼蛋白的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。圖6a和6b描繪了bacmeb099的電鏡和特異性elisa。圖7a-7d描繪了蛋白質(zhì)序列的序列比對(duì)。圖8描繪了fmdvvlp。圖9描繪了fmdva24cruzeiro中和抗體平均滴度的演化。圖10描繪了fmdva24cruzeiro中和抗體滴度。圖11a和11b描繪了fmdva24cruzeiro中和抗體平均滴度的演變。圖12a-12c描繪了攻擊后平均直腸溫度的演變。圖13描繪了在存在或不存在熱或酸的情況下具有或不具有共價(jià)籠突變的a24cruzeirovlp的em分析。圖14描繪了加熱后a24cruzeiro血清型的具有或不具有共價(jià)籠突變的vlp的elisa分析。圖15描繪了在5℃下存儲(chǔ)的具有或不具有共價(jià)籠突變的a24cruzeirovlp的隨時(shí)間的elisa分析。圖16描繪了顯示o1manisa共價(jià)籠vlp耐熱的elisa結(jié)果和em圖。圖17描繪了顯示o1manisa共價(jià)籠vlp在酸(上)和熱(下)中的穩(wěn)定性的elisa結(jié)果。圖18a描繪了疫苗接種和分析方案。圖18b描繪了抗fmdasia1shamir和fmda22iraq的中和抗體滴度的演變。圖19a描繪了體液應(yīng)答(記憶b細(xì)胞檢測(cè))方案。圖19b描述了asiashamir共價(jià)籠和iraqa22共價(jià)籠vlp血清學(xué)數(shù)據(jù)。圖20描繪了在第27天在接種fmdvvlp的動(dòng)物中的b細(xì)胞elispot測(cè)定。圖21描繪了在第43天在接種fmdvvlp的動(dòng)物中的b細(xì)胞elispot測(cè)定(測(cè)量b記憶細(xì)胞)。圖22描繪了在第27天在接種fmdvvlp的動(dòng)物中的特異性分泌γ干擾素(ifnγ)的細(xì)胞測(cè)定。圖23描繪了第42天各組的fmdvsvnlog10滴度。圖24描繪了在研究過(guò)程中的平均的fmdvvnlog10滴度(第0天至第42天)。圖25描繪了pad3027的質(zhì)粒圖譜。圖26描繪了vad3027的蛋白質(zhì)印跡。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包含fmdv多肽、抗原及其片段和變體的組合物和包含表達(dá)在動(dòng)物中引發(fā)免疫原性應(yīng)答的fmdv抗原的重組病毒載體的組合物?？乖远嚯幕蚱淦位蜃凅w由昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒表達(dá)載體產(chǎn)生。重組病毒載體可以是表達(dá)fmdv抗原的腺病毒載體。表達(dá)抗原的抗原多肽或片段或變體或重組病毒載體可以配制成疫苗或藥物組合物，并用于引發(fā)或刺激動(dòng)物中的保護(hù)性應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽抗原是fmdvp1、vp2或3c多肽或其活性片段或變體?？梢孕揎梖mdv抗原以增強(qiáng)fmdv空衣殼或fmdvvlp(病毒樣顆粒)的穩(wěn)定性。認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的抗原多肽可以是全長(zhǎng)多肽或其活性片段或變體?！盎钚云巍被颉盎钚宰凅w”是指片段或變體保留多肽的抗原性質(zhì)。因此，本發(fā)明包括在動(dòng)物中引發(fā)免疫原性應(yīng)答的任何fmdv多肽、抗原、表位或免疫原。fmdv多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何fmdv多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于在動(dòng)物如綿羊、牛、山羊或豬中引發(fā)、誘導(dǎo)或刺激應(yīng)答的蛋白質(zhì)、肽或其片段或變體。具體的fmdv抗原多肽包括p1、vp2和3c。fmdv是直徑約25nm的無(wú)包膜二十面體病毒，含有由大約8500個(gè)核苷酸組成的具有正極性的單鏈rna分子。該rna分子包含單個(gè)開放閱讀框(orf)，其編碼單個(gè)多聚蛋白，其中尤其還含有衣殼前體，也稱為蛋白質(zhì)p1或p88。蛋白質(zhì)p1在其氨基末端被肉豆蔻酰化。在成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)p1被蛋白酶3c切割成稱為vp0、vp1和vp3的三個(gè)蛋白質(zhì)(或者分別為1ab、1d和1c；belshamg.j.,progressinbiophysicsandmolecularbiology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白質(zhì)vp0然后被切割成兩個(gè)蛋白質(zhì)vp4和vp2(或者分別為1a和1b)。蛋白質(zhì)vp1、vp2和vp3具有約26,000da的分子量，而蛋白質(zhì)vp4較小為約8,000da。fmdv序列也在us7,527,960和us7,531,182中進(jìn)行了描述，這些文獻(xiàn)整體并入本文。衣殼蛋白的簡(jiǎn)單組合形成原聚體或5s分子，其是fmdv衣殼的基本組分。然后將該原聚體絡(luò)合成五聚體以形成12s分子。通過(guò)組裝12個(gè)12s五聚體從而構(gòu)成基因組rna分子，從而構(gòu)成146s顆粒，產(chǎn)生病毒粒子。也可以在其內(nèi)部不存在rna分子的情況下形成病毒衣殼(以下稱為“空衣殼”)?？找職ひ脖环Q為顆粒70s?？找職さ男纬煽梢栽诓《緩?fù)制過(guò)程中自然發(fā)生，或者可以通過(guò)化學(xué)處理人工產(chǎn)生。本發(fā)明涉及可以包含有效量的重組fmdv抗原或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體的牛、綿羊、山羊或豬的疫苗或組合物，以及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物。在一些實(shí)施方案中，疫苗還包含佐劑，例如美國(guó)專利7371395中描述的水包油(o/w)乳劑。在其它實(shí)施方案中，佐劑包括emulsigen、氫氧化鋁、皂苷和cpg，或其組合。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物中的應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答?！皠?dòng)物”是指哺乳動(dòng)物、鳥類等。動(dòng)物或宿主包括哺乳動(dòng)物和人。動(dòng)物可以選自馬科動(dòng)物(例如馬)、犬科動(dòng)物(例如狗、狼、狐貍、叢林狼、豺)、貓科動(dòng)物(例如獅子、老虎、家貓、野貓、其他大貓，和其他貓科動(dòng)物，包括獵豹和猞猁)、綿羊(如綿羊)、?？苿?dòng)物(如牛、奶牛)、豬(例如豬)、山羊(如山羊)、禽類(如雞、鴨、鵝、火雞、鶉、雉、鸚鵡、雀、鷹、鴉、鴕鳥、鴯鹋和食火雞)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如原猴亞目的猴、跗猴、猴、長(zhǎng)臂猿、猿)和魚。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”還包括在所有發(fā)育階段的個(gè)體動(dòng)物，包括胚胎和胎兒階段。除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。除非上下文另有明確指出，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指示物。同樣，除非上下文另有明確說(shuō)明，否則“或”旨在包括“和”。值得注意的是，在本公開中，特別是在權(quán)利要求和/或段落中，諸如“包含”(“comprises”、“comprised”、“comprising”)等的術(shù)語(yǔ)可以具有在美國(guó)專利法中認(rèn)為屬于它的含義；例如它們可以是“包括”(“includes”、“included”、“including”)等；并且例如“基本上由...組成”(“consistingessentiallyof”、“consistsessentiallyof”)這些術(shù)語(yǔ)具有美國(guó)專利法中賦予它們的含義，例如，它們?cè)试S沒(méi)有明確敘述的元素，但是排除在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的或影響的元素本發(fā)明的基本或新穎特征的元素。本發(fā)明的抗原多肽能夠保護(hù)免受fmdv感染。也就是說(shuō)，它們能夠刺激動(dòng)物的免疫應(yīng)答?！翱乖被颉懊庖咴笔侵冈谒拗鲃?dòng)物中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖梢园麄€(gè)生物體，被殺死的、減毒的或活的；生物體的亞單位或一部分；含有具有免疫原性的插入物的重組載體；能夠在向宿主動(dòng)物呈現(xiàn)時(shí)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的一段dna或dna片段；多肽、表位、半抗原或其任何組合?；蛘?，免疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性蛋白質(zhì)、多肽或肽”包括在一旦施用于宿主的意義上是免疫學(xué)活性的多肽，其能夠引發(fā)針對(duì)蛋白質(zhì)的體液和/或細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)片段使得其具有與總蛋白基本上相同的免疫活性。因此，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段包含至少一個(gè)表位或抗原決定簇或基本上由其組成或由其組成。如本文所用的“免疫原性”蛋白質(zhì)或多肽包括蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)序列，其類似物或其免疫原性片段?！懊庖咴云巍笔侵傅鞍踪|(zhì)的片段，其包括一個(gè)或多個(gè)表位，因此引發(fā)上述免疫應(yīng)答?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的任何數(shù)量的表位作圖技術(shù)來(lái)鑒定這樣的片段。見(jiàn)例如epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,vol.66(glenne.morris,ed.,1996)。例如，線性表位可以通過(guò)例如在固體支持物上同時(shí)合成大量的肽，肽對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的一部分，并且將肽與抗體反應(yīng)，同時(shí)肽仍然附著到支持物上。這樣的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的并描述于例如美國(guó)專利no.4,708,871；geysenetal.,1984,pnasusa,81(13):3998-400；geysenetal.,1985,pnasusa,82(1):178-82中。類似地，通過(guò)例如通過(guò)例如x射線晶體學(xué)和二維核磁共振確定氨基酸的空間構(gòu)象來(lái)容易地鑒定構(gòu)象表位。見(jiàn)例如，epitopemappingprotocols，出處同上。特別適用于t.parva的蛋白質(zhì)的方法在pct/us2004/022605中有詳細(xì)的描述，其通過(guò)引用整體并入本文。如所討論的，本發(fā)明包括抗原多肽的活性片段和變體。因此，術(shù)語(yǔ)“免疫原性蛋白質(zhì)、多肽或肽”進(jìn)一步考慮到序列的缺失、添加和置換，只要該多肽發(fā)揮產(chǎn)生如本文所定義的免疫應(yīng)答的功能。術(shù)語(yǔ)“保守變異”表示氨基酸殘基由另一生物學(xué)上相似的殘基替代，或者替代核酸序列中的核苷酸，使得編碼的氨基酸殘基不改變，或者是另一種生物學(xué)上相似的殘基。在這方面，特別優(yōu)選的置換一般在本質(zhì)上是保守的，即在氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的置換。例如，氨基酸一般分為四個(gè)家族：(1)酸性氨基酸——天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性氨基酸——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電極性氨基酸——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)分類為芳香族氨基酸。保守變異的實(shí)例包括一個(gè)疏水性殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置換另一個(gè)疏水性殘基，或用一個(gè)極性殘基置換另一極性殘基，例如精氨酸置換賴氨酸、谷氨酸置換天冬氨酸酸或谷氨酰胺置換天冬酰胺等；或用結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸置換氨基酸的類似保守置換，其不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生重大影響。因此，具有與參考分子基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影響蛋白質(zhì)的免疫原性的次要氨基酸置換的蛋白質(zhì)在參考多肽的定義內(nèi)。通過(guò)這些修飾產(chǎn)生的所有多肽都包括在本文中。術(shù)語(yǔ)“保守變異”還包括使用取代的氨基酸替代未取代的親本氨基酸，只要產(chǎn)生于取代的多肽的抗體也與未取代的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“表位”是指特異性b細(xì)胞和/或t細(xì)胞應(yīng)答的抗原或半抗原上的位點(diǎn)。該術(shù)語(yǔ)也可與“抗原決定簇”或“抗原決定簇位點(diǎn)”互換使用。可以在簡(jiǎn)單的免疫測(cè)定中鑒定識(shí)別相同表位的抗體，其顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原的結(jié)合的能力。對(duì)組合物或疫苗的“免疫應(yīng)答”是宿主對(duì)目的組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)展。通常，“免疫應(yīng)答”包括但不限于以下一種或多種作用：抗體、b細(xì)胞、輔助t細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性t細(xì)胞的產(chǎn)生，其特異性涉及包括在目的組合物或疫苗中的抗原。優(yōu)選地，宿主將顯示出治療性或保護(hù)性的免疫應(yīng)答，使得對(duì)新的感染的抗性將增強(qiáng)和/或疾病的臨床嚴(yán)重性降低。此類保護(hù)將通過(guò)受感染宿主通常顯示的癥狀的減少或缺乏、受感染宿主中更快的恢復(fù)時(shí)間和/或降低的病毒滴度來(lái)證明。合成抗原也包括在定義范圍內(nèi)，例如，多表位、側(cè)翼表位和其他重組或合成衍生的抗原。見(jiàn)例如，bergmannetal.,1993；bergmannetal.,1996；suhrbier,1997；gardneretal.,1998。為了本發(fā)明的目的，免疫原性片段通常包括至少約3個(gè)氨基酸、至少約5個(gè)氨基酸、至少約10-15個(gè)氨基酸或約15-25個(gè)氨基酸或更多的氨基酸。片段的長(zhǎng)度沒(méi)有關(guān)鍵的上限，其可以包含近乎全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)序列，或甚至包含蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表位的融合蛋白。因此，表達(dá)表位的多核苷酸的最小結(jié)構(gòu)是其包含編碼fmdv多肽的表位或抗原決定簇的核苷酸或基本上由其組成或由其組成。編碼fmdv多肽片段的多核苷酸可包含編碼多肽的序列的最少15個(gè)核苷酸、約30-45個(gè)核苷酸、約45-75個(gè)、或至少57個(gè)、87個(gè)或150個(gè)連續(xù)(consecutive或contiguous)核苷酸或基本上由其組成或由其組成。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”是指直鏈或支鏈、單鏈或雙鏈或其雜交體的rna或dna。該術(shù)語(yǔ)還包括rna/dna雜交體。以下是多核苷酸的非限制性實(shí)例：基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mrna、trna、rrna、核酶、cdna、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的dna、任何序列的分離的rna、核酸探針和引物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物、尿嘧啶、其它糖和連接基團(tuán)如氟代核糖和硫醇鹽、以及核苷酸分支。核苷酸序列可以在聚合后，例如通過(guò)綴合用標(biāo)記組分進(jìn)一步修飾。在該定義中包括的其他類型的修飾是帽，用類似物置換一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸，以及引入將多核苷酸連接到蛋白質(zhì)、金屬離子、標(biāo)記組分、其它多核苷酸或固體支持物的手段。多核苷酸可以通過(guò)化學(xué)合成獲得或從微生物衍生獲得。術(shù)語(yǔ)“基因”廣泛用于指與生物學(xué)功能相關(guān)聯(lián)的任何多核苷酸片段。因此，基因包括如基因組序列中的內(nèi)含子和外顯子，或者僅僅是如cdnas中的編碼序列，和/或它們表達(dá)所需的調(diào)控序列。例如，基因還指表達(dá)mrna或功能性rna或編碼特異性蛋白質(zhì)的核酸片段，并且其包括調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明還包含編碼fmdv抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互補(bǔ)鏈?；パa(bǔ)鏈可以是聚合物并且具有任何長(zhǎng)度，并且可以含有任何組合的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和類似物。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的氨基酸殘基的聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含經(jīng)修飾的氨基酸或氨基酸類似物，并且其可以被除氨基酸之外的化學(xué)部分中斷。該術(shù)語(yǔ)還包括已經(jīng)自然或通過(guò)干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修飾，例如與標(biāo)記或生物活性組分綴合?！胺蛛x的”生物組分(例如核酸或蛋白質(zhì)或細(xì)胞器)是指與已經(jīng)在其中組分天然存在的生物體的細(xì)胞中的其他生物組分基本上分離或純化的組分，例如其他染色體和染色體外的dna和rna、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。已經(jīng)“分離”的核酸和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)重組技術(shù)以及化學(xué)合成制備的核酸和蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“純化”不要求絕對(duì)純度；相反，它是作為一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，例如，純化的多肽制劑是其中多肽比在其天然環(huán)境中的多肽更富集的多肽制劑。即多肽與細(xì)胞組分是分開的。通過(guò)“基本上純化”，旨在使得多肽代表幾個(gè)實(shí)施方案，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％或更多的細(xì)胞組分或材料已被去除。同樣，多肽可以部分純化?！安糠旨兓笔侵干儆?0％的細(xì)胞組分或材料被去除。這同樣適用于多核苷酸。本文公開的多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段純化。如上所述，抗原性多肽或其片段或變體是fmdv抗原性多肽，其通過(guò)昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒表達(dá)載體體外產(chǎn)生或病毒載體體內(nèi)產(chǎn)生。所公開的多核苷酸和由此編碼的多肽的片段和變體也包括在本發(fā)明中?！捌巍笔侵付嗪塑账岬囊徊糠只蛴善渚幋a的抗原性氨基酸序列的一部分。如本文其他地方所述，多核苷酸的片段可以編碼保留天然蛋白質(zhì)的生物活性并因此具有免疫原性活性的蛋白質(zhì)片段。多肽序列的片段保留在動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力?！白凅w”旨在表示基本相似的序列。對(duì)于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸內(nèi)在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失和/或添加和/或天然多核苷酸在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。也可以通過(guò)比較由變體多核苷酸編碼的多肽與參考多核苷酸編碼的多肽之間的序列同一性百分比來(lái)評(píng)估本發(fā)明的具體多核苷酸(即，參考多核苷酸)的變體?！白凅w”蛋白意在通過(guò)在天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或在天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換而衍生自天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所涵蓋的變體蛋白質(zhì)具有生物活性，即它們引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。一方面，本發(fā)明提供來(lái)自綿羊、牛、山羊或豬fmdv分離物的fmdv多肽。另一方面，本發(fā)明提供了具有如seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽及其變體或片段。另一方面，本發(fā)明涉及改善fmdv空衣殼或fmdvvlp(病毒樣顆粒)的溫度和/或酸穩(wěn)定性。有利地通過(guò)形成二硫橋確?？找職さ臏囟群?或酸穩(wěn)定性。特別地，這種改善是通過(guò)在衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白蛋白質(zhì)vp2(衍生自p1)的多肽序列中例如在氨基酸序列seqidno：2、4、6、8、10或16(fmdva24株、fmdvo1manisa株、fmdviraq株或fmdvasia株的p1)的位置179用半胱氨酸替換原始序列的氨基酸而獲得的。一般來(lái)說(shuō)，該氨基酸的位置在衍生自其他口蹄疫病毒的vp2蛋白中是相同的(如特別是在實(shí)施例中描述的株的情況)。含有該氨基酸的區(qū)域?qū)?yīng)于α螺旋。為了鑒定或確認(rèn)待突變的氨基酸，考慮到序列在不同fmdv之間結(jié)構(gòu)中保守的事實(shí)，將該區(qū)域的氨基酸序列與序列seqidno：2、4、6、8、10或16上相應(yīng)的區(qū)域(例如大約十個(gè)或稍微更多(例如10-20個(gè))氨基酸的數(shù)量級(jí))進(jìn)行比對(duì)。待突變的氨基酸位于fmdvp1(seqidno：2、4、6、8、10或16)的位置179處。按照慣例，對(duì)應(yīng)于起始密碼子(其在自然序列中不存在并因此是添加的)的甲硫氨酸編號(hào)為1。此外，來(lái)自綿羊、牛、山羊或豬的fmdv多肽的同源物意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同源物”包括直系同源物、類似物和旁系同源物。術(shù)語(yǔ)“類似物”是指具有相同或相似功能的兩個(gè)多核苷酸或多肽，但在不相關(guān)的生物體中分別進(jìn)化。術(shù)語(yǔ)“直系同源物”是指來(lái)自不同物種的兩個(gè)多核苷酸或多肽，但是通過(guò)物種形成從共同祖先基因進(jìn)化。通常，直系同源物編碼具有相同或相似功能的多肽。術(shù)語(yǔ)“旁系同源物”是指通過(guò)基因組內(nèi)復(fù)制相關(guān)的兩個(gè)多核苷酸或多肽。旁系同源通常具有不同的功能，但這些功能可能相關(guān)。野生型fmdv多肽的類似物、直系同源物和旁系同源物可以通過(guò)翻譯后修飾、氨基酸序列差異或兩者而不同于野生型fmdv多肽。特別地，本發(fā)明的同源物通常將表現(xiàn)出與全部或部分野生型fmdv多肽或多核苷酸序列具有至少80-85％、85-90％、90-95％、或95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且將表現(xiàn)出相似的功能。變體包括等位基因變體。術(shù)語(yǔ)“等位基因變體”是指含有多態(tài)性的多核苷酸或多肽，所述多態(tài)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變化并且存在于天然群體(例如，病毒種類或品種)內(nèi)。此類天然等位變異通?？蓪?dǎo)致多核苷酸或多肽中的1-5％的變化?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)許多不同物種中的目的核酸序列進(jìn)行測(cè)序來(lái)鑒定等位基因變體，其可以通過(guò)使用雜交探針來(lái)容易地進(jìn)行以鑒定那些物種中相同的遺傳基因座。任何和所有此類由天然等位基因變異和不改變目的基因的功能活性的核酸變異和所得的氨基酸多態(tài)性或變異意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“衍生物”或“變體”是指具有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸變異或其他次要修飾的多肽或編碼多肽的核酸，使得(1)相應(yīng)的多肽與野生型多肽相比具有基本相同的功能，或(2)針對(duì)多肽產(chǎn)生的抗體與野生型多肽具有免疫反應(yīng)性。這些變體或衍生物包括對(duì)fmdv多肽一級(jí)氨基酸序列具有微小修飾的多肽，其可能導(dǎo)致與未修飾的對(duì)應(yīng)物多肽相比具有基本相同活性的肽。這樣的修飾可能是有意的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可能是自發(fā)的。術(shù)語(yǔ)“變體”進(jìn)一步考慮了序列的缺失、添加和置換，只要該多肽發(fā)揮產(chǎn)生如本文所定義的免疫應(yīng)答的功能。術(shù)語(yǔ)“保守變異”表示氨基酸殘基由另一生物學(xué)上相似的殘基替代，或者替代核酸序列中的核苷酸，使得編碼的氨基酸殘基不改變，或者是另一種生物學(xué)上相似的殘基。在這方面，如上所述，特別優(yōu)選的置換一般在本質(zhì)上是保守的。本公開的多核苷酸包括作為遺傳密碼的結(jié)果而簡(jiǎn)并的序列，例如針對(duì)特定宿主的優(yōu)化的密碼子使用。如本文所用，“優(yōu)化的”是指經(jīng)遺傳工程改造以增加其在給定物種中的表達(dá)的多核苷酸。為了提供編碼fmdv多肽的優(yōu)化的多核苷酸，fmdv蛋白基因的dna序列可以被修飾為1)包含特定物種中被高度表達(dá)的基因所優(yōu)選的密碼子；2)在核苷酸堿基組成中包含基本上在所述物種中發(fā)現(xiàn)的a+t或g+c含量；3)形成所述物種的起始序列；或4)消除引起不穩(wěn)定、不適當(dāng)?shù)亩嗑巯佘账峄⒔到夂徒K止rna或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)夾或rna剪接位點(diǎn)的序列。fmdv蛋白在所述物種中的表達(dá)增加可以通過(guò)利用真核生物和原核生物或特定物種中密碼子使用的分布頻率來(lái)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)選密碼子使用的頻率”是指特定宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子來(lái)指定給定的氨基酸時(shí)表現(xiàn)的偏好。存在20個(gè)天然氨基酸，其中大多數(shù)由多個(gè)密碼子指定。因此，只要核苷酸序列編碼的fmdv多肽的氨基酸序列在功能上沒(méi)有變化，則所有簡(jiǎn)并核苷酸序列都包括在本發(fā)明中。兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性可以通過(guò)ncbi(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)成對(duì)blast和blosum62矩陣使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)建立(見(jiàn)例如“美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心”(ncbi,bethesda,md.,usa)服務(wù)器上以及在altschul等人中提供的blast或blastx算法；因此，本文件通過(guò)術(shù)語(yǔ)“blast”說(shuō)明使用該算法或blast或blastx和blosum62矩陣)。就序列而言，“同一性”可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置數(shù)除以兩個(gè)序列中的較短序列的核苷酸或氨基酸的數(shù)目，其中兩個(gè)序列的比對(duì)可以根據(jù)wilbur和lipman算法確定。兩個(gè)氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性可以使用vectornti軟件包(invitrogen，1600faradayave.，carlsbad，ca)確定。當(dāng)rna序列被認(rèn)為是相似的或具有與dna序列的序列同一性或同源性時(shí)，dna序列中的胸苷(t)被認(rèn)為等于rna序列中的尿嘧啶(u)。因此，rna序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且可以通過(guò)dna序列中的胸苷(t)被認(rèn)為等同于rna序列中的尿嘧啶(u)而衍生自dna序列。雜交反應(yīng)可以在不同“嚴(yán)格性”的條件下進(jìn)行。增加雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的條件是眾所周知的。見(jiàn)例如“molecularcloning：alaboratorymanual”，第二版(sambrooketal.,1989)。本發(fā)明還包括在載體分子或表達(dá)載體中含有的并且可操作地連接到啟動(dòng)子元件并任選地與增強(qiáng)子連接的fmdv多核苷酸?！拜d體”是指包含待體外或體內(nèi)遞送至靶細(xì)胞的異源多核苷酸的重組dna或rna質(zhì)?；虿《?。為了預(yù)防或治療的目的，異源多核苷酸可以包含目的序列，并且可以任選地以表達(dá)盒的形式。如本文所用，載體不需要能夠在最終靶細(xì)胞或受試者中復(fù)制。該術(shù)語(yǔ)包括克隆載體和病毒載體。術(shù)語(yǔ)“重組體”是指在自然界中不發(fā)生或者以自然界中未發(fā)現(xiàn)的排列與另一個(gè)多核苷酸連接的半合成或合成來(lái)源的多核苷酸?！爱愒础币馕吨鴱呐c其進(jìn)行比較的實(shí)體的其他部分的遺傳上不同的實(shí)體衍生出來(lái)。例如，可以通過(guò)遺傳工程技術(shù)將多核苷酸置于來(lái)自不同來(lái)源的質(zhì)粒或載體中，并且多核苷酸是異源多核苷酸。從其天然編碼序列中取出并可操作地連接到天然序列以外的編碼序列的啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。本發(fā)明涉及可以包含有效量的重組fmdv抗原和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、佐劑、賦形劑或媒介物的綿羊、牛、山羊和豬疫苗或藥物或免疫組合物。本文所述的主題部分地涉及與在高度免疫原性的桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中制備的fmdv抗原相關(guān)并保護(hù)動(dòng)物免受來(lái)自同源和異源fmdv毒株的攻擊的組合物和方法。組合物本發(fā)明涉及fmdv疫苗或組合物，其可以包含有效量的重組fmdv抗原和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組fmdv抗原由昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv疫苗或組合物包含表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含fmdv空衣殼的疫苗或組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含表達(dá)fmdv空衣殼的病毒載體的疫苗或組合物。通過(guò)表達(dá)區(qū)域p1、2a/2b'/3b'和3c的cdna獲得fmdv空衣殼。fmdv空衣殼或fmdvvlp(病毒樣顆粒)可以修飾以具有增強(qiáng)的熱和/或酸(低ph)穩(wěn)定性。本發(fā)明涉及抗口蹄疫的疫苗，特別涉及改善其熱和/或酸(低ph)穩(wěn)定性。它還涉及制備這些疫苗的方法、抗原用于生產(chǎn)這些疫苗的用途和使用它們的疫苗接種方法。本發(fā)明還涉及核苷酸序列、特別是cdna并涉及氨基酸序列，其與病毒的天然序列相比是經(jīng)修飾的。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物，并涉及整合這些修飾的fmdv抗原和病毒。本發(fā)明包括在動(dòng)物例如綿羊、牛、山羊或豬中引發(fā)免疫原性應(yīng)答的任何fmdv多肽、抗原、表位或免疫原。fmdv多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何fmdv多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于在動(dòng)物例如綿羊、牛、山羊或豬中引發(fā)、誘導(dǎo)或刺激反應(yīng)的蛋白質(zhì)、肽或其片段。在其中fmdv免疫組合物或疫苗是重組免疫組合物或疫苗的實(shí)施方案中，組合物或疫苗包含重組載體和藥物或獸醫(yī)可接受的賦形劑、載體、佐劑或媒介物；重組載體是可以包含編碼fmdv多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的桿狀病毒表達(dá)載體。fmdv多肽、抗原、表位或免疫原可以是vp1、vp2、vp3、vp4、vp5、ns1、vp7、ns2、vp6、ns3、ns3a、p1、vp0、3c或其任何片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原是p1、vp0、vp3、vp1、vp2、vp4、2a、2b或3c。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼一種或多種fmdv抗原的核酸分子是編碼fmdvp1區(qū)的cdna和編碼fmdv的fmdv3c蛋白酶的cdna。在一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原可以是p1-3c多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原可以是單獨(dú)的p1，或p1-2a/2b1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原可以是vp0-vp3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原可以是vp4-vp2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原可以是3c，或者可以是具有優(yōu)化用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的5'utr的3c。在一個(gè)實(shí)施方案中，p1-2a/2b1和3c多肽可以使用單一構(gòu)建體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，并且表達(dá)可以由一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子序列調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原是經(jīng)修飾的p1或vp2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原可以來(lái)源于fmdvo1manisa,o1bfs或campos,a24cruzeiro,asia1shamir,airan’96,a22iraq,sat2saudiarabia。本發(fā)明涉及fmdv疫苗，其可以包含有效量的重組fmdv抗原或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體，以及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物可以是油包水乳劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，油包水乳劑可以是水包油乳劑。本發(fā)明還包括在載體分子或表達(dá)載體中含有的并且可操作地連接到啟動(dòng)子元件并任選地與增強(qiáng)子連接的fmdv多核苷酸。一方面，本發(fā)明提供fmdv多肽，特別是具有seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的綿羊、牛、山羊或豬多肽及其變體或片段。另一方面，本發(fā)明提供了具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％與本發(fā)明的抗原多肽的序列同一性，特別是具有如seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽。另一方面，本發(fā)明提供上述鑒定的fmdv多肽(seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16)的片段和變體，其可以容易地由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行制備。變體是具有與seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。fmdv多肽的免疫原性片段包括具有如seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所示的序列的fmdv多肽的至少8、10、15或20個(gè)連續(xù)氨基酸、至少21個(gè)氨基酸、至少23個(gè)氨基酸、至少25個(gè)氨基酸或至少30個(gè)氨基酸，或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv多肽的片段包括在全長(zhǎng)fmdv多肽上發(fā)現(xiàn)的特異性抗原表位。另一方面，本發(fā)明提供編碼fmdv多肽的多核苷酸，例如編碼具有seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示的序列的多肽的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供編碼與具有seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比的多肽的多核苷酸，或保守的變體、等位變體、同源物或免疫原性片段，其包含這些多肽或這些多肽的組合之一的至少八個(gè)或至少十個(gè)連續(xù)的氨基酸。另一方面，本發(fā)明提供了具有如seqidno：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20的核苷酸序列的多核苷酸或其變體。另一方面，本發(fā)明提供了與具有seqidno：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20所示序列的多核苷酸之一具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸，或其變體。本發(fā)明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在同一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的另外的編碼序列，控制元件例如啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)子，5'utr，3'utr，轉(zhuǎn)錄終止子，多聚腺苷酸化位點(diǎn)，在相同或不同啟動(dòng)子的控制下另外的轉(zhuǎn)錄單位，允許宿主細(xì)胞的克隆、表達(dá)、同源重組和轉(zhuǎn)化的序列，以及可能期望提供本發(fā)明實(shí)施方案的任何此類構(gòu)建體。用于表達(dá)fmdv多肽、抗原、表位或免疫原的元件有利地存在于本發(fā)明的載體中。以最小的方式，其包括起始密碼子(atg)、終止密碼子和啟動(dòng)子，以及任選地還包含、基本上由以下組成或由以下組成：某些載體如質(zhì)粒和某些病毒載體例如除痘病毒之外的其他病毒載體的多聚腺苷酸化序列。當(dāng)多核苷酸編碼多聚蛋白片段例如fmdv肽時(shí)，有利地在載體中將atg置于閱讀框的5'，將終止密碼子置于3'。可以存在用于控制表達(dá)的其它元件，例如增強(qiáng)子序列、穩(wěn)定序列，例如允許蛋白質(zhì)分泌的內(nèi)含子和信號(hào)序列。本發(fā)明還涉及包含載體例如表達(dá)載體的制備物，例如治療組合物。制備物可以包含一種或多種載體，例如表達(dá)載體，例如體內(nèi)表達(dá)載體，包含并表達(dá)一種或多種fmdv多肽、抗原、表位或免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體含有并表達(dá)多核苷酸，其在藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑或媒介物中包含、基本上由以下組成或由以下組成：編碼(并有利地表達(dá))fmdv抗原、表位或免疫原的多核苷酸。因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，制備物中的其它載體包含、基本上由以下組成或由以下組成：編碼fmdv多肽、抗原、表位或免疫原的一種或多種其它蛋白質(zhì)或其片段，并且在適當(dāng)情況下載體表達(dá)fmdv多肽、抗原、表位或免疫原的一種或多種其它蛋白質(zhì)或其片段。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，制備物中的載體包含、基本上由以下組成或由以下組成：編碼fmdv多肽、抗原、表位或免疫原的一種或多種蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸，該載體表達(dá)該多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備物包含一種、兩種或更多種載體，其包含編碼并有利體內(nèi)表達(dá)fmdv多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含編碼和表達(dá)不同fmdv多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的載體的混合物，例如來(lái)自不同動(dòng)物種類例如但不限于綿羊、牛、山羊或豬的fmdv多肽、抗原、表位或免疫原。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，表達(dá)載體是質(zhì)粒載體或dna質(zhì)粒載體，特別是體內(nèi)表達(dá)載體。在具體的非限制性實(shí)例中，pvr1020或1012質(zhì)粒(vicalinc.；lukeetal.,1997；hartikkaetal.,1996,humgenether,7(10):1205-17；見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,846,946和6,451,769)可以用作插入多核苷酸序列的載體。pvr1020質(zhì)粒衍生自pvr1012并含有人tpa信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，人tpa信號(hào)包含genbank登錄號(hào)為humtpa14中的氨基酸m(1)至氨基酸s(23)。在另一個(gè)具體的非限制性實(shí)例中，用作插入多核苷酸序列的載體的質(zhì)?？梢院性趃enbank登錄號(hào)為u28070中的氨基酸m(24)至氨基酸a(48)的馬igf1的信號(hào)肽序列?？梢栽趯?shí)踐中參考或使用的關(guān)于dna質(zhì)粒的附加信息發(fā)現(xiàn)于例如美國(guó)專利號(hào)6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中。術(shù)語(yǔ)質(zhì)粒涵蓋包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的任何dna轉(zhuǎn)錄單位和其在所需宿主或靶標(biāo)的細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)所必需的元件；并且在這方面，應(yīng)注意，超螺旋或非超螺旋、環(huán)狀質(zhì)粒以及線性形式旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)。每個(gè)質(zhì)粒除了編碼fmdv抗原、表位或免疫原的多核苷酸之外還包含或含有或基本上由其組成：任選地與異源肽序列、變體、類似物或片段融合，可操作地連接到啟動(dòng)子或在啟動(dòng)子的控制下或依賴于啟動(dòng)子。通常，在真核細(xì)胞中使用功能強(qiáng)的啟動(dòng)子是有利的。強(qiáng)啟動(dòng)子可以是但不限于人源或鼠源的立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(cmv-ie)，或任選地具有另一來(lái)源例如大鼠或豚鼠，super啟動(dòng)子(ni,m.etal.,plantj.7,661-676,1995)。cmv-ie啟動(dòng)子可以包含實(shí)際的啟動(dòng)子部分，其可以與或可以不與增強(qiáng)子部分相關(guān)聯(lián)?？梢詤⒖糴p-a-260148、ep-a-323597、美國(guó)專利號(hào)5,168,062、5,385,839和4,968,615以及pct申請(qǐng)?zhí)杦o87/03905。cmv-ie啟動(dòng)子有利地是人cmv-ie(boshartetal.,1985,cell,41(2):521-30)或鼠cmv-ie。更廣義地說(shuō)，啟動(dòng)子具有病毒、植物或細(xì)胞來(lái)源。在本發(fā)明實(shí)踐中可能有用的除cmv-ie之外的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子是sv40病毒的早/晚啟動(dòng)子或者rous肉瘤病毒的ltr啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)踐中的強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子是細(xì)胞骨架基因的啟動(dòng)子，例如，結(jié)蛋白啟動(dòng)子(kwissaetal.,2000,vaccine,18(22):2337-44)或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(miyazakietal.,1989,gene,79(2):269-77)。質(zhì)?？梢园渌磉_(dá)控制元件。引入穩(wěn)定序列，例如內(nèi)含子序列，例如玉米醇脫氫酶內(nèi)含子(callisetal.genes&dev.1(10):1183-1200，1987年12月)、hcmv-ie(pct申請(qǐng)?zhí)杦o1989/01036)的第一個(gè)內(nèi)含子、兔β-球蛋白基因的內(nèi)含子ii(vanooyenetal.,1979,science,206(4416):337-44)是特別有利的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢园?'utr。3'utr可以是但不限于農(nóng)桿菌(agrobacterium)胭脂堿合酶(nos)3'utr(nopalinesynthase:transcriptmappinganddnasequence.depicker,a.etal.j.mol.appl.genet.,1982；bevan,nar,1984,12(22):8711-8721)。對(duì)于除痘病毒之外的質(zhì)粒和病毒載體的多聚腺苷酸化信號(hào)(多聚a)，可以更多地使用牛生長(zhǎng)激素(bgh)基因的多聚(a)信號(hào)(見(jiàn)us5,122,458)或兔β-球蛋白基因的多聚(a)信號(hào)或sv40病毒的多聚(a)信號(hào)?！八拗骷?xì)胞”表示已被遺傳改變或能夠通過(guò)外源多核苷酸(例如重組質(zhì)?；蜉d體)的施用被遺傳改變的原核或真核細(xì)胞。當(dāng)提到遺傳改變的細(xì)胞時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指原始改變的細(xì)胞和其后代。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組fmdv抗原在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。使用方法在實(shí)施方案中，本文公開的主題涉及接種綿羊、牛、山羊或豬的方法，包括向綿羊、牛、山羊或豬施用有效量的疫苗，其可以包含有效量的重組fmdv抗原或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體，以及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括單次施用根據(jù)本發(fā)明的乳劑配制的疫苗組合物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫或疫苗組合物包含表達(dá)fmdv抗原(包括多肽和vlp(病毒樣顆粒)或空衣殼)的桿狀病毒，或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體。電鏡顯示用桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生fmdvvlp或fmdv空衣殼，因此根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)或疫苗組合物包括包含fmdvvlp或fmdv空衣殼的那些。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括單次施用兩種異源疫苗組合物。異源疫苗或組合物可以是不同類型的疫苗，例如fmdvvlp疫苗或fmdv病毒載體疫苗。異源疫苗也可以是表達(dá)不同fmdv血清型衣殼的相同類型的疫苗，例如a24、o1manisa、asia或iraq株。在實(shí)施方案中，本文公開的主題涉及一種接種綿羊、牛、山羊或豬的方法，包括向綿羊、牛、山羊或豬施用或在豬昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生桿狀病毒載體產(chǎn)生的fmdv抗原或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體。在實(shí)施方案中，本文公開的主題涉及引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向綿羊、牛、山羊或豬施用包含由昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒載體產(chǎn)生的fmdv抗原或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體的疫苗。在實(shí)施方案中，本文公開的主題涉及制備疫苗或組合物的方法，其包括分離在昆蟲細(xì)胞中由桿狀病毒載體產(chǎn)生的fmdv抗原或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體，并任選與藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物混合。使用同源和異源fmdv株進(jìn)行攻擊以測(cè)試疫苗的功效。施用可以是皮下或肌內(nèi)施用。施用可以是無(wú)針的(例如pigjet或bioject)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用初免-加強(qiáng)免疫的方案，其包括使用至少一種常見(jiàn)多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次主要施用(primaryadministration)和至少一次加強(qiáng)施用。用于主要施用的免疫組合物或疫苗性質(zhì)與用作加強(qiáng)免疫的免疫組合物或疫苗不同。然而，應(yīng)注意，相同的組合物可用作主要施用和加強(qiáng)免疫。這種施用操作方案被稱為“初免-加強(qiáng)免疫”。根據(jù)本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免疫可以包括用于表達(dá)編碼抗原性多肽或其片段或變體的fmdv編碼序列或其片段的重組病毒載體。具體地，病毒載體可以表達(dá)編碼抗原多肽的fmdv基因或其片段。本文考慮的病毒載體包括但不限于痘病毒[例如，痘苗病毒或減毒痘苗病毒、禽痘病毒或減毒的禽痘病毒(例如，金絲雀痘、雞痘、鴿痘(dovepox、pigeonpox)、鶉痘、alvac、trovac；見(jiàn)例如us5,505,941,us5,494,8070)、浣熊痘病毒、豬痘病毒等]、腺病毒(例如人腺病毒、犬腺病毒)、皰疹病毒(例如犬皰疹病毒、火雞皰疹病毒、馬立克氏病病毒、感染性喉氣管炎病毒、貓皰疹病毒、喉氣管炎病毒(iltv)、牛皰疹病毒、豬皰疹病毒)、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，禽痘病毒表達(dá)載體可以是金絲雀痘載體，例如alvac。在另一個(gè)實(shí)施方案中，禽痘病毒表達(dá)載體可以是雞痘載體，例如trovac。將待表達(dá)的本發(fā)明的fmdv抗原在特定痘病毒啟動(dòng)子的控制下插入，例如，昆蟲痘病毒amsactamoorei42k啟動(dòng)子(barcena,lorenzoetal.,2000,jgenvirol.,81(4):1073-85)、痘苗啟動(dòng)子7.5kda(cochranetal.,1985,jvirol,54(1):30-7)、痘苗啟動(dòng)子i3l(riviereetal.,1992,jvirol,66(6):3424-34)、痘苗啟動(dòng)子ha(shida,1986,virology,150(2):451-62)、痘苗啟動(dòng)子ati(funahashietal.,1988,jgenvirol,69(1):35-47)、痘苗啟動(dòng)子h6(tayloretal.,1988,vaccine,6(6):504-8；guoetal.,1989,jvirol,63(10):4189-98；perkusetal.,1989,jvirol,63(9):3829-36)，和其他啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，禽痘病毒表達(dá)載體可以是金絲雀痘載體，例如alvac。fmdv抗原、表位或免疫原可以是fmdvp1-3c。fmdv病毒載體可以是金絲雀痘病毒，例如vcp2186、vcp2181或vcp2176，或雞痘病毒如vfp2215(見(jiàn)us7,527,960)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fmdv抗原、表位或免疫原可以在浮萍中生產(chǎn)(us2011/0236416)。在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免疫的方案的另一方面，施用包含本發(fā)明的fmdv抗原的組合物，隨后施用包含在體內(nèi)含有和表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或滅活的包含fmdv抗原的病毒疫苗或組合物，或含有或表達(dá)fmdv抗原的dna質(zhì)粒疫苗或組合物。同樣，初免-加強(qiáng)免疫的方案可以包括施用包含體內(nèi)含有和表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或包含fmdv抗原的滅活的病毒疫苗或組合物，或含有或表達(dá)fmdv抗原的dna質(zhì)粒疫苗或組合物，然后施用包含本發(fā)明的fmdv抗原的組合物。進(jìn)一步注意到，主要和次要施用可以包含包含本發(fā)明的fmdv抗原的組合物。初免-加強(qiáng)免疫操作方案包括使用至少一種共同多肽和/或其變體或片段的至少一次初始施用和至少一次加強(qiáng)施用。用于初始施用的疫苗在性質(zhì)上可能與用作晚期加強(qiáng)疫苗的疫苗不同。初始施用可以包括一次或多次施用。類似地，加強(qiáng)施用可以包括一次或多次施用。用于作為哺乳動(dòng)物的靶物種的組合物的劑量體積，例如，基于病毒載體(例如基于非痘病毒-病毒-載體的組合物)的綿羊、牛、山羊或豬組合物的劑量體積通常為約0.1至約5.0ml、約0.1至約3.0ml、約0.5ml至約2.5ml。疫苗的功效可以在最后一次免疫接種后約2-4周內(nèi)通過(guò)用fmdv強(qiáng)毒株攻擊動(dòng)物(例如綿羊、牛、山羊或豬)來(lái)進(jìn)行測(cè)試，有利地是fmdvo1manisa,o1bfs或campos,a24cruzeiro,asia1shamir,airan’96,a22iraq,sat2saudiarabia株。其他株可能包括fmdv株a10-61,a5,a12,a24/cruzeiro,c3/indaial,o1,c1-santapau,c1-c5,a22/550/azerbaijan/65,sat1-sat3,a,a/tnc/71/94,a/ind/2/68,a/ind/3/77,a/ind/5/68,a/ind/7/82,a/ind/16/82,a/ind/17/77,a/ind/17/82,a/ind/19/76,a/ind/20/82,a/ind/22/82,a/ind/25/81,a/ind/26/82,a/ind/54/79,a/ind/57/79,a/ind/73/79,a/ind/85/79,a/ind/86/79,a/apa/25/84,a/apn/41/84,a/aps/44/05,a/aps/50/05,a/aps/55/05,a/aps/66/05,a/aps/68/05,a/bim/46/95,a/gum/33/84,a/ors/66/84,a/ors/75/88,a/tnan/60/947/asia/1,a/irn/05,asia/irn/05,o/hk/2001,o/ukg/3952/2001,o/ukg/4141/2001,asia1/hnk/cha/05(genbank登錄號(hào)ef149010，通過(guò)引用并入本文),asiai/xj(li,zhiyongetal.chinscibull,2007),hk/70(chinscibull,2006,51(17):2072―2078),o/ukg/7039/2001,o/ukg/9161/2001,o/ukg/7299/2001,o/ukg/4014/2001,o/ukg/4998/2001,o/ukg/9443/2001,o/ukg/5470/2001,o/ukg/5681/2001,o/es/2001,hkn/2002,o5india,o/bkf/2/92,k/37/84/a,ken/1/76/a,gam/51/98/a,a10/holland,o/ken/1/91,o/ind49/97,o/ind65/98,o/ind64/98,o/ind48/98,o/ind47/98,o/ind82/97,o/ind81/99,o/ind81/98,o/ind79/97,o/ind78/97,o/ind75/97,o/ind74/97,o/ind70/97,o/ind66/98,o/ind63/97,o/ind61/97,o/ind57/98,o/ind56/98,o/ind55/98,o/ind54/98,o/ind469/98,o/ind465/97,o/ind464/97,o/ind424/97,o/ind423/97,o/ind420/97,o/ind414/97,o/ind411/97,o/ind410/97,o/ind409/97,o/ind407/97,o/ind399/97,o/ind39/97,o/ind391/97,o/ind38/97,o/ind384/97,o/ind380/97,o/ind37/97,o/ind352/97,o/ind33/97,o/ind31/97,o/ind296/97,o/ind23/99,o/ind463/97,o/ind461/97,o/ind427/98,o/ind28/97,o/ind287/99,o/ind285/99,o/ind282/99,o/ind281/97,o/ind27/97,o/ind278/97,o/ind256/99,o/ind249/99,o/ind210/99,o/ind208/99,o/ind207/99,o/ind205/99,o/ind185/99,o/ind175/99,o/ind170/97,o/ind164/99,o/ind160/99,o/ind153/99,o/ind148/99,o/ind146/99,o/skr/2000,a22/india/17/77。這些fmdv毒株的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在歐洲生物信息學(xué)信息(embl-ebi)網(wǎng)頁(yè)上找到，并且所有相關(guān)的核苷酸序列通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明人考慮到本文列出的所有fmdv株和尚待鑒定的所有fmdv株可以根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)來(lái)表達(dá)，以產(chǎn)生例如有效的疫苗組合物。使用同源和異源株進(jìn)行攻擊以測(cè)試疫苗的功效?？梢云?nèi)、皮下、噴霧、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、氣管內(nèi)、和/或口服對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻擊。初始-加強(qiáng)施用可以有利地相隔1至6周、例如相隔約3周進(jìn)行。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，還設(shè)想了有利地使用基于病毒載體的疫苗的半年加強(qiáng)免疫或年度加強(qiáng)免疫。在第一次施用時(shí)，動(dòng)物有利地為至少6至8周齡。包含在初免-加強(qiáng)免疫操作方案中使用的本發(fā)明的重組抗原多肽的組合物包含在藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的媒介物、稀釋劑、佐劑或賦形劑中。本發(fā)明的操作方案保護(hù)動(dòng)物免受綿羊、牛、山羊或豬fmdv的感染和/或預(yù)防感染動(dòng)物的疾病進(jìn)展。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文的公開內(nèi)容以示例的方式提供，并且本發(fā)明不限于此。根據(jù)本文的公開內(nèi)容和本領(lǐng)域的知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定每次注射操作方案使用的施用次數(shù)、施用途徑和劑量，而無(wú)需任何過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明考慮了至少一種施用動(dòng)物有效量的根據(jù)本發(fā)明制備的治療組合物。動(dòng)物可能是男性、女性、懷孕女性和新生兒。該施用可以通過(guò)各種途徑，包括但不限于肌內(nèi)(im)、皮內(nèi)(id)或皮下(sc)注射或通過(guò)鼻內(nèi)或口服施用。根據(jù)本發(fā)明的治療組合物還可以通過(guò)無(wú)針裝置(例如使用pigjet，dermojet，biojector，avijet(merial,ga,usa)，vetjet或vitajet裝置(bioject,oregon,usa))施用。施用質(zhì)粒組合物的另一種方法是使用電穿孔(見(jiàn)例如tollefsenetal.,2002；tollefsenetal.,2003；babiuketal.,2002；pct申請(qǐng)?zhí)杦o99/01158)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)基因槍或金顆粒轟擊將治療組合物遞送至動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療有效量的用于在靶細(xì)胞中遞送和表達(dá)fmdv抗原或表位的制劑的施用。治療有效量的確定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包含表達(dá)載體，其包含表達(dá)fmdv抗原或表位的多核苷酸和藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、媒介物或賦形劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、媒介物或賦形劑有助于轉(zhuǎn)染或?qū)⒍嗪塑账徂D(zhuǎn)移至宿主動(dòng)物的其它手段和/或改善宿主中載體或蛋白質(zhì)的保存。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的主題提供了用于感染和接種動(dòng)物之間的區(qū)分(diva)的檢測(cè)方法。本文公開了本發(fā)明的疫苗或組合物的使用允許檢測(cè)動(dòng)物中的fmdv感染。本文公開了本發(fā)明的疫苗或組合物的使用允許通過(guò)區(qū)分感染和接種的動(dòng)物(diva)來(lái)檢測(cè)動(dòng)物中的感染。本文公開了一種使用fmdv非結(jié)構(gòu)蛋白(例如fmdv3abc或3d特異性elisa)來(lái)診斷動(dòng)物中fmdv感染的方法。制品在實(shí)施方案中，本文公開的主題涉及用于進(jìn)行引發(fā)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法的試劑盒，該試劑盒可以包含任何一種重組fmdv免疫組合物或疫苗，或滅活的fmdv免疫組合物或疫苗，重組fmdv病毒組合物或疫苗，以及執(zhí)行該方法的說(shuō)明書。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于在動(dòng)物中進(jìn)行誘導(dǎo)抗fmdv的免疫或保護(hù)性應(yīng)答的方法的試劑盒，其包括包含本發(fā)明的fmdv抗原的組合物或疫苗和重組fmdv病毒免疫組合物或疫苗，以及用于進(jìn)行用于在動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的有效量的遞送方法的說(shuō)明書。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于在動(dòng)物中進(jìn)行誘導(dǎo)抗fmdv的免疫或保護(hù)性應(yīng)答的方法的試劑盒，其包含本發(fā)明的fmdv抗原的組合物或疫苗和滅活的fmdv免疫組合物或疫苗，以及執(zhí)行用于在動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的有效量的遞送方法的說(shuō)明書。本發(fā)明的另一方面涉及如上的根據(jù)本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免疫接種的試劑盒。該試劑盒可以包含至少兩個(gè)小瓶：含有根據(jù)本發(fā)明的初次接種疫苗或組合物的第一小瓶和含有根據(jù)本發(fā)明的加強(qiáng)免疫接種疫苗或組合物的第二小瓶。該試劑盒可有利地含有另外的第一或第二小瓶用于另外的初次接種或另外的加強(qiáng)疫苗接種。以下實(shí)施方案包括在本發(fā)明中。在實(shí)施方案中，公開了包含fmdv抗原或其片段或變體以及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了包含表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了其中fmdv抗原或其片段或變體包括包含綿羊、牛、山羊或豬fmdv抗原的至少15個(gè)氨基酸的免疫原性片段的上述組合物。在實(shí)施方案中，公開了其中fmdv抗原或其片段或變體部分純化的上述組合物。在實(shí)施方案中，公開了其中fmdv抗原或其片段或變體基本上純化的上述組合物。在實(shí)施方案中，公開了其中fmdv抗原或其片段或變體是綿羊、牛、山羊或豬fmdv多肽的上述組合物。在實(shí)施方案中，公開了其中fmdv多肽是p1-3c多肽、p1多肽、vp0多肽、vp1多肽、vp3多肽、vp2多肽、vp4多肽、2a多肽、2b1多肽或3c多肽的上述組合物。在實(shí)施方案中，公開了其中fmdv抗原或其片段或變體具有與seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所示的序列具有至少80％的序列同一性的上述組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開了其中fmdv抗原由與seqidno：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20所示的序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸編碼的上述組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開了其中藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物是油包水乳劑或水包油乳劑的上述組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種使對(duì)綿羊、牛、山羊或豬fmdv敏感的動(dòng)物接種疫苗的方法，包括將上述組合物施用于動(dòng)物。在實(shí)施方案中，公開了一種疫苗接種對(duì)包含初免-加強(qiáng)免疫的方案的綿羊、牛、山羊或豬fmdv敏感的動(dòng)物的方法。在實(shí)施方案中，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的基本上純化的抗原性多肽，其中多肽包含：與具有seqidno：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在任何實(shí)施方案中，動(dòng)物優(yōu)選為綿羊、牛、豬或山羊。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種在動(dòng)物中診斷fmdv感染的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于初次加強(qiáng)免疫接種的試劑盒包含至少兩個(gè)小瓶，其中第一小瓶含有包含fmdv抗原或其片段或變體的組合物和第二小瓶含有含有或表達(dá)fmdv抗原的重組病毒載體。藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或佐劑或賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或賦形劑可以是0.9％nacl(例如鹽水)溶液或磷酸鹽緩沖液?？捎糜诒景l(fā)明方法的其它藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或賦形劑包括但不限于聚(l-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或媒介物或佐劑或賦形劑可以是促進(jìn)載體(或體外由本發(fā)明載體表達(dá)的蛋白質(zhì))施用的任何化合物或化合物的組合；有利地，載體、媒介物或賦形劑可以促進(jìn)該載體(或蛋白質(zhì))的轉(zhuǎn)染和/或改善保存。這里在一般說(shuō)明書中討論并且還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)人員閱讀本公開結(jié)合本領(lǐng)域的知識(shí)來(lái)確定劑量和劑量體積，無(wú)需任何過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。含有有利但僅適用于質(zhì)粒的季銨鹽的陽(yáng)離子脂質(zhì)有利的是具有下式的那些：其中r1是具有12至18個(gè)碳原子的飽和或不飽和直鏈脂族基團(tuán)，r2是另一個(gè)含有2或3個(gè)碳原子的脂族基團(tuán)，x是胺基或羥基，例如dmrie。在另一個(gè)實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)可以與中性脂質(zhì)例如dope結(jié)合。在這些陽(yáng)離子脂質(zhì)中，優(yōu)選dmrie(n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2,3-雙(十四烷氧基)-1-丙烷銨；wo96/34109)，有利地與中性脂質(zhì)、有利地dope(二油酰-磷脂酰乙醇胺；behr，1994)結(jié)合，以形成dmrie-dope。有利地，與施用該制劑或在施用制劑之前不久，與佐劑的質(zhì)粒混合物即時(shí)和有利地同時(shí)形成；例如，在施用之前不久或之前，形成質(zhì)粒-佐劑混合物，有利地是在施用混合物之前給予足夠的時(shí)間以形成復(fù)合物，例如，在施用前約10至約60分鐘，例如施用前約30分鐘。當(dāng)dope存在時(shí)，dmrie:dope摩爾比有利地為約95:約5至約5:約95，更有利地約1：約1，例如1:1。dmrie或dmrie-dope佐劑：質(zhì)粒重量比可以在約50:約1至約1:約10，例如約10:約1至約1:約5，以及約1:約1至約1:約2，例如1:1和1:2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或媒介物可以是油包水乳劑。合適的油包水乳劑的實(shí)例包括在4℃下穩(wěn)定且流動(dòng)的油基油包水型疫苗乳劑，其含有：含有6至50v/v％抗原的水相，優(yōu)選12至25v/v％，50至94v/v％的油相，其總共或部分含有不可代謝的油(例如礦物油如石蠟油)和/或可代謝的油(例如植物油，或脂肪酸、多元醇或醇酯)，0.2至20p/v％的表面活性劑，優(yōu)選3至8p/v％，后者全部或部分，或聚甘油酯的混合物，所述聚甘油酯優(yōu)選為聚甘油(聚)蓖麻醇酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或氫化聚氧乙烯蓖麻油?？捎糜谟桶閯┲械谋砻婊钚詣┑膶?shí)例包括乙氧基化脫水山梨醇酯(例如，可從applichem,inc.,cheshire,ct獲得的聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(tween)和脫水山梨糖醇酯(例如，可從sigmaaldrich,st.louis,mo獲得的脫水山梨糖醇單油酸酯(span))。此外，關(guān)于油包水乳劑，還見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,919,084，例如其實(shí)施例8，其通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，含抗原的水相包含含有一種或多種緩沖劑的鹽溶液。合適的緩沖溶液的實(shí)例是磷酸鹽緩沖鹽水。在有利的實(shí)施方案中，油包水乳劑可以是水/油/水(w/o/w)三相乳劑(美國(guó)專利號(hào)6,358,500)。其它合適的乳劑的實(shí)例描述在美國(guó)專利7,371,395中。根據(jù)本發(fā)明的免疫組合物和疫苗可以包含或基本上由一種或多種佐劑組成。用于實(shí)施本發(fā)明的合適的佐劑是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、馬來(lái)酸酐和烯基衍生物聚合物的聚合物，(2)免疫刺激序列(iss)，例如具有一個(gè)或多個(gè)非甲基化cpg的寡脫氧核糖核苷酸序列單位(klinmanetal.,1996,pnasusa,93(7):2879-83；wo98/16247)，(3)水包油乳劑，例如由m.powell,m.newman,plenumpress出版的“vaccinedesign,thesubunitandadjuvantapproach”1995,6:147,183的第147頁(yè)上描述的spt乳劑和同一出版物的第183頁(yè)上描述的乳劑mf59，(4)含有季銨鹽的陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如，dda，(5)細(xì)胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁，(7)皂苷或(8)在引用并引入本文的任何文獻(xiàn)中討論的其他佐劑，或(9)其任何組合或混合物。特別適用于病毒載體的水包油乳劑(3)可以基于：輕質(zhì)液體石蠟油(歐洲藥典型)，類異戊二烯油如角鯊?fù)?，角鯊烯，烯烴低聚產(chǎn)生的油，例如，異丁烯或癸烯，具有直鏈烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支鏈、脂肪醇或酸的脂，特別是異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳劑。乳化劑可以是非離子表面活性劑，例如：一方面脫水山梨醇的酯，二縮甘露醇(例如，脫水甘油醇油酸酯)，甘油，聚甘油或丙二醇，另一方面是油酸，異硬脂酸，蓖麻油酸或羥基硬脂酸，所述酯任選地是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如pluronic，例如l121。在(1)類佐劑聚合物中，優(yōu)選交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特別是由糖或多元醇的多烯基醚交聯(lián)。這些化合物以卡波姆(pharmeuropa，vol.8，no.2，1996年6月)的名義已知。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以參考美國(guó)專利no.2,909,462，其提供通過(guò)具有至少三個(gè)羥基，優(yōu)選不超過(guò)八個(gè)這樣的基團(tuán)的多羥基化合物交聯(lián)的這種丙烯酸類聚合物，至少三個(gè)羥基的氫原子是由具有至少兩個(gè)碳原子的不飽和的脂族基團(tuán)替代。優(yōu)選的基團(tuán)是含有2至4個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如乙烯基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團(tuán)。不飽和基團(tuán)還可以含有其它取代基，例如甲基。以名稱carbopol(bfgoodrich,ohio,usa)銷售的產(chǎn)品特別適合。它們由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中，參考了carbopol974p、934p和971p。關(guān)于馬來(lái)酸酐-鏈烯基衍生物共聚物，優(yōu)選為直鏈或交聯(lián)的乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物的ema(monsanto)，它們例如通過(guò)二乙烯基醚交聯(lián)。還參考j.fieldsetal.,1960。關(guān)于結(jié)構(gòu)，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和ema優(yōu)選由具有下式的基本單元形成：其中：-r1和r2可以相同或不同，表示h或ch3-x＝0或1，優(yōu)選x＝1-y＝1或2，x+y＝2。對(duì)于ema，x＝0和y＝2，對(duì)于卡波姆，x＝y(tǒng)＝1。這些聚合物可溶于水或生理鹽溶液(20g/lnacl)中，并且可以通過(guò)蘇打(naoh)將ph調(diào)節(jié)至7.3至7.4，以提供表達(dá)載體可以被納入在其中的佐劑溶液。最終免疫學(xué)或疫苗組合物中的聚合物濃度可以在約0.01至約1.5％w/v、約0.05至約1％w/v和約0.1至約0.4％w/v。細(xì)胞因子(5)可以是免疫學(xué)或疫苗組合物中的蛋白質(zhì)形式，或者可以在宿主中與免疫原或表位一起共表達(dá)。優(yōu)選通過(guò)與表達(dá)免疫原或表位的相同載體或其分開的載體與細(xì)胞因子的共表達(dá)。本發(fā)明包括制備這種組合物；例如通過(guò)將活性組分，有利地在一起并與佐劑、載體、細(xì)胞因子和/或稀釋劑混合?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞因子包括但不限于粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、干擾素α(ifnα)、干擾素β(ifnβ)、干擾素γ(ifnγ)、白細(xì)胞介素-1α(il-1α)、白細(xì)胞介素-1β(il-1β)、白細(xì)胞介素-2(il-2)、白細(xì)胞介素-3(il-3)、白細(xì)胞介素-4(il-4)、白細(xì)胞介素-5(il-5)、白細(xì)胞介素-6(il-6)、白細(xì)胞介素-7(il-7)、白細(xì)胞介素-8(il-8)、白細(xì)胞介素-9(il-9)、白細(xì)胞介素-10(il-10)、白細(xì)胞介素-11(il-11)、白細(xì)胞介素12(il-12)、腫瘤壞死因子α(tnfα)、腫瘤壞死因子β(tnfβ)、聚肌苷酸和聚胞苷酸、胞苷-磷酸-鳥苷寡脫氧核苷酸(cpgodn)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tgfβ)。應(yīng)當(dāng)理解，可以與本發(fā)明的免疫學(xué)或疫苗組合物共同施用和/或依次施用細(xì)胞因子。因此，例如，本發(fā)明的疫苗還可以含有外源核酸分子，其在體內(nèi)表達(dá)合適的細(xì)胞因子，例如與待接種的該宿主匹配的細(xì)胞因子，或其中將引發(fā)免疫應(yīng)答(對(duì)于例如，用于施用于牛的制劑的牛細(xì)胞因子)。在具體實(shí)施方案中，佐劑可包括ts6、ts7、ts8和ts9乳劑(us7,371,395)；lr3和lr4(us7,691,368)；tsap(us20110129494)；trigentm(newportlabs)；合成dsrna(例如poly-ic，poly-iclc)；和montanidetm佐劑(w/o、w/o/w、o/w、ims和凝膠；全部由seppic生產(chǎn))。在基于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)的多肽的免疫組合物和/或疫苗的情況下，劑量可以包括，大約1μg至大約2000μg、大約50μg至大約1000μg和大約100μg至大約500μg的fmdv抗原、表位或免疫原。劑量可以包括大約102至大約1020、大約103至大約1018、大約104至大約1016、大約105至大約1012的vlp。在基于表達(dá)fmdv抗原的病毒載體的免疫組合物和/或疫苗的情況下，劑量可以包括，大約103tcid50至1015tcid50(50％組織培養(yǎng)感染劑量)、大約103tcid50至1014tcid50、大約103tcid50至1013tcid50、大約103tcid50至1012tcid50。劑量體積可以為大約0.1ml至大約10ml，有利地為大約0.2ml至大約5ml?，F(xiàn)在將通過(guò)以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例dna插入片段、質(zhì)粒和重組病毒載體或桿狀病毒載體的構(gòu)建使用j.sambrook等人描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行(molecularcloning:alaboratorymanual,第二版,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,newyork,1989)。實(shí)施例1在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中構(gòu)建和表達(dá)fmdv抗原血清型afmdv的陽(yáng)性株rna基因組由側(cè)翼為兩個(gè)非編碼區(qū)的單個(gè)orf(1662個(gè)氨基酸)組成。orf擁有3部分。第一部分是多聚蛋白p1-2a，其在成熟和切割后導(dǎo)致4種衣殼組分(vp4、vp2、vp3和vp1)的表達(dá)。第二部分是含有2個(gè)蛋白質(zhì)(2b和2c)的p2，其涉及rna合成和細(xì)胞膜囊泡的大量產(chǎn)生。第三部分是含有4個(gè)蛋白質(zhì)(3a、3b、3c和3d)的p3。3c是參與多聚蛋白切割的主要蛋白質(zhì)。3d是另一種蛋白酶，而3a/3b參與膜錨定、發(fā)病機(jī)制、rna合成和衣殼化。p1-2a和3c對(duì)于構(gòu)成fmdv衣殼顆?；騠mdvvlp的所有蛋白質(zhì)的表達(dá)和切割是必需的(見(jiàn)圖2)。潛在的功能結(jié)構(gòu)域如下表1所示。表1genbank登錄號(hào)aat01711所注釋的潛在功能結(jié)構(gòu)域?qū)嵤├?.1構(gòu)建含有編碼fmdva24cruzeiro株的在vp2中具有突變(h93c)的多聚蛋白的多核苷酸的質(zhì)粒pmeb097，用于產(chǎn)生二硫橋(+優(yōu)化的翻譯起始背景)和產(chǎn)生相應(yīng)的重組桿狀病毒bacmeb097質(zhì)粒pmeb097的產(chǎn)生將含有編碼fmdva24cruzeiro株的多聚蛋白的野生型多核苷酸的質(zhì)粒pmeb096突變以產(chǎn)生質(zhì)粒pmeb097。質(zhì)粒pmeb097含有編碼在vp2(h93c)或p1(h179c)中含有突變的經(jīng)修飾的多聚蛋白(seqidno：2)的多核苷酸(seqidno：3)。經(jīng)修飾的聚蛋白(seqidno：2)含有置換，所述置換是在vp2的位置93或p1的位置179上的組氨酸被半胱氨酸置換。重組桿狀病毒bacmeb097的產(chǎn)生使用質(zhì)粒pmeb097(見(jiàn)圖3)通過(guò)同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒，其在多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下編碼fmdva24cruzeiro株的fmdvp1/2a/2b'3b'/3c基因(在vp2的位置93上具有半胱氨酸)。根據(jù)制造商的操作方案(baculogold，pharmingen)，用質(zhì)粒pmeb097和bsu36i三切割(triple-cut)線性化acnpvdna共同轉(zhuǎn)染來(lái)自atcc的草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda，sf)9昆蟲細(xì)胞。來(lái)自共轉(zhuǎn)染上清的重組桿狀病毒被噬斑純化兩次。在28℃下以25cm2單層瓶規(guī)模擴(kuò)增5個(gè)克隆(第1代)。在sf9昆蟲細(xì)胞中擴(kuò)增5個(gè)克隆，并使用對(duì)fmdva24血清型特異的單克隆抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析重組克隆?？寺?顯示出良好的表達(dá)水平。在28℃下以錐形瓶中50ml規(guī)模(懸浮液)以105rpm將該克隆進(jìn)一步擴(kuò)增(第2代)。進(jìn)行200ml規(guī)模的第三代(第3代)，以獲得用于蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒原液(virusstock)。然后通過(guò)噬斑測(cè)定滴定該病毒原液。使用補(bǔ)充有2％fcs的sf900iii培養(yǎng)基獲得病毒原液。滴定后重組桿狀病毒(第3代)用于無(wú)血清培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。桿狀病毒bacmeb097的表達(dá)分析在1pfu/ml的感染復(fù)數(shù)(moi)下，通過(guò)產(chǎn)生的桿狀病毒bacmeb097和通過(guò)bacmeb084(作為無(wú)突變的參照)感染昆蟲細(xì)胞(sf9-invitrogen)。在28℃下4天過(guò)程中，在沒(méi)有fcs的sf900ii培養(yǎng)基中以105rpm生長(zhǎng)昆蟲細(xì)胞。上清濃縮為大約四分之一，并如以下進(jìn)行處理：a＝無(wú)處理；b＝1h，56℃；c＝加入hcl達(dá)到低于5的ph。通過(guò)電鏡評(píng)估衣殼蛋白到vlp的正確裝配(見(jiàn)圖4的“a”欄)。25-30nm的顆粒顯示出非常均勻的圓形到二十面體形狀，經(jīng)常的尺寸為31nm，并通過(guò)染料的穿透進(jìn)行表征，并因此被解釋為fmdv樣。顆粒數(shù)估計(jì)為約108/ml。此外，如在56℃處理1小時(shí)(“b”欄)和通過(guò)培養(yǎng)基的酸化(“c”欄)后所見(jiàn)的，隨著bacmeb097中突變所帶來(lái)的二硫橋形成，vlp的穩(wěn)定性明顯增加。通過(guò)使用特異于fmdva24血清型的單克隆抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析上清證實(shí)了fmdv蛋白質(zhì)的身份(見(jiàn)圖5)。總之，用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pmeb097產(chǎn)生的桿狀病毒bacmeb097在sf9昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)fmdv衣殼的表達(dá)和加工。這些fmdv表達(dá)衣殼自動(dòng)組裝成具有fmdv樣病毒粒子的特征形態(tài)的vlp。與通過(guò)bacmeb084獲得的vlp(含有編碼fmdva24cruzeiro株的多聚蛋白的野生型多核苷酸的質(zhì)粒pmeb096)相比，涉及形成二硫橋的突變?cè)黾恿藇lp的穩(wěn)定性(熱處理或酸化后)。實(shí)施例1.2構(gòu)建含有編碼fmdvo1manisa株的在vp2中具有突變(s93c)的多聚蛋白的多核苷酸的質(zhì)粒pmeb099，用于產(chǎn)生二硫橋(+優(yōu)化的翻譯起始背景)和產(chǎn)生表達(dá)fmdv衣殼蛋白的重組桿狀病毒bacmeb099將含有編碼fmdvo1manisa株的多聚蛋白的野生型多核苷酸的質(zhì)粒pmeb095突變以產(chǎn)生質(zhì)粒pmeb099。質(zhì)粒pmeb099含有編碼在vp2(s93c)或p1(s179c)中含有突變的經(jīng)修飾的多聚蛋白(seqidno：6)的多核苷酸(seqidno：7)。經(jīng)修飾的多聚蛋白(seqidno：6)含有置換，所述置換是在vp2的位置93或p1的位置179上的絲氨酸被半胱氨酸置換。根據(jù)針對(duì)bacmeb097的實(shí)施例1.1的步驟進(jìn)行重組桿狀病毒bacmeb099的產(chǎn)生和表達(dá)。在0.5pfu/ml的感染復(fù)數(shù)(moi)下，通過(guò)桿狀病毒bacmeb099感染昆蟲細(xì)胞(sf9-inv)。在28℃下4天過(guò)程中，在沒(méi)有fcs的sf900ii培養(yǎng)基中以105rpm生長(zhǎng)昆蟲細(xì)胞。在上清液處理后進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)：濃縮并且56℃加熱1小時(shí)或不加熱(以觀察共價(jià)籠突變的效果)。通過(guò)電鏡和特異性elisa直接分析處理的上清(見(jiàn)圖6)。結(jié)果(圖6a和6b)顯示用elisa方法獲得了顯著滴度。該elisa特異于vlp，表明在bacmeb099感染后存在vlp。通過(guò)電鏡評(píng)估衣殼蛋白到vlp中的正確裝配(圖6b)。25-30nm的顆粒顯示出非常均勻的圓形到二十面體形狀，經(jīng)常的尺寸為31nm，并通過(guò)染料的穿透進(jìn)行表征，并因此被解釋為fmdv樣。顆粒數(shù)估計(jì)為約108/ml?？傊?，用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pmeb099產(chǎn)生的桿狀病毒bacmeb099在sf9昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)fmdv衣殼的表達(dá)和加工。這些fmdv表達(dá)衣殼自動(dòng)組裝成具有fmdv樣病毒粒子的特征形態(tài)的vlp。實(shí)施例1.3構(gòu)建在vp2中具有突變的含有編碼fmdviraq株的多聚蛋白的多核苷酸的質(zhì)粒pmeb106和含有編碼fmdvasia株的多聚蛋白的多核苷酸的質(zhì)粒pmeb104，用于產(chǎn)生二硫橋(+優(yōu)化翻譯起始背景)和產(chǎn)生表達(dá)fmdv衣殼蛋白的重組桿狀病毒根據(jù)實(shí)施例1.1中概括的步驟構(gòu)建含有編碼fmdviraq株的在p1中含有突變(在位置179上的c)的經(jīng)修飾的多聚蛋白(seqidno：8)的多核苷酸(seqidno：9)和編碼fmdvasia株的在p1中含有突變(在位置179上的c)的經(jīng)修飾的多聚蛋白(seqidno：10)的質(zhì)粒的多核苷酸(seqidno：11)。根據(jù)針對(duì)bacmeb097的實(shí)施例1.1中的步驟進(jìn)行表達(dá)經(jīng)修飾的fmdviraq株的多聚蛋白(seqidno：8)和fmdvasia株的多聚蛋白(seqidno：10)的重組桿狀病毒的產(chǎn)生和表達(dá)。用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pmeb106產(chǎn)生的桿狀病毒bacmeb106在sf9昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)fmdv衣殼的表達(dá)和加工。用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pmeb104產(chǎn)生的桿狀病毒bacmeb104在sf9昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)fmdv衣殼的表達(dá)和加工。這些fmdv表達(dá)衣殼自動(dòng)組裝成具有fmdv樣病毒粒子的特征形態(tài)的vlp。實(shí)施例2桿狀病毒表達(dá)的“籠化”fmdvvlp的穩(wěn)定性證明了大規(guī)模(150升)生產(chǎn)fmdvvlp的能力。當(dāng)以150l批次、制備規(guī)模生長(zhǎng)時(shí)，獲得了良好的桿狀病毒表達(dá)共價(jià)籠和野生型a24fmdv-vlp滴度(log10ccid507.14/ml)(ccid：細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量)。出乎意料的是，甚至在加熱樣品后，存在大量穩(wěn)定的fmdvlp(2.14log10ccid50/ml加熱的相對(duì)于2.19log10ccid50/ml未加熱的)(見(jiàn)圖8)。此外，如圖8所示，em計(jì)數(shù)顯示來(lái)自4l和150l批次的vlp的數(shù)量極好。實(shí)施例3用桿狀病毒、浮萍和金絲雀痘表達(dá)fmdv接種牛，隨后強(qiáng)毒攻擊該研究的目的是在牛中測(cè)試在ts6佐劑中配制的3種實(shí)驗(yàn)性fmda24cruzeiro抗原抗fmd強(qiáng)毒攻擊的功效。將含有浮萍(lemna)(浮萍(duckweed)，見(jiàn)us2011/0236416)、桿狀病毒或vcp(金絲雀痘病毒)表達(dá)抗原的疫苗在d0施用于牛(表2.1)。根據(jù)相關(guān)的歐洲藥典專著，通過(guò)在d21進(jìn)行的強(qiáng)毒fmdva24cruzeiro攻擊，然后臨床監(jiān)測(cè)牛，評(píng)估疫苗保護(hù)(表2.2)。對(duì)照中的fmd病變驗(yàn)證了攻擊。桿狀病毒接種組中的兩只動(dòng)物被完全保護(hù)免受損傷，表示完全保護(hù)，而另外三只表現(xiàn)出非常有限的病變延伸，表示部分保護(hù)。g2和g3中的動(dòng)物全部呈現(xiàn)損傷，盡管病變的強(qiáng)度不同。中和滴定數(shù)據(jù)顯示在圖9和圖10中。接種三周后(d21)，在g2的所有小牛中觀察到明顯的血清轉(zhuǎn)換。在g1和g3中，觀察到很少或沒(méi)有血清轉(zhuǎn)換。該日期的對(duì)照為陰性。所有小牛在攻擊后強(qiáng)烈血清轉(zhuǎn)換(d25或d28)。血清反應(yīng)在d28比在d25看起來(lái)更強(qiáng)，并且g2中接種疫苗的動(dòng)物顯著強(qiáng)于對(duì)照組。這一觀察結(jié)果表明在g2中接種疫苗的致敏效應(yīng)。結(jié)果表明，與其他兩組相比，桿狀病毒fmdva24(野生型a24)疫苗接種組提供了最高的sn滴度，并提供了保護(hù)免受強(qiáng)毒fmdva24cruzeiro的攻擊。表2.1疫苗接種方案表2.2攻擊研究設(shè)計(jì)實(shí)施例4在fmdv攻擊研究中不同實(shí)驗(yàn)性fmda24cruzeiro疫苗(桿狀病毒表達(dá)野生型fmdv)在牛中保護(hù)的評(píng)估該研究的目的是在牛中測(cè)試在ts6/皂苷佐劑中配制的3種實(shí)驗(yàn)性fmda24cruzeiro抗原抗fmd強(qiáng)毒攻擊的功效。將含有以桿狀病毒(bacmeb084，過(guò)濾的或未過(guò)濾的)或金絲雀痘病毒表達(dá)的fmda24cruzeiro抗原的疫苗在d0施用于牛。針對(duì)在d21進(jìn)行的強(qiáng)毒fmdva24cruzeiro攻擊評(píng)估了疫苗保護(hù)(根據(jù)相關(guān)的歐洲藥典專著)。表3.1疫苗接種方案a24bac過(guò)濾的*：桿狀病毒感染滴度8.71log10ccid50/mla24bac未過(guò)濾的**：桿狀病毒感染滴度5.58log10ccid50/ml,108vlpvcp2166***：桿狀病毒感染滴度8.8log10ccid50/ml表3.2在尸檢時(shí)觀察到的fmd蹄損傷概況和保護(hù)百分比兩種桿狀病毒疫苗在全部和四分之一疫苗劑量下在100％的動(dòng)物中被證明是保護(hù)性的。過(guò)濾的桿狀病毒疫苗在1/16疫苗劑量下在60％的動(dòng)物中仍然是保護(hù)性的。金絲雀痘病毒疫苗在全部劑量下在80％的動(dòng)物中被證明是保護(hù)性的。圖11a、11b和圖12c顯示了隨時(shí)間的fmdva24cruzeiro抗體滴度的圖和表。結(jié)果顯示接種3周后(d21)，所有接種疫苗的小牛均觀察到明顯的血清轉(zhuǎn)換。桿狀病毒接種組(g1-g2-g3和g5-g6)之間存在劑量/作用關(guān)系。對(duì)照組在兩個(gè)日期均為陰性。所有接種疫苗的小牛在攻擊后強(qiáng)烈血清轉(zhuǎn)換(d25和d28)。d28的血清反應(yīng)比d25更強(qiáng)烈。對(duì)照中的血清轉(zhuǎn)換相當(dāng)弱。圖12a和12b顯示了溫度隨時(shí)間的演變。結(jié)果表明，僅對(duì)照呈現(xiàn)顯著的溫度升高。疫苗沒(méi)有增加直腸溫度。使用這些數(shù)據(jù)，使用邏輯回歸和方法計(jì)算pd50。邏輯回歸方法估計(jì)疫苗a的強(qiáng)度>16pd50。karber方法估計(jì)疫苗a的強(qiáng)度>26pd50。雖然估計(jì)之間存在差異，但兩種方法都表明疫苗a具有非常顯著和實(shí)質(zhì)的功效。鑒于臨床結(jié)果，對(duì)疫苗b的類似估計(jì)也表明疫苗b具有很大的功效。實(shí)施例5使用桿狀病毒的實(shí)驗(yàn)性fmdv制劑在仔豬中的免疫原性該研究的目的是評(píng)估在桿狀病毒中表達(dá)并配制在ts6或ts6+皂苷中的4種fmdv抗原的免疫原性。疫苗按照以下比例制備(表4.1)。表4.1疫苗配方所研究的抗原不同在于血清型(a24cruzeiro或o1-manisa)、生產(chǎn)方法(昆蟲細(xì)胞或蠶)或插入物(標(biāo)準(zhǔn)或共價(jià)籠)。術(shù)語(yǔ)“共價(jià)籠”是指在fmdvp1肽中產(chǎn)生非天然存在的二硫鍵，其通過(guò)半胱氨酸殘基的置換來(lái)實(shí)現(xiàn)。評(píng)估在仔豬中進(jìn)行，肌內(nèi)疫苗接種兩次，間隔21天。在每次疫苗接種后監(jiān)測(cè)仔豬的全身反應(yīng)，并監(jiān)測(cè)d1、d20和d42的fmdv-a24或fmdv-o1m中和抗體滴度。表4.2疫苗接種分組組豬數(shù)活性成分(ai)插入物ai培養(yǎng)物佐劑g17a24cruzeiro野生型sf9細(xì)胞ts6g27a24cruzeiro野生型sf9細(xì)胞ts6+皂苷g37a24cruzeiro共價(jià)籠sf9細(xì)胞ts6+皂苷g47a24cruzeiro野生型蠶ts6+皂苷g57o1-manisa野生型sf9細(xì)胞ts6+皂苷g67----在g5中的任何動(dòng)物中，o1-manisa桿狀病毒表達(dá)的抗原都沒(méi)有引起血清轉(zhuǎn)換。這些數(shù)據(jù)首次表明含有“共價(jià)籠”突變的桿狀病毒產(chǎn)生的fmdv亞單位是免疫原性的(見(jiàn)下表5)。此外，這里的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地表明，與未經(jīng)修飾的野生型fmdv相比，“籠化”fmdv亞單位顯著更具生產(chǎn)性、有效和穩(wěn)定。此外，基于蠶的疫苗似乎沒(méi)有比其他所測(cè)試的疫苗含有更多的抗原。表5*：滴度≥1.35log10pd50；sd**：標(biāo)準(zhǔn)差?？傊?，如表5的結(jié)果所示，所有sf9細(xì)胞培養(yǎng)的桿狀病毒表達(dá)的a24vlp(組g1、g2和g3)產(chǎn)生顯著的“加強(qiáng)”效應(yīng)(即第二劑量顯著增加血清轉(zhuǎn)換動(dòng)物的數(shù)量)。相比之下，家蠶培養(yǎng)的a24vlp似乎已經(jīng)引起了初始和持續(xù)的血清學(xué)應(yīng)答，而沒(méi)有引起明顯的加強(qiáng)效應(yīng)。實(shí)施例6桿狀病毒表達(dá)的a24fmdvvlp的酸和熱穩(wěn)定性a24fmdvvlp進(jìn)行酸和熱處理，并使用em(圖13)和elisa分析(圖14)評(píng)估其穩(wěn)定性。如圖中所示，共價(jià)籠vlps而不是野生型vlp顯著抵抗低ph和熱。此外，如圖15和表6所示，在5℃下儲(chǔ)存時(shí)，相對(duì)于野生型對(duì)應(yīng)物，共價(jià)籠vlp隨時(shí)間顯著更穩(wěn)定。表6a24vlp的穩(wěn)定性(共價(jià)籠vs.野生型)總之，來(lái)自具有“共價(jià)籠突變”的a24cruzeiro血清型的vlp的穩(wěn)定性對(duì)于抵抗加熱或酸化處理是非常有效的。存儲(chǔ)18周后共價(jià)籠穩(wěn)定vlp。現(xiàn)在已經(jīng)顯示出幾種fmdv血清型通過(guò)引入共價(jià)籠突變而被有效地穩(wěn)定，包括：a24cruzeiro；o1manisa(圖16，em&圖17，elisa)；asia1shamir；和a22iraq。圖17顯示加熱對(duì)穩(wěn)定的vlp(共價(jià)籠，bacmeb099)沒(méi)有影響，而加熱后標(biāo)準(zhǔn)fmdvo1-manisa活性成分沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，表明加熱后標(biāo)準(zhǔn)fmdvo1manisa沒(méi)有組裝的vlp。實(shí)施例7在普通仔豬中用桿狀病毒fmdo1manisa(經(jīng)修飾的，共價(jià)籠)配制的疫苗的免疫原性該研究的目的是評(píng)估配制在ts6中的兩種桿狀病毒fmdo1-manisa抗原和一種腺病毒載體fmdvo1-manisa在普通豬中的安全性和有效性。每種制劑以分開三周注射兩次施用(d0d21)。豬在d0為11-12周齡，接受2ml肌內(nèi)感染疫苗。通過(guò)監(jiān)測(cè)局部和全身反應(yīng)來(lái)評(píng)估安全性。通過(guò)血清學(xué)(血清中和滴度)監(jiān)測(cè)(d1、d20、d43)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(cmi)測(cè)定(d27、d43)評(píng)估功效。表7.1抗原和疫苗的特征在d27和d43收集血液樣品用于細(xì)胞介導(dǎo)免疫(cmi)測(cè)定。對(duì)分泌γ干擾素(ifnγ)的細(xì)胞定量、血漿細(xì)胞定量或記憶b細(xì)胞定量進(jìn)行再刺激后，測(cè)定樣品(見(jiàn)表7.2)。所有定量均由elispot進(jìn)行。表7.2cmi測(cè)定+：已測(cè)試；nt：未測(cè)試結(jié)果顯示，出乎意料的是，與桿狀病毒表達(dá)的野生型fmdvo1m(見(jiàn)實(shí)施例5)不同，桿狀病毒表達(dá)的修飾(共價(jià)籠)fmdvo1m的在仔豬中引起了血清轉(zhuǎn)換。如下表7.3所示，在第一次接種疫苗(d0)后，在d20的2個(gè)桿狀病毒組(g1和g2)中觀察到血清轉(zhuǎn)換。在第二次接種后，觀察到兩個(gè)組(g1和g2)中的加強(qiáng)效應(yīng)。表7.3仔豬中桿狀病毒fmdo1manisa的血清學(xué)研究如圖20所示，在兩種桿狀病毒表達(dá)的fmdv-vlp(經(jīng)修飾的，共價(jià)籠)/ts6接種組(g1和g2)中檢測(cè)到特異性分泌igg的漿細(xì)胞。特異性分泌igg的漿細(xì)胞在g1和g2中顯著高于在g4中。在g3中沒(méi)有檢測(cè)到特異性分泌igg的漿細(xì)胞。圖21顯示，在g1組和g2組的所有接種疫苗的豬中檢測(cè)到大量特異性分泌igg的記憶b細(xì)胞，在g3中檢測(cè)到少部分的特異性分泌igg的記憶b細(xì)胞，并且在g4中沒(méi)有檢測(cè)到特異性分泌igg的記憶b細(xì)胞。圖22顯示，以g1和g2>g4>g3的順序，在所有接種的組中檢測(cè)到特異性分泌ifnγ的細(xì)胞。g1和g2之間沒(méi)有區(qū)別。特異性分泌ifnγ的細(xì)胞在g1和g2中顯著高于在g3中。在兩種桿狀病毒表達(dá)的fmdv-vlp(修飾的共價(jià)籠)/ts6接種組(g1和g2)中高水平的特異性分泌ifnγ的細(xì)胞、特異性分泌igg的漿細(xì)胞和特異性分泌igg的記憶b細(xì)胞表明良好保護(hù)免受fmdv感染的水平。實(shí)施例8asiashamirbacmeb102(野生型)&bacmeb104(共價(jià)籠)表8通過(guò)em測(cè)量的asiashamirvlp(bacmeb102，野生型和bacmeb104，共價(jià)籠)的穩(wěn)定性結(jié)果表明，加熱后存在大量穩(wěn)定的bacmeb104(共價(jià)籠)的fmdvlp，vlp在高達(dá)至少15個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，而bacmeb102(wt)加熱后未形成任何可檢測(cè)的vlp。實(shí)施例9iraq22bacmeb106(共價(jià)籠)的穩(wěn)定性表9加熱后通過(guò)em測(cè)量的iraq22vlp(bacmeb105，野生型和bacmeb106，共價(jià)籠)的穩(wěn)定性與共價(jià)籠iraq22vlp相比，野生型iraq22vlp在d0加熱后不穩(wěn)定。實(shí)施例10豬中asiashamir共價(jià)籠&iraqa22共價(jià)籠的血清學(xué)研究該研究的目的是評(píng)估在桿狀病毒中產(chǎn)生的fmdasia1shamir和fmda22iraqvlp抗原在普通豬的免疫原性。在ts6制劑中測(cè)試了兩批asia1shamir抗原和兩批a22iraq抗原。每種制劑以分開三周注射兩次施用(d0-d21)給豬。豬在d0為8-9周齡。通過(guò)血清學(xué)監(jiān)測(cè)(d-1、d20、d42)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(cmi)測(cè)定(d26、d41)評(píng)估免疫原性。表10asiashamirvlp(bacmeb104，共價(jià)籠)和a22iraqvlp(bacmeb106，共價(jià)籠)，在d0和d21的兩次注射的疫苗接種方案組抗原佐劑g1(n＝5)asia1shamirvlpccts6g2(n＝5)a22iraqvlpccts6g3(n＝4)asia1shamirvlpccts6g4(n＝4)a22iraqvlpccts6g5(n＝2)未進(jìn)行疫苗接種-如圖18所示，來(lái)自兩個(gè)株的共價(jià)籠vlp引起強(qiáng)烈的血清型特異性血清學(xué)應(yīng)答。所有用vlpasia1shamir(g1&g3)接種的豬對(duì)第一次疫苗接種有明顯的血清應(yīng)答，平均滴度接近1.20log10pd50。此外，第二次疫苗接種后有明顯的加強(qiáng)效應(yīng)，大部分豬的滴度超過(guò)1.8log10pd50。即使在加強(qiáng)免疫接種后，對(duì)照組(g5)和大多數(shù)a22iraq接種的豬(g2&g4)也沒(méi)有顯示對(duì)asia1shamir的任何血清應(yīng)答。所有接種vlpa22iraq(g2&g4)接種的豬對(duì)第一次疫苗接種有血清應(yīng)答，平均滴度接近1.15log10pd50。此外，第二次疫苗接種后有很強(qiáng)的加強(qiáng)效應(yīng)，大部分豬的滴度超過(guò)2.0log10pd50。即使在加強(qiáng)免疫接種后，對(duì)照組(g5)和大多數(shù)asia1shamir接種的豬(g1&g3)對(duì)a22iraq沒(méi)有顯示任何血清應(yīng)答。出乎意料的是，如圖19所示，觀察到交叉反應(yīng)性。結(jié)果已經(jīng)表明，當(dāng)使用asia1shamirfmdv肽庫(kù)時(shí)，在兩個(gè)asia1shamirvlp組中均檢測(cè)到特異性ifnγ應(yīng)答(細(xì)胞應(yīng)答)，并且當(dāng)使用a22iraqfmdv肽庫(kù)時(shí)，在兩個(gè)a22iraqvlp組中均檢測(cè)到特異性ifnγ應(yīng)答(細(xì)胞應(yīng)答)。asia1shamirvlp組在使用a22iraqfmdv肽庫(kù)時(shí)表現(xiàn)出交叉免疫原性。用asia1shamir滅活的ai涂層和a22iraq滅活的ai涂層在兩個(gè)asia1shamiarvlp組中和在兩個(gè)a22iraqvlp組中分別檢測(cè)到特異性漿細(xì)胞(體液應(yīng)答)。用a22iraq滅活的ai涂層觀察到在asia1shamirvlp組中的交叉免疫原性(漿細(xì)胞)。用asia1shamirai涂層和a22iraqai涂層在兩個(gè)asia1shamiarvlp組中和在兩個(gè)a22iraqvlp組中分別檢測(cè)到特異性記憶b細(xì)胞(體液應(yīng)答)。用a22iraqai涂層觀察到在asia1shamirvlp組中的良好的交叉免疫原性(b細(xì)胞)。用asia1shamirai涂層也觀察到在a22iraqvlp組中的一些交叉免疫原性(b細(xì)胞)。總之，結(jié)果表明vlp可以引發(fā)足夠的免疫應(yīng)答來(lái)保護(hù)免受異源性攻擊?？傊趖s6中佐劑化的4種fmdv血清型-vlp抗原(a24、o1manisa、asia1shamir和a22iiraq)誘導(dǎo)了體液和細(xì)胞應(yīng)答，其為強(qiáng)烈的血清型特異性中和抗體應(yīng)答，具有一定比例的特異性ifnγ應(yīng)答，存在記憶b細(xì)胞(在2種血清型之間具有交叉反應(yīng)性)，表明良好保護(hù)免受同源和異源fmdv感染的水平。實(shí)施例11人腺病毒5載體化的重組fmdv的構(gòu)建該研究的目的是產(chǎn)生針對(duì)血清型a24cruzeiro的腺病毒重組體，所述腺病毒重組體表達(dá)密碼子優(yōu)化的fmdv結(jié)構(gòu)蛋白和非優(yōu)化的具有c142t位點(diǎn)突變的3c蛋白酶。fmdv抗原含有fmdv衣殼前體(密碼子優(yōu)化的vp1、vp2(具有h93c位點(diǎn)突變，共價(jià)籠)、vp3、vp4、2a和全長(zhǎng)2b)和非優(yōu)化的部分3b和具有c142t位點(diǎn)突變的全長(zhǎng)3c蛋白酶(seqidno：16)。將hek293細(xì)胞(atcc)在37℃、5％co2中保持在含有10％胎牛血清(moregate批次#81827101)的mem(gibco#11095)中。這些細(xì)胞被用于拯救重組腺病毒vad3027并制備病毒原液。表達(dá)質(zhì)粒pad3027(見(jiàn)圖25)含有與cmv啟動(dòng)子和sv40多聚a尾連接的密碼子優(yōu)化的多核苷酸(編碼fmdv衣殼蛋白質(zhì)seqidno：16的seqidno：17)。多核苷酸包括合成的內(nèi)含子。使用gateway技術(shù)(invitrogen)，通過(guò)入門載體與目的載體的lr重組產(chǎn)生表達(dá)克隆。通過(guò)用轉(zhuǎn)染試劑在hek293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染線性化表達(dá)克隆產(chǎn)生重組腺病毒vad3027。拯救后，通過(guò)凍融循環(huán)收獲每種病毒，并通過(guò)離心澄清細(xì)胞碎片。為了傳代，將每種病毒接種到單層hek293細(xì)胞中，感染后約3-4天，通過(guò)凍融循環(huán)收獲病毒并通過(guò)離心澄清。進(jìn)行5次傳代以制備病毒原液，儲(chǔ)存于-80℃。重組克隆的序列分析已經(jīng)證實(shí)了從cmv啟動(dòng)子的開始到sv40尾部的末端的序列是正確的(seqidno：20)。免疫熒光測(cè)試顯示，所有檢查的vad3027的噬斑均表達(dá)fmdv衣殼蛋白。使用針對(duì)vp2蛋白的抗體的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)到vp2的線性表位，如由vad3027表達(dá)的vp2(完全加工25kda)、vp0(部分加工的轉(zhuǎn)基因37kda)或p1(未加工的轉(zhuǎn)基因80kda)(見(jiàn)圖26)。根據(jù)上述步驟構(gòu)建了表達(dá)用于o1manisa、asia和iraq株的密碼子優(yōu)化的fmdv經(jīng)修飾的(共價(jià)籠)衣殼蛋白的腺病毒重組體。實(shí)施例12疫苗接種豬后各種口蹄疫病毒(fmdv)疫苗候選者的血清學(xué)評(píng)估實(shí)施例12.1fmdva24疫苗的血清學(xué)評(píng)估該研究的目的是評(píng)估豬中接種疫苗后的各種fmdva24疫苗制劑的免疫原性，包括人腺病毒5載體化的fmdv疫苗和桿狀病毒表達(dá)的fmda24重組vlp(共價(jià)籠)疫苗與不同佐劑聯(lián)合使用(或不含佐劑)。六十只常規(guī)飼養(yǎng)的仔豬(約1個(gè)月齡)各自隨機(jī)分入九種處理組之一中，每組含有4-7只豬。所得組的組成呈現(xiàn)于下表11中。表11人腺病毒5載體化的fmdv疫苗和桿狀病毒表達(dá)fmda24重組vlp疫苗，在d0和d21的兩次注射的疫苗接種方案tv：測(cè)試疫苗。baca24vlp1：桿狀病毒表達(dá)fmda24重組vlp(共價(jià)籠)疫苗。vad30272：人腺病毒5載體化的fmdva24(共價(jià)籠)疫苗。*第8組在d0接受tv7并且在d21接受tv1。**每只仔豬的靶劑量為：對(duì)于用baca24vlp接種的仔豬，活性成分為0.6ml中103.9vlp，而對(duì)于用vad3027構(gòu)建體接種的仔豬，其為1010.35tcid50。除了第9組(對(duì)照組)，用2ml測(cè)試疫苗以21天間隔兩次接種每只仔豬。所有注射在頸部區(qū)域、尾側(cè)至耳朵中(交替地在右側(cè)和左側(cè)上)通過(guò)肌內(nèi)途徑(im)給予。在第0天(疫苗接種前)、第7、15、21天(接種疫苗之前)、第28、35和42天，從所有仔豬收集血液樣品。通過(guò)血清病毒中和法(svn)測(cè)試來(lái)自所有仔豬的第42天血清樣品的fmdv抗體。在所有收集天對(duì)來(lái)自那些用vad3027構(gòu)建體和對(duì)照(6-9組)接種疫苗的樣品進(jìn)行svn測(cè)定。在研究開始之前，第1-9組的所有仔豬均測(cè)試為fmdv抗體陰性。在整個(gè)研究過(guò)程中，所有對(duì)照仔豬均為fmdv抗體陰性。fmdvsvn結(jié)果顯示于圖23中。結(jié)果表明，fmda24重組vlp疫苗和人腺病毒5載體化的fmdv疫苗均在動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在低劑量的103.9vlp中，fmda24重組vlp疫苗在動(dòng)物中誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答。與接種低劑量fmda24重組vlp疫苗的疫苗接種方案相比，按照兩個(gè)劑量的疫苗接種方案接種人腺病毒5載體化的fmdv疫苗的動(dòng)物(第6-7組)具有更高的抗體應(yīng)答。出乎意料的是，與使用相同疫苗的初免-加強(qiáng)免疫相比，用病毒載體化的fmdv疫苗和baca24vlp疫苗的異源初免-加強(qiáng)免疫的方案表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。圖24顯示在研究過(guò)程中第6-9組的fmdv抗體滴度(第0天-第42天)。到第15天(第一次疫苗接種后2周)為止，來(lái)自第8組的所有vad3027疫苗接種者血清轉(zhuǎn)換為fmdv。第6-7組中的仔豬血清轉(zhuǎn)換率為29-57％。此外，與第6-7組中相比，第8組中的平均抗體滴度/組(具有病毒載體化的fmdv疫苗和baca24vlp疫苗的異源初免-加強(qiáng)免疫方案)更高。在第42天收集的樣品中，在來(lái)自所有組的所有動(dòng)物中測(cè)定對(duì)腺病毒的抗體應(yīng)答(svn)。結(jié)果以log10的形式報(bào)告，≤0.6log10的值被認(rèn)為是血清抗體陰性。結(jié)果表明，用baca24vlp配制的疫苗接種的所有對(duì)照和仔豬在第42天通過(guò)sn抗體滴度對(duì)腺病毒呈陰性(≤0.6log10)。在第6和7組中的用vad3027接種的所有動(dòng)物均有血清轉(zhuǎn)換，滴度范圍為1.8-3.0，而第8組中的50％的仔豬血清轉(zhuǎn)換。總體而言，第6組中的動(dòng)物對(duì)腺病毒具有更高的抗體應(yīng)答。實(shí)施例12.2fmdvo1manisa、asia和iraq疫苗的血清學(xué)評(píng)估該研究的目的是評(píng)估豬中接種疫苗后的各種fmdvo1manisa、asia和iraq疫苗制劑的免疫原性，包括人腺病毒5載體化的fmdv疫苗和桿狀病毒表達(dá)的fmdo1manisa、asia和iraq重組vlp(共價(jià)籠)疫苗與不同的佐劑聯(lián)合使用(或不含佐劑)。研究設(shè)計(jì)如實(shí)施例12.1中所述。如實(shí)施例12.1中所述，在不同階段取來(lái)自疫苗接種動(dòng)物的血液樣品，并測(cè)試血清學(xué)。結(jié)果表明，本發(fā)明的組合物或疫苗是具有免疫原性的并且在動(dòng)物中提供保護(hù)。實(shí)施例14在普通豬和牛以及mda陽(yáng)性豬和牛中疫苗接種后各種口蹄疫病毒(fmdv)疫苗候選者的血清學(xué)評(píng)估該研究的目的是評(píng)估在普通豬或牛中兩種異源疫苗的初免-加強(qiáng)免疫施用(兩次施用)或兩種異源疫苗同時(shí)施用(一次施用)以增加免疫應(yīng)答，以及在mda陽(yáng)性豬和牛中的施用以克服mda并增加免疫應(yīng)答。異源疫苗可以是不同類型的疫苗，例如表達(dá)來(lái)自相同fmdv血清型的衣殼的fmdvvlp疫苗或fmdv病毒載體疫苗。異源疫苗也可以是表達(dá)不同fmdv血清型(例如a24、o1manisa、asia和iraq株)衣殼的相同類型的疫苗。異源疫苗也可以是表達(dá)不同fmdv血清型(例如a24、o1manisa、asia和iraq株)的衣殼的不同類型的疫苗。異源疫苗也可以是不同類型的疫苗，即fmdvvlp疫苗或fmdv病毒載體疫苗，其表達(dá)不同fmdv血清型(例如a24、o1manisa、asia和iraq株)的衣殼。在一個(gè)組中，普通豬或牛用fmdvvlp疫苗以3-5周的間隔接種兩次，然后接種重組病毒fmdv疫苗，或者用重組病毒fmdv疫苗致敏，并用fmdvvlp疫苗加強(qiáng)免疫。在另一個(gè)組中，普通豬或牛用fmdvvlp和重組病毒fmdv疫苗同時(shí)接種一次。在一個(gè)組中，mda陽(yáng)性豬或牛用fmdvvlp疫苗以3-5周的間隔接種兩次，然后用重組病毒fmdv疫苗接種疫苗，或者用重組病毒fmdv疫苗致敏，并用fmdvvlp疫苗加強(qiáng)免疫。在另一個(gè)組中，mda陽(yáng)性豬或牛用fmdvvlp和重組病毒fmdv疫苗同時(shí)接種一次。在接種疫苗后，動(dòng)物用同源或異源fmdv株攻擊。通過(guò)在普通動(dòng)物或mdv陽(yáng)性動(dòng)物中的疫苗接種攻擊來(lái)評(píng)估組合物或疫苗保護(hù)免受fmdv病原體感染的功效。通過(guò)臨床觀察和/或組織和血液中特異性病原體的病毒載量來(lái)評(píng)估保護(hù)作用。在不同階段取接種疫苗的動(dòng)物的血液樣品，并進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明，本發(fā)明的組合物或疫苗是具有免疫原性的，并且在普通動(dòng)物和mdv陽(yáng)性動(dòng)物中提供保護(hù)。***在詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案之后，應(yīng)當(dāng)理解的是，由上述實(shí)施例限定的本發(fā)明不限于以上說(shuō)明書中闡述的特定細(xì)節(jié)，因?yàn)樵诓幻撾x本發(fā)明的精神或范圍的情況下其可能存在許多明顯的變化。本文引用或參考的所有文件(“本文引用的文件”)以及本文引用的文件中引用或參考的所有文件，以及本文提及或在此引用作為參考的任何文檔中包含的任何產(chǎn)品任何制造商說(shuō)明書、描述、產(chǎn)品規(guī)格和產(chǎn)品單在此通過(guò)引用并入本文，并且可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中。序列表<110>merial,inc.audonnet,jean-christophemebatsion,teshomehannas,zahiachiang,yu-weiwidener,justin<120>fmdv重組疫苗及其用途<130>mer14-244<150>62/054,073<151>2014-09-23<160>20<170>patentinversion3.5<210>1<211>2333<212>prt<213>人工序列<220><223>a24cruzeiro株的野生型多聚蛋白(genbankaat01711)<400>1metasnthrthraspcyspheilealaleuvalhisalaileargglu151015ileargalaphepheleuproargalathrglyargmetgluphethr202530leuhisasnglygluarglysvalphetyrserargproasnasnhis354045aspasncystrpleuasnthrileleuglnleupheargtyrvalgly505560gluprophepheasptrpvaltyraspserprogluasnleuthrleu65707580glualailegluglnleuglugluleuthrglyleugluleuhisglu859095glyglyproproalaleuvaliletrpasnilelyshisleuleuhis100105110thrglyileglythralaserargprosergluvalcysmetvalasp115120125glythrasnmetcysleualaaspphehisalaglyilepheleulys130135140glyglngluhisalavalphealacysvalthrserasnglytrptyr145150155160alaileaspaspgluaspphetyrprotrpthrproaspproserasp165170175valleuvalphevalprotyraspglngluproleuasnglyglutrp180185190lysthrlysvalglnglnlysleulysglyalaglyglnserserpro195200205alathrglyserglnasnglnserglyasnthrglyserileileasn210215220asntyrtyrmetglnglntyrglnasnsermetaspthrglnleugly225230235240aspasnalaileserglyglyserasngluglyserthraspthrthr245250255serthrhisthrthrasnthrglnasnasnasptrppheserlysleu260265270alaserseralaphethrglyleupheglyalaleuleualaasplys275280285lysthrglugluthrthrleuleugluaspargileleuthrthrarg290295300asnglyhisthrthrserthrthrglnserservalglyvalthrhis305310315320glytyrserthrglugluasphisvalalaglyproasnthrsergly325330335leugluthrargvalvalglnalagluargphetyrlyslystyrleu340345350pheasptrpthrthrasplysalapheglyhisleuglulysleuglu355360365leuproserasphishisglyvalpheglyhisleuvalaspsertyr370375380alatyrmetargasnglytrpaspvalgluvalseralavalglyasn385390395400glnpheasnglyglycysleuleuvalalametvalproglutrplys405410415glupheaspthrargglulystyrglnleuthrleupheprohisgln420425430pheileserproargthrasnmetthralahisilethrvalprotyr435440445leuglyvalasnargtyraspglntyrlyslyshislysprotrpthr450455460leuvalvalmetvalvalserproleuthrvalasnasnthrserala465470475480alaglnilelysvaltyralaasnilealaprothrtyrvalhisval485490495alaglygluleuproserlysgluglyilepheprovalalacysala500505510aspglytyrglyglyleuvalthrthraspprolysthralaasppro515520525alatyrglylysvaltyrasnproproargthrasntyrproglyarg530535540phethrasnleuleuaspvalalaglualacysprothrpheleucys545550555560pheaspaspglylysprotyrvalthrthrargthraspaspthrarg565570575leuleualalyspheaspleuserleualaalalyshismetserasn580585590thrtyrleuserglyilealaglntyrtyrthrglntyrserglythr595600605ileasnleuhisphemetphethrglyserthraspserlysalaarg610615620tyrmetvalalatyrileproproglyvalgluthrproproaspthr625630635640progluargalaalahiscysilehisalaglutrpaspthrglyleu645650655asnserlysphethrpheserileprotyrvalseralaalaasptyr660665670alatyrthralaseraspthralagluthrileasnvalglnglytrp675680685valcysiletyrglnilethrhisglylysalagluasnaspthrleu690695700valvalservalseralaglylysaspphegluleuargleuproile705710715720aspproargglnglnthrthralathrglygluseralaaspproval725730735thrthrthrvalgluasntyrglyglygluthrglnileglnargarg740745750hishisthraspileglypheilemetaspargphevallysilegln755760765serleuserprothrhisvalileaspleumetglnthrhisglnhis770775780glyleuvalglyalaleuleuargalaalathrtyrtyrpheserasp785790795800leugluilevalvalarghisgluglyasnleuthrtrpvalproasn805810815glyalaprogluseralaleuleuasnthrserasnprothralatyr820825830asnlysalaprophethrargleualaleuprotyrthralaprohis835840845argvalleualathrvaltyrasnglythrserlystyralavalgly850855860glyserglyargargglyaspmetglyserleualaalaargvalval865870875880lysglnleuproalaserpheasntyrglyalailelysalaaspala885890895ilehisgluleuleuvalargmetlysargalagluleutyrcyspro900905910argproleuleualailegluvalserserglnasparghislysgln915920925lysileilealaproalalysglnleuleuasnpheaspleuleulys930935940leualaglyaspvalgluserasnproglyprophephepheserasp945950955960valargserasnpheserlysleuvalaspthrileasnglnmetgln965970975gluaspmetserthrlyshisglyproasppheasnargleuvalser980985990alapheglugluleualathrglyvallysalaileargthrglyleu99510001005aspglualalysprotrptyrlysleuilelysleuleuserarg101010151020leusercysmetalaalavalalaalaargserlysaspproval102510301035leuvalalailemetleualaaspthrglyleugluileleuasp104010451050serthrphevalvallyslysileseraspserleuserserleu105510601065phehisvalproalaprovalpheserpheglyalaproileleu107010751080leualaglyleuvallysvalalaserserphepheargserthr108510901095progluaspleugluargalaglulysglnleulysalaargasp110011051110ileasnaspilephealaileleulysasnglyglutrpleuval111511201125lysleuileleualaileargasptrpilelysalatrpileala113011351140sergluglulysphevalthrthrthraspleuvalproglyile114511501155leuglulysglnargaspleuasnaspproserlystyrlysglu116011651170alalysglutrpleuaspasnalaargglnalacysleulysser117511801185glyasnvalhisilealaasnleucyslysvalvalalaproala119011951200proserargserargprogluprovalvalvalcysleuarggly120512101215lysserglyglnglylysserpheleualaasnvalleualagln122012251230alaileserthrhisphethrglyargthraspservaltrptyr123512401245cysproproaspproasphispheaspglytyrasnglnglnthr125012551260valvalvalmetaspaspleuglyglnasnproaspglylysasp126512701275phelystyrphealaglnmetvalserthrthrglypheilepro128012851290prometalaserleugluasplysglylyspropheasnserlys129513001305valileilealathrthrasnleutyrserglyphethrproarg131013151320thrmetvalcysproaspalaleuasnargargphehispheasp132513301335ileaspvalseralalysaspglytyrlysileasnas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