專利名稱：基因重組乙肝病毒表面抗原的基因修飾序列及其產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型基因重組乙型肝炎病毒表面抗原(PreS1+PreS2+S)DNA的序列修飾與重組目的蛋白質(zhì)的高效表達(dá)，及其目的蛋白質(zhì)的高度特異性和穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
1、流行病學(xué)概況乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染所致的乙型肝炎，是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球61億人口中有2.16億人為乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)攜帶者，其中78％分布在亞太地區(qū)，我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，約8％-12％的人群(1.2億左右)為HBsAg攜帶者，約占全世界HBsAg攜帶人口的50％。HBV的感染不僅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且還與肝硬化和肝癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。我國慢性肝炎人數(shù)超過1000萬，其中80％以上為乙肝患者。在肝硬化病人中，60-80％為HBV感染者。約有1/4的HBV攜帶者將最終發(fā)展成為肝硬化和肝癌，每年全世界至少有一百萬人因此而死亡。因此，HBV感染在全世界尤其在我國是一個(gè)極其嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。2、HBV基因結(jié)構(gòu)和功能乙型肝炎病毒基因組為一部分雙鏈的環(huán)狀DNA分子，約3200個(gè)堿基組成。HBV基因基因組分為S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)及X區(qū)。S區(qū)又分為S、PreS1與PreS2三個(gè)基因區(qū)。S區(qū)(678個(gè)核苷酸)、PreS2區(qū)(前S2，165個(gè)核苷酸)基因數(shù)是固定的，分別編碼226個(gè)和55個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈；而PreS1(前S1)區(qū)堿基數(shù)在不同亞型有所差別，長度在324-357個(gè)核苷酸之間，編碼約108-119個(gè)氨基酸。C區(qū)基因編碼HBcAg。P區(qū)最長，編碼一種依賴RNA的RNA多聚酶。X區(qū)基因編碼的蛋白功能尚未確定。
S基因區(qū)為HBV DNA一個(gè)重要的開放讀碼框架(ORF)，該區(qū)依次分為PreS1、PreS2、S三個(gè)區(qū)段，分別編碼HBV的外衣殼蛋白(PreS1、PreS2、HBsAg抗原)。由226個(gè)氨基酸組成的S蛋白稱為小蛋白(S)，是HBV表面抗原的主要組成部分；由PreS2和S區(qū)的281個(gè)氨基酸共同組成的蛋白稱為中蛋白(M)；由PreS1、PreS2、S區(qū)的389-400個(gè)氨基酸組成S區(qū)大蛋白(L)。S基因區(qū)編碼蛋白，是裝配病毒顆粒的主要成分，也是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體(或稱為保護(hù)性抗體)的主要抗原。特別是由PreS2區(qū)編碼的由55個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，含有豐富的不依賴二硫鍵的連續(xù)抗原決定簇，因而具有比S更強(qiáng)的免疫原性。PreS2還含有人血清白蛋白受體(PHSA-R)，HBV可籍此由多聚血清白蛋白介導(dǎo)吸附于肝細(xì)胞表面，這也是HBV嗜肝性感染的重要分子基礎(chǔ)。新近大量研究證實(shí)，人肝細(xì)胞具有PreS1多肽受體，經(jīng)PreS2-多聚血清白蛋白介導(dǎo)，PreS1區(qū)直接與肝細(xì)胞膜結(jié)合而導(dǎo)致HBV感染的發(fā)生。PreS1和PreS2均有阻止HBV入侵肝細(xì)胞的作用。
在自然狀態(tài)下，HBV呈現(xiàn)出具有感染力的約42nm的病毒顆粒稱為Dane顆粒，其外膜蛋白作為疫苗的主要成分，因?yàn)?1)全部序列是已知的；(2)不具有感染力；(3)可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生抗體。3、乙型肝炎的治療與預(yù)防現(xiàn)狀有關(guān)乙型肝炎的抗病毒治療一直是相關(guān)領(lǐng)域研究與開發(fā)的熱點(diǎn)，并且已經(jīng)出現(xiàn)了許多化學(xué)合成藥、天然植物藥和生物抗病毒因子如干擾素等藥物，但迄今為止，世界范圍內(nèi)抗乙肝病毒的藥物和治療方法都達(dá)不到理想效果。因此目前控制乙肝感染與流行的唯一有效措施是接種乙肝疫苗。
目前，所使用的乙肝疫苗分為三代。第一代乙肝疫苗為血液來源的HBsAg主蛋白顆粒，雖然曾經(jīng)在預(yù)防和控制乙型肝炎方面發(fā)揮了巨大的作用，但存在著突出的潛在安全性和原料(HBsAg陽性血液)來源限制的問題。1986年美國Merck公司的酵母表達(dá)系統(tǒng)基因工程乙肝疫苗的研發(fā)成功標(biāo)志著第二代乙肝疫苗(單S組分基因工程乙肝疫苗)的誕生，隨后其他國家(公司)的酵母表達(dá)系統(tǒng)或CHO表達(dá)系統(tǒng)基因工程單S組分乙肝疫苗也紛紛上市。目前，第一代血源性乙肝疫苗已經(jīng)在世界上部分國家被禁止使用。第二代乙肝疫苗主要有兩類重組酵母疫苗和重組CHO疫苗?；蛑亟M乙肝疫苗具有與血源性乙肝疫苗相同的效率，免疫原性好，安全性好，90％左右的接種者都能產(chǎn)生保護(hù)性抗體，抵抗HBV感染。重組疫苗在世界上廣泛應(yīng)用，在預(yù)防和控制乙型肝炎中發(fā)揮著重要作用。但在人群預(yù)防接種后的統(tǒng)計(jì)學(xué)證實(shí)，約有10％的人群對(duì)基因重組乙肝疫苗無免疫應(yīng)答產(chǎn)生。另外還發(fā)現(xiàn)了S主蛋白的免疫逃逸突變株(中國專利，專利號(hào)00123612)。
研究表明，HBV表面抗原的PreS區(qū)(包括PreS1和PreS2)可能在HBV感染和抗感染的過程中起著重要作用。雖然HBV表面抗原基因S區(qū)編碼蛋白(HBsAg主蛋白)是裝配病毒顆粒外殼的主要成分，也是刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原，但PreS2肽段含有人多聚血清白蛋白受體(PHSA-R)，HBV可籍此由多聚血清白蛋白介導(dǎo)吸附于肝細(xì)胞表面，而人肝細(xì)胞上有PreS1多肽受體，經(jīng)PreS2-多聚血清白蛋白介導(dǎo)，PreS1區(qū)直接與肝細(xì)胞膜結(jié)合而導(dǎo)致HBV感染的發(fā)生，這可能是HBV嗜肝性感染的重要分子基礎(chǔ)。PreS1和PreS2區(qū)肽段上都含有B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞激活表位，不但能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)性的抗體，而且還能激活T淋巴細(xì)胞，以細(xì)胞免疫反應(yīng)的方式增強(qiáng)機(jī)體抵抗乙肝病毒感染的能力。由PreS2區(qū)編碼的由55個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，含有豐富的不依賴二硫鍵的連續(xù)抗原決定簇，具有比S更強(qiáng)的免疫原性。有報(bào)道證實(shí)，在病毒感染過程中，抗PreS的抗體出現(xiàn)早于S抗體，且PreS肽段的存在能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)S蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。Merck公司1987年申請的一個(gè)中國專利(專利號(hào)87100465，1996年7月17日授權(quán))中描述，針對(duì)PreS1或PreS2的抗體在體外實(shí)驗(yàn)中都具有阻斷乙肝病毒與肝細(xì)胞之間結(jié)合的作用，而單獨(dú)的抗表面抗原S蛋白(不含PreS區(qū))的抗體則不具有這種功能。
由于以上原因，早在第二代乙肝疫苗上市之前和/或上市之初，各國即已開始研究與開發(fā)免疫效力更高的新一代基因重組乙肝疫苗，即第三代疫苗在重組單S疫苗基礎(chǔ)上，增加PreS2和PreS1區(qū)段。第三代疫苗將增加疫苗的免疫效率，并有可能實(shí)現(xiàn)95％以上的接種者獲得免疫力。
目前，美國、日本、英國、以色列、法國、比利時(shí)、意大利、新加坡等國家已先后完成了第三代真核系統(tǒng)基因工程乙肝疫苗(PreS1+PreS2+HBs，3S乙肝疫苗)的基礎(chǔ)與臨床研究，研究結(jié)果證實(shí)，這種“3S”疫苗在黑猩猩、BALb/c和SWR/J小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人群研究中均能產(chǎn)生高于重組單HBs疫苗的抗體水平和T細(xì)胞免疫應(yīng)答；并且可使約75％的對(duì)單HBs疫苗不反應(yīng)的人群產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。英國和以色列今年已經(jīng)正式上市該產(chǎn)品。這種新型的乙肝病毒表面抗原“3S”疫苗的免疫效率已被國際公認(rèn)。4、基因工程新型乙肝疫苗(HBs+preS1+preS2)序列和表達(dá)技術(shù)的專利概況近十余年來，關(guān)于新一代基因工程乙肝疫苗的研究與專利非常之多，新一代基因重組乙肝疫苗(HBs+PreS)研究的專利技術(shù)主要集中在1)HBsAg帶有PreS1或PreS2，或同時(shí)帶有PreS1+PreS2區(qū)的乙肝病毒表面抗原(即HBsAg中蛋白或大蛋白)基因序列及其新型疫苗的應(yīng)用研究；2)乙肝病毒表面抗原和核心抗原(HbcAg)的融合抗原疫苗；3)新型重組乙肝疫苗高產(chǎn)量表達(dá)系統(tǒng)及工藝；4)糖基化和表達(dá)顆粒的組成及空間構(gòu)型對(duì)免疫效力的影響；5)各種抗原載體(如脂質(zhì)體和多肽載體等)和新型免疫佐劑等。
在上述專利中，現(xiàn)有的基因工程單S苗(HBsAg小蛋白)中添加PreS成分是新一代乙肝疫苗研究的核心。已查閱到的國內(nèi)外公示的涉及到帶有PreS的乙肝表面抗原的專利就有300多條，其中涉及PreS區(qū)參與乙肝疫苗構(gòu)建專利達(dá)100多條，這些專利主要來自于美國、法國、英國、日本、以色列、中國等。
現(xiàn)僅就國內(nèi)外對(duì)乙肝病毒表面抗原帶有PreS區(qū)抗原的大或中蛋白疫苗的DNA序列結(jié)構(gòu)的主要代表性專利歸納如下(1).PreS1+PreS2+S自然全序列。
日本武田公司1988年4月申請的中國專利，專利申請?zhí)?8102178；Merck公司1987年1月28日申請的中國專利，申請?zhí)?7100465；江西醫(yī)學(xué)院饒偉華1998年8月14日申請的中國專利，申請?zhí)?8117171；(2).PreS1(糖基化位點(diǎn)之一，PreS1的N端第四個(gè)氨基酸突變)+PreS2+S序列；(Merck公司1993年6月30日申請的PCT專利，專利號(hào)WO9401132A1)(3).PreS1(去掉N端第2到第15個(gè)氨基酸)+PreS2+S序列；(Merck公司1987年1月28日申請的歐洲專利，專利號(hào)EP0244924B1)(4).PreS1(去掉N端第1到第15個(gè)氨基酸)+PreS2+S序列；(Merck公司1987年1月28日申請的中國專利，申請?zhí)?7100465)(5).PreS1(缺失N端第1到第20個(gè)氨基酸)+PreS2+S序列；(汪垣等1994年4月25日申請的中國專利，申請?zhí)?4112133)(6).PreS(第12個(gè)氨基酸)+PreS(第14-52個(gè)氨基酸)+PreS(第133-145個(gè)氨基酸)+S(第175-400個(gè)氨基酸)氨基酸組成序列；(SmithKline公司1990年7月25日在中國申請的專利，申請?zhí)?0107172)(7).PreS(第12-52個(gè)氨基酸)+PreS(第133-145個(gè)氨基酸)+S(第175-400個(gè)氨基酸)的重組序列；(SmithKline公司1990年7月25日在中國申請的專利，申請?zhí)?0107172)(8).PreS2+S順置序列；(Merck公司1993年6月30日申請的PCT專利，專利號(hào)WO9401132A1；中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所田淑芳等，專利號(hào)93102498)(9).PreS2(糖基化位點(diǎn)之一，PreS2的N端第四個(gè)氨基酸突變)+S序列；(Merck公司1993年6月30日申請的PCT專利，專利號(hào)WO9401132A1)(10).PreS1(幾到幾十個(gè)氨基酸的)小肽片段+S序列；(參見Medeva公司1991年12月19日和1994年6月10日申請的美國專利，專利號(hào)分別為6020167和6022543)(11).PreS2(第120到第146個(gè)氨基酸)+S+PreS1(preS1的第21到第47個(gè)氨基酸)的倒置重組序列；(汪垣等1996年7月4日申請中國專利，申請?zhí)?6116417)(12).S+PreS1(第21到第47個(gè)氨基酸)的倒置重組序列；(汪垣等1994年3月10日申請的中國專利，申請?zhí)?4112069；中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所田淑芳等2000年8月31日申請的的中國專利，申請?zhí)?0123612)在以上抗原序列中，(1)到(10)采用的是(完整或部分缺失的)PreS1+(完整或部分缺失的)PreS2+(完整或部分缺失的)S區(qū)的模式；(11)到(12)采取的是將(完整或部分缺失的)PreS1區(qū)連接到S區(qū)的3’端(即PreS1與S順序倒置)的模式。
在宿主表達(dá)系統(tǒng)上，各專利采取了多種不同的技術(shù)路線。歸納主要有酵母細(xì)胞系統(tǒng)和CHO系統(tǒng)兩種。CHO系統(tǒng)能夠使表達(dá)抗原的糖基化和空間構(gòu)型盡量地接近自然狀況，從而使之保持比較好的免疫原性，然而其表達(dá)量太低一直是工業(yè)化過程中的瓶頸。美國Merck公司和一些歐洲公司的諸多研究專利(如中國專利87100465和美國專利4816564)認(rèn)為酵母細(xì)胞也是一個(gè)非常好的表達(dá)宿主系統(tǒng)，一方面其表達(dá)較高，另一方面表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性也已經(jīng)被第二代乙肝疫苗所證明(目前世界上使用的第二代基因工程乙肝疫苗大多采用酵母表達(dá)系統(tǒng))。另外，Merck公司在另一些專利中(如中國專利92104291和PCT專利WO9401132A1)正在嘗試使用糖基化缺陷型的酵母細(xì)胞和使含PreS區(qū)的乙肝表面抗原基因的一些糖基化位點(diǎn)突變的方法來改進(jìn)免疫原性。
上述含PreS區(qū)的新型乙肝疫苗構(gòu)建技術(shù)中，無論是酵母或CHO系統(tǒng)，大多采用了質(zhì)?；蚨幻绮《据d體的重組疫苗表達(dá)系統(tǒng)，如日本武田公司采用了pGLD LP39-RcT、PGLDLIIP39-RcT等系列載體表達(dá)系統(tǒng)；美國Merck公司采用PKHBS等系列質(zhì)粒重組表達(dá)系統(tǒng)，中國科學(xué)院生化所構(gòu)建的重組痘苗表達(dá)系統(tǒng)，還有其他各國公司與研究單位采用了經(jīng)改造的不同質(zhì)粒。
此外，Scripps Clinic and Research Foundation(美國)(1987年6月20日申請的中國專利，申請?zhí)?7105411)和紐約血庫公司(1987年4月27日申請的中國專利，申請?zhí)?7102945)采取的是(合成的或重組表達(dá)的)PreS區(qū)小肽(對(duì)應(yīng)一個(gè)或幾個(gè)B或T淋巴細(xì)胞表位的抗原決定族，6個(gè)氨基酸以上，50個(gè)氨基酸以下)+脂質(zhì)體載體構(gòu)建疫苗的方法，其中紐約血庫公司認(rèn)為PreS(第120到174個(gè)氨基酸)小肽的免疫效果最好。紐約血庫公司還以此為基礎(chǔ)建立了一整套PreS1和PreS2抗原抗體測定方法，并制作了相應(yīng)的試劑盒。
由于采用自然全序列乙肝病毒表面抗原基因來構(gòu)建第三代基因工程乙肝疫苗的方法存在著表達(dá)量太低(日本武田化學(xué)工業(yè)公司在酵母培養(yǎng)中可得到50毫克/升的目的蛋白表達(dá)量只是其中的特例，大部分研究只能達(dá)到幾毫克/升的表達(dá)水平，CHO系統(tǒng)的表達(dá)量就更低)，或含PreS區(qū)成分太少，或免疫效力太低的問題。有一些研究結(jié)果提示，天然PreS區(qū)可能會(huì)影響整個(gè)表面抗原基因在宿主中的表達(dá)，或者由于翻譯過程和PreS區(qū)蛋白酶敏感位點(diǎn)的影響，大部分表達(dá)產(chǎn)物中仍然只有很少的PreS區(qū)存在。如上所述，一些研究者采用基因修飾及改造技術(shù)，經(jīng)過對(duì)前S區(qū)部分片段的缺失或部分位點(diǎn)突變的PreS區(qū)加上完整或部分缺失的S區(qū)、或者將完整或部分缺失的PreS區(qū)連接到S區(qū)的3‘端(即PreS與S順序倒置)、或者僅用PreS1或PreS2的部分小肽片段(表達(dá)或化學(xué)合成)，再以脂質(zhì)體或其他載體連接作抗原遞呈、或者雙質(zhì)粒或多質(zhì)粒表達(dá)，此時(shí)甚至可以加上乙肝病毒核心抗原片段或丙丁戊肝病毒的一些抗原等各種方法來解決這一問題。
Merck公司還采用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)實(shí)行不同抗原位點(diǎn)組合，并控制不同抗原成分在最終表達(dá)顆粒中的比例(如核心抗原和表面抗原的比例，或S抗原和PreS抗原的比例，分別可以從1∶1到20∶1)。遼寧天成生物制藥研究所在中國專利01103990中也有類似的做法。
Medeva公司(美國專利6020167和6022543)則以完整的S主蛋白作為顆粒形成和抗原遞呈的載體，以融合蛋白的方式將PreS(主要是PreS1)小片段或乙肝病毒核心抗原小片段整合到表達(dá)顆粒上而實(shí)現(xiàn)其免疫原性，并且通過使表達(dá)顆?？臻g構(gòu)型模擬自然乙肝病毒Dane顆粒的方法提高免疫效力。而江西醫(yī)學(xué)院的饒偉華(中國專利98117171)則構(gòu)建了包含PreS1+PreS2+S全序列的核酸疫苗，據(jù)稱只須一次接種，免疫保護(hù)效果較好；國外有幾家公司如Merck也在進(jìn)行核酸疫苗的研究工作，但核酸疫苗本身的技術(shù)還不成熟，還有不少技術(shù)問題需要解決。
以上專利中除中國專利93102498表明表達(dá)量為2.5毫克/升外，都沒有明確披露表達(dá)量，并且大多至今未產(chǎn)業(yè)化，提示其中尚存在一些沒有解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供用于在宿主細(xì)胞，特別是真核酵母細(xì)胞中高效表達(dá)異源重組蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于適宜于在宿主細(xì)胞，特別是真核酵母細(xì)胞中高效表達(dá)特異性高、穩(wěn)定性好、具有更佳免疫效率的新型重組乙型肝炎病毒表面抗原(PreS1+PreS2+S)的DNA基因序列。發(fā)明詳述一、乙肝表面抗原基因cDNA的擴(kuò)增及克隆乙肝病毒分有數(shù)種亞型，即adw，adr，ayw和ayr，各型之間的DNA序列稍有差異。本發(fā)明的目的是高效表達(dá)包含有PreS1，PreS2多肽和S蛋白的乙肝抗原重組蛋白，使其成為新型乙肝疫苗、診斷試劑、治療藥物，故重點(diǎn)是如何表達(dá)出具有天然乙肝抗原免疫活性的乙肝表面抗原蛋白分子。
本發(fā)明所用的乙肝病毒DNA來自中國乙肝病人血清，經(jīng)常規(guī)PCR方法獲得乙肝表面抗原基因cDNA片斷，將cDNA片斷首先克隆于puc-18載體質(zhì)粒中，經(jīng)序列測定確定乙肝表面抗原基因序列。如圖1所示。
在此步驟中，圖2表示用于放大擴(kuò)增乙肝表面抗原基因cDNA各片斷的多聚核苷酸引物，其中N代表的是用于克隆puc-18載體質(zhì)?？寺∥稽c(diǎn)的DNA序列，使用不同組合經(jīng)PCR反應(yīng)獲得乙肝表面抗原基因各cDNA片斷，如圖3所示。PCR反應(yīng)條件為94℃ 2’94℃30”→42℃ 30”→72℃ 60”3572℃10’→4℃PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖膠分離純化后，克隆于puc-18載體質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入JM109鈣化大腸桿菌敏感細(xì)胞，再經(jīng)PCR測定獲得含各cDNA片斷的陽性克隆株。
純化陽性克隆株中的載體質(zhì)粒DNA，經(jīng)DNA序列測定后，確認(rèn)含乙肝表面抗原基因片斷的陽性克隆株。圖4、圖5所示為乙肝表面抗原PreS1+PreS2+S基因序列測序圖和序列表。二、構(gòu)建乙肝表面抗原表達(dá)重組體(cassette)在HBsAg表達(dá)及修飾中，糖基化是維持HBsAg免疫原性的重要部分。由于原核細(xì)胞，如大腸桿菌，缺乏糖基化功能，不能有效地使表達(dá)物糖基化，故HBsAg的表達(dá)必須在真核或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明選擇酵母細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)。
構(gòu)建酵母表達(dá)系統(tǒng)重組體(cassette)，選用啟動(dòng)子為甲醇氧化酶的啟動(dòng)子(AOX1)序列，經(jīng)限制性未端延伸技術(shù)，將AOX1基因5端cDNA片斷、HBsAg cDNA和AOX13端cDNA片斷組裝在一起，形成用于轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞表達(dá)新型帶有PreS1+PreS2+ScDNA基因序列的乙肝疫苗的表達(dá)復(fù)合體，見圖6。三、轉(zhuǎn)化篩選乙肝表面抗原表達(dá)株采用改良后的HO在1983年提出的氯化鋰方法，將表達(dá)復(fù)合體融合于酵母菌染色體中。具體方法為1、制備轉(zhuǎn)化用細(xì)胞取25ml30℃培養(yǎng)至OD600為1.0的細(xì)胞液，經(jīng)無菌蒸餾水洗滌1次，室溫1500g離心10分鐘，細(xì)胞沉淀用TE溶液洗滌1次，室溫1500g離心10分鐘，再將細(xì)胞沉淀懸浮于10ml氯化鋰溶液中，30℃培養(yǎng)，2小時(shí)取50μl分裝于無菌試管中備用。2、轉(zhuǎn)化取10μg待轉(zhuǎn)化DNA加入到含50μl轉(zhuǎn)化細(xì)胞試管中，30℃培養(yǎng)30分鐘加入0.3ml含40％聚乙二醇(PEG-3350)的氯化鋰溶液，30℃培養(yǎng)30分鐘，將轉(zhuǎn)化管放入40℃水溶液中熱休克5分鐘，離心后加入0.6ml滅菌蒸餾水懸浮細(xì)胞，分別取0.1ml，0.2ml和0.3ml接種于YPD瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，可見表面光滑、濕潤、圓形的單個(gè)白色酵母菌落。3、篩選轉(zhuǎn)化陽性細(xì)胞挑取光滑單個(gè)菌落，分別接種瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，選擇典型菌株，經(jīng)PCR確定是否含有轉(zhuǎn)化的HBsAg基因，如圖7所示。表達(dá)HBsAg所使用的啟動(dòng)子是AOX1，在甲醇的誘導(dǎo)下，AOX1基因啟動(dòng)，并開始表達(dá)融合在其下方的“3S序列”的HBsAg基因。四、表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)活性乙肝表面抗原蛋白多數(shù)表達(dá)乙肝表面抗原菌株，不能形成具有天然乙肝表面抗原聚合體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，又由于PreS多肽對(duì)于存在于細(xì)胞中的蛋白酶異常敏感，故表達(dá)出含有PreS多肽的乙肝表面抗原較為困難。為了達(dá)到獲得類似天然結(jié)構(gòu)的乙肝表面抗原，修飾PreS區(qū)段的蛋白酶敏感區(qū)或在純化過程中加入蛋白酶抑制劑等方法已有眾多報(bào)道。
本發(fā)明選擇通過切除編碼PreS多肽cDNA5’末端不同區(qū)段的DNA片斷，保留原始起始編碼“met”的編碼ATG，連接于后續(xù)不同位置的氨基酸編碼DNA序列5’未端，形成不同大小的重組乙肝表面抗原cDNA基因序列，通過前述的轉(zhuǎn)化表達(dá)及測定，篩選出最佳表達(dá)菌株。圖8所示的是不同大小cDNA重組表達(dá)株所表達(dá)的重組乙肝表面抗原和抗S，抗PreS，抗PreS1，抗PreS2抗體反應(yīng)的ELLSA結(jié)果。
經(jīng)過大量試驗(yàn)，本發(fā)明最終確定，切除PreS1第2-14位氨基酸序列、第2-15位氨基酸序列、第2-19位氨基酸序列后形成的重組乙肝表面抗原表達(dá)物((-2？14、-2？15、-2？19)PreS1+PreS2+S HBsAg蛋白)具有較好的自然乙肝表面抗原的特性，其中以切除PreS1第2-19位氨基酸序列后形成的重組乙肝表面抗原表達(dá)物((-2？19)PreS1+PreS2+S HBsAg蛋白)具有最接近自然乙肝表面抗原的特性，其DNA序列如圖9測序圖、圖10序列表，其表達(dá)物的SDS-PAGE膠圖片如圖11，其表達(dá)物的電鏡圖片(圖12)顯示，該重組蛋白可形成類似天然20nm顆粒的多聚體結(jié)構(gòu)。圖13為(-2？19)PreS1+PreS2+S HBsAg蛋白聚合體的免疫電鏡照片。


圖1經(jīng)PCR方法獲得乙肝表面抗原基因cDNA片斷，將cDNA片斷首先克隆于puc-18載體質(zhì)粒中，經(jīng)序列測定確定乙肝表面抗原基因序列。
圖2用于放大擴(kuò)增乙肝表面抗原基因cDNA各片斷的多聚核苷酸引物，其中N代表的是用于克隆puc-18載體質(zhì)?？寺∥稽c(diǎn)的DNA序列。
圖3使用不同組合，經(jīng)PCR反應(yīng)獲得的乙肝表面抗原基因各cDNA片斷。1道為DNA標(biāo)記；2道為帶有銜接子序列的HBsAg cDNA片斷；3道為HBsAg S1-S2 cDNA片斷，約1250bp；4道為HBsAg S2-S cDNA片斷，約850bp；5道為HBsAg S cDNA片斷，約670bp。
圖4PreS1+PreS2+S HBsAg DNA序列測序圖。
圖5PreS1+PreS2+S HBsAg DNA、蛋白質(zhì)序列。
圖6用于酵母表達(dá)系統(tǒng)多位點(diǎn)融合重組HBsAg表達(dá)盒。所述表達(dá)盒可以被整合到任何甲基營養(yǎng)型酵母的HIS、LEU2、ARG4、TRP1和URA3基因中。
圖7不同大小cDNA重組表達(dá)株的PCR分析。1道為DNA標(biāo)記；2道為HBsAg S；3道為HBsAg S2+S；4道為S1-2～19+S2+S；道5為S2+S；道6為S1+S2+S。
圖8不同大小cDNA重組表達(dá)株所表達(dá)的重組HBsAg和抗S，抗PreS，抗PreS1，抗PreS2抗體反應(yīng)的ELLSA結(jié)果。
圖9-2至19)PreS1+PreS2+S HBsAg DNA序列測序10-2至19)PreS1+PreS2+S HBsAg DNA、蛋白質(zhì)序列表圖11-2至19)PreS1+PreS2+S HBsAg表達(dá)物的SDS-PAGE膠照片。第1道蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；第2道初培養(yǎng)誘導(dǎo)裂解物；第3、4、5道三批培養(yǎng)誘導(dǎo)裂解物；第6道為誘導(dǎo)培養(yǎng)裂解物。
圖12電鏡觀察純化重組聚合HBs-preS1-preS2蛋白形態(tài)特征的照片，磷鎢酸負(fù)染色。放大倍數(shù)80000×3?；蚬こ绦滦鸵腋我呙缂兓酆系鞍?(-2至19)PreS1+PreS2+SHBsAg)，蛋白顆粒直徑大約在30-50nm之間。聚合蛋白呈均勻散在分布，表面不光滑，有絨毛樣突起，呈不規(guī)則線形分枝狀排列，其尖端稍膨大呈小球形。也有散在小顆粒聚合蛋白呈現(xiàn)圖13免疫電鏡觀察純化重組聚合HBs-preS1-preS2蛋白形態(tài)特征，磷鎢酸負(fù)染色。放大倍數(shù)40000×3。基因工程新型乙肝疫苗純化聚合蛋白((-2至19)PreS1+PreS2+SHBsAg)，與抗HBs單克隆抗體反應(yīng)后的電鏡形態(tài)。圖中可見，表面不光滑、有絨毛樣突起、呈不規(guī)則線形分枝狀排列的“3S”重組蛋白，與特異性抗HBs單克隆抗體結(jié)合后所形成的免疫復(fù)合物，因抗原抗體結(jié)合而聚集成密集網(wǎng)狀或團(tuán)塊。
圖14重組(-2至19)PreS1+PreS2+S蛋白(本發(fā)明重組蛋白)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。樣品10倍稀釋，37℃加速反應(yīng)。檢測間隔時(shí)間2填，37℃觀測28天結(jié)果。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步加以說明。實(shí)施例1乙肝表面抗原基因cDNA的擴(kuò)增及克隆本發(fā)明所用的乙肝病毒DNA來自中國乙肝病人血清，經(jīng)常規(guī)PCR方法擴(kuò)增獲得乙肝表面抗原基因cDNA片斷，將各cDNA片斷首先克隆于puc-18載體質(zhì)粒中，經(jīng)序列測定確定乙肝表面抗原基因序列，如圖1所示。
在此步驟中，圖2所列的是用于放大擴(kuò)增乙肝表面抗原基因cDNA各片斷的多聚核苷酸引物，其中N代表的是用于克隆于puc-18載體質(zhì)粒克隆位點(diǎn)的DNA序列，使用不同組合經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得乙肝表面抗原基因各cDNA片斷，如圖3所示。PCR反應(yīng)條件為94℃ 2分鐘；94℃ 30秒→42℃ 30秒→72℃ 60秒，共35個(gè)循環(huán)周期后，再72℃ 10分鐘→4℃。經(jīng)1.5％瓊脂糖膠分離純化后，克隆于puc-18載體質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入JM109鈣化的敏感大腸桿菌細(xì)胞，再經(jīng)PCR測定獲得含各cDNA片斷的陽性克隆株。
純化陽性克隆株中的載體質(zhì)粒DNA，經(jīng)DNA序列測定后，確認(rèn)含乙肝表面基因片斷的陽性克隆株，圖4、圖5所示為乙肝表面抗原PreS1+PreS2+S基因序列測序圖和序列表。實(shí)施例2構(gòu)建乙肝表面抗原PreS1 N端不同位點(diǎn)的氨基酸酶切修飾的乙肝表面抗原表達(dá)序列與重組體為篩選并最終獲得高效表達(dá)具有接近天然乙肝表面抗原蛋白結(jié)構(gòu)與理想的免疫效果，本發(fā)明選擇畢赤酵母細(xì)胞系統(tǒng)為表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建系列修飾酶切的HBV的(-2、-2至3、-2至4、-2至5、-2至6、-2至7、-2至8、-2至9、-2至14、-2至15、-2至19)PreS1+PreS2+S的cDNA表達(dá)序列，并分別構(gòu)建酵母-HBV-的(-2、-2至3、-2至4、-2至5、-2至6、-2至7、-2至8、-2至9、-2至14、-2至15、-2至19)PreS1+PreS2+S表面抗原表達(dá)系統(tǒng)盒(cassette)，選用啟動(dòng)子是甲醇氧化啟動(dòng)子(AOX1)序列，經(jīng)限制性末端延伸技術(shù)，將AOX1基因5’端cDNA片斷、乙肝表面抗原cDNA和AOX1 3’端cDNA片斷共同組裝在一起，形成用于轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞的表達(dá)復(fù)合體，見圖6。實(shí)施例3轉(zhuǎn)化與篩選乙肝表面抗原表達(dá)株1、采用HO等在1983提出的氯化鋰方法，經(jīng)改良后，將表達(dá)復(fù)合體融合于酵母細(xì)胞染色體中，具體方法為發(fā)明詳述“三”所述。2、如圖7所示，表達(dá)乙肝表面抗原所使用的啟動(dòng)子是AOX1啟動(dòng)子。在培養(yǎng)液中存在甲醇的狀態(tài)下，AOX1啟動(dòng)進(jìn)而表達(dá)融合在其下方的乙肝表面抗原基因。3、ELISA方法鑒定篩選不同酶切修飾構(gòu)建的系列HBV-的(-2、-2至3、-2至4、-2至5、-2至6、-2至7、-2至8、-2至9、-2至14、-2至15、-2至19)PreS1+PreS2+S的酵母系統(tǒng)乙肝表面抗原表達(dá)物的特異性和表達(dá)量等。不同重組表達(dá)株所表達(dá)的重組乙肝表面抗原和抗S、抗PreS1、抗Pres2抗體反應(yīng)的ELLSA結(jié)果如圖8所示。實(shí)施例4基因修飾表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)活性乙肝表面抗原蛋白(-2至19PreS1+PreS2+S)酵母表達(dá)系統(tǒng)鑒定本發(fā)明通過去除編碼PreS多肽cDNA5’末端不同位置的DNA片斷，保留原始起始編碼“met”的編碼ATG連接于后續(xù)不同位置的氨基酸編碼DNA，形成不同大小的重組乙肝表面基因，通過前述的轉(zhuǎn)化表達(dá)及測定，篩選最佳表達(dá)菌株。圖8所示的是不同大小重組表達(dá)株所表達(dá)的重組乙肝表面抗原和抗S、抗PreS1、抗Pres2抗體反應(yīng)的ELLSA結(jié)果。
研究結(jié)果證實(shí)1)本發(fā)明所建立的以酶切去除PreS1第2-19位氨基酸((-2至19)PreS1+PreS2+S(表示切除了PreS1 N端的從2-19序列的氨基酸)乙肝表面抗原酵母表達(dá)系統(tǒng)，能夠高效表達(dá)包含從PreS1 N端第20為氨基酸及后續(xù)所有表面抗原成分的蛋白(大于1000毫克/升培養(yǎng)物)；2)如圖11所示，經(jīng)SDS-PAGE膠證實(shí)，(-2至19)PreS1+PreS2+S抗原蛋白的分子量約為42KD，與天然乙肝PreS1+PreS2+S抗原分子量(42KD)基本一致；3)具有自然乙肝表面抗原的特性，純化后的(-2至19)PreS1+PreS2+S蛋白體外能分別與HBsAg、PreS1、PreS2的單克隆抗體及乙肝病人或健康HBsAg攜帶者血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，用該抗原免疫實(shí)驗(yàn)小鼠，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗HBsAg、PreS1、PreS2抗體；4)該表達(dá)蛋白具有理想的空間聚合結(jié)構(gòu)，不能通過300萬孔徑的濾膜；以非變性的大孔徑凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，聚合蛋白分子量大約為360萬左右。
5)如圖12，電子顯微鏡下，純化的聚合蛋白((-2至19)PreS1+PreS2+S)，蛋白顆粒直徑大約在30-50nm之間。聚合蛋白呈均勻散在分布，表面不光滑，有絨毛樣突起，呈不規(guī)則線形分枝狀排列，其尖端稍膨大呈小球形。也有散在小顆粒聚合蛋白呈現(xiàn)。該重組蛋白可形成類似天然顆粒的多聚體結(jié)構(gòu)。圖13是(-2？19)PreS1+PreS2+S蛋白聚合體的免疫電鏡照片。該蛋白與特異性抗HBs單克隆抗體結(jié)合后所形成的免疫復(fù)合物，因抗原抗體結(jié)合而聚集成密集網(wǎng)狀或團(tuán)塊。
6)該表達(dá)產(chǎn)物具有非常理想的穩(wěn)定性，純化后的(-2至19)PreS1+PreS2+S蛋白在37℃溫箱中保存28天、其抗原反應(yīng)性仍沒有顯著性下降，如圖14所示。
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公開日1990年5月30日。中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所(李載平，汪垣等)。22.含前表面抗原1和2免疫決定簇的乙肝表面抗原。中國專利號(hào)96116417.4。申請日1996年7月4日。授權(quán)公告日2001年6月27日。中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所(汪垣等)。23.基因工程乙肝預(yù)防、治療疫苗的細(xì)胞株及菌株的構(gòu)建方法。中國專利申請?zhí)?1103990.6。申請日2001年2月20日。
公開日2001年10月17日。遼寧天成生物制藥研究所。24.乙型肝炎治療性疫苗及其制備方法。中國專利號(hào)98117171.0。申請日1998年8月14日。授權(quán)公告日2002年3月20日。江西醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)科饒緯華。
序列表<110>武漢柏傲生物工程有限公司<120>基因重組乙肝病毒表面抗原的基因修飾序列及其產(chǎn)物<140><141>2002-12-<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1134(核苷酸)<212>cDNA<213>人工序列<223>合成<400>1ATGTTTCCCG ACCACCAGTT GGATCCAGCC TTCAGAGCAA ACACCGCAAA TCCAGATTGGGACTTCAATC CCAACAAGGA CACCTGGCCA GACGCCAACA AGGTAGGAGC TGGAGCATTCGGGCTGGGTT TCACCCCACC GCACGGAGGC CTTTTGGGGT GGAGCCCTCA GGCTCAGGGCATACTACAAA CTTTGCCAGC AAATCCGCCT CCTGCCTCCA CCAATCGCCA GACAGGAAGGCAGCCTACCC CGCTGTCTCC ACCTTTGAGA AACACTCATC CTCAGGCCAT GCAGTGGAATTCCACAACCT TTCACCAAAC TCTGCAAGAT CCCAGAGTGA GAGGCCTGTA TTTCCCTGCTGGTGGCTCCA GTTCAGGAGC AGTAAACCCT GTTCCGACTA CTGCCTCTCC CATATCGTCAATCTTCTCGA GGATTGGGGA CCCTGCGCTG AACATGGAGA ACATCACATC AGGACTCCTAGGACCCCTTC TCGTGTTACA GGCGGGGTTT TTCTTGTTGA CAAGAATCCT CACAATACCGCAGAGTCTAG ACTCGTGGTG GACTTCTCTC AATTTTCTAG GGGGAACTAC CGTGTGTCTTGGCCAAAATT CGCAGTCCCC AACCTCCAAT CACTCACCAA CCTCCTGTCC TCCAACTTGTCCTGGTTATC GCTGGATGTG TCTGCGGCGT TTTATCATCT TCCTCTTCAT CCTGCTGCTATGCCTCATCT TCTTGTTGGT TCTTCTGGAC TATCAAGGTA TGTTGCCCGT TTGTCCTCTAATTCCAGGAT CCTCAACCAC CAGCACGGGA CCATGCCGAA CCTGCATGAC TACTGCTCAAGGAACCTCTA TGTATCCCTC CTGTTGCTGT ACCAAACCTT CGGACGGAAA TTGCACCTGTATTCCCATCC CATCATCCTG GGCTTTCGGA AAATTCCTAT GGGAGTGGGC CTCAGCCCGTTTCTCCTGGC TCAGTTTACT AGTGCCATTT GTTCAGTGGT TCGTAGGGCT TTCCCCCACTGTTTGGCTTT CAGTTATATG GATGATGTGG TATTGGGGGC CAAGTCTGTA CAACATCTTGAGTCCCTTTT TACCGCTGTT ACCAATTTTC TTTTGTCTTT GGGTATACAT TTAA
權(quán)利要求
1.用基因工程技術(shù)構(gòu)建的編碼乙肝病毒表面抗原PreS1+PreS2+S的DNA序列，其中所述DNA序列選自下列序列之一(1)缺失了編碼PreS1的2-14氨基酸之核苷酸的DNA序列；(2)缺失了編碼PreS1的2-15氨基酸之核苷酸的DNA序列；(3)缺失了編碼PreS1的2-19氨基酸之核苷酸的DNA序列。
2.含有權(quán)利要求1的DNA序列的宿主細(xì)胞。
3.含有權(quán)利要求1的DNA序列的酵母宿主細(xì)胞。
4.含有權(quán)利要求1的DNA序列的甲基營養(yǎng)型酵母細(xì)胞。
5.含有權(quán)利要求1的DNA序列的漢遜酵母細(xì)胞和畢赤酵母細(xì)胞。
6.生產(chǎn)乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括(1)將編碼乙肝病毒表面抗原的DNA序列與可以重組至酵母染色體上的酵母質(zhì)粒組成重組復(fù)合體，經(jīng)多位點(diǎn)融合，融合于酵母細(xì)胞染色體上1個(gè)或1個(gè)以上的特定基因中；(2)在適宜酵母細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離、純化乙肝病毒表面抗原。
7.生產(chǎn)乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括(1)將權(quán)利要求1的DNA序列與可以重組至酵母染色體上的酵母質(zhì)粒組成重組復(fù)合體，經(jīng)多位點(diǎn)融合，融合于酵母細(xì)胞染色體上1個(gè)或1個(gè)以上的特定基因中；(2)在適宜酵母細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離、純化乙肝病毒表面抗原。
8.生產(chǎn)乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括(1)將編碼乙肝病毒表面抗原的DNA序列與含甲醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子的DNA片段組成重組復(fù)合體，經(jīng)多位點(diǎn)融合，融合于酵母細(xì)胞染色體上1個(gè)或1個(gè)以上的特定基因中；(2)在適宜酵母細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離、純化乙肝病毒表面抗原。
9.生產(chǎn)乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括(1)將權(quán)利要求1的DNA序列與甲醇氧化酶啟動(dòng)子(AOX1)組成重組復(fù)合體，經(jīng)多位點(diǎn)融合，融合于酵母細(xì)胞染色體上1個(gè)或1個(gè)以上的特定基因中；(2)在適宜酵母細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離、純化乙肝病毒表面抗原。
10.權(quán)利要求6-9的任一方法，其中所述酵母細(xì)胞為甲基營養(yǎng)型酵母。
11.權(quán)利要求6-9的任一方法，其中所述酵母細(xì)胞為漢遜酵母細(xì)胞和畢赤酵母細(xì)胞。
12.權(quán)利要求6-11的任一方法，其中所述酵母細(xì)胞染色體上的特定基因是已被確定可用于融合外源性DNA的基因，如AOX1，HIS4，TRP1等。
13.權(quán)利要求6-12任一方法生產(chǎn)的乙肝病毒表面抗原在制備乙肝疫苗中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求6-12任一方法生產(chǎn)的乙肝病毒表面抗原在乙肝治療中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求6-12任一方法生產(chǎn)的乙肝病毒表面抗原在診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明對(duì)天然乙肝病毒表面抗原全序列(PreS1+PreS2+S)基因中的部分不適合在酵母細(xì)胞中翻譯氨基酸的DNA編碼進(jìn)行修飾，建立了以切除乙肝病毒天然序列N’末端的多個(gè)氨基酸為主要特征的PreS1+PreS2+S DNA序列。以此新的序列構(gòu)建的基因工程酵母表達(dá)株，每升菌液可表達(dá)1克以上的新型乙肝表面抗原。該抗原作為疫苗可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生特異性抗Hbs、PreS1、PreS2的抗體。該抗原具有理想的聚合性與穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K39/29GK1429908SQ0215994
公開日2003年7月16日 申請日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者白憲鶴, 林雨霖 申請人:武漢柏傲生物工程有限公司