專利名稱：一種乙肝表面抗原基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種乙肝表面抗原基因與應(yīng)用，特別涉及一種乙肝表面抗原基因及該基因在生產(chǎn)乙肝表面抗原中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
全世界大約有3.5億乙肝病毒攜帶者，其中我國超過1億，且農(nóng)村重于城市。為了控制乙肝流行，降低人群的病毒攜帶率，我國于1985年開發(fā)研制成功血源乙肝疫苗，90年代研制了CHO基因工程疫苗并從美國MSD公司引進(jìn)了釀酒酵母基因工程疫苗(YDV)生產(chǎn)技術(shù)。
近年來，疫苗的使用使相應(yīng)年齡組人群中病毒攜帶率減少了85-90％。連續(xù)持久而有效地推廣乙肝疫苗，控制乙肝的流行，不僅需要流行病預(yù)防知識(shí)的宣傳，同時(shí)必須有生產(chǎn)足量、顯效、廉價(jià)的疫苗作為重要保證。
乙肝表面抗原(HBsAg)(S蛋白)是乙型肝炎病毒(HBV)的外膜蛋白，是病毒感染機(jī)體后最先出現(xiàn)的血清學(xué)檢驗(yàn)指標(biāo)，它能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)作出應(yīng)答，淋巴細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體(抗-HBs)，使機(jī)體具有細(xì)胞免疫功能。HBsAg上有多個(gè)抗原決定簇，血清學(xué)可以區(qū)分為a、d/y、r/w，a為組決定簇，它們的不同組合可將乙肝病毒分為不同的血清亞型，我國最常見的有adr、adw、ayw，各亞型抗體間有交叉保護(hù)。
漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來建立的真核外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，研究表明該系統(tǒng)表達(dá)的乙肝表面抗原能發(fā)生糖基化修飾、形成二硫鍵以完成正確的折疊。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，漢遜酵母表達(dá)的顆?？乖庖邫C(jī)體產(chǎn)生的體液和細(xì)胞應(yīng)答率明顯高于血源、釀酒酵母和CHO的抗原，并且其顆?？乖缓掳┮蜃雍屯庠床《?，使它成為一種很有市場(chǎng)前景的安全高效的疫苗。
tRNA一般區(qū)分為多數(shù)tRNA(major tRNA)和稀有tRNA(minor tRNA)，兩者濃度之差可以高達(dá)十倍之多，其種類和含量的多少是生物在長期的進(jìn)化過程中根據(jù)外界壓力而選擇取舍的結(jié)果。tRNA是與密碼子相對(duì)應(yīng)的，tRNA的豐度也是與密碼子的偏愛性相聯(lián)系的。
轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因的定位表達(dá)、病毒的侵染等都會(huì)造成tRNA的大量使用，從而使外源基因或病毒表達(dá)較弱或不能表達(dá)。表達(dá)過低的關(guān)鍵是外源基因密碼子的組成與表達(dá)宿主的密碼子組成不同所至，尤其是當(dāng)外源基因含有較多的表達(dá)宿主中較少使用的稀有密碼子時(shí)表現(xiàn)更為突出。稀有密碼子相對(duì)應(yīng)的tRNA數(shù)量較少，外源基因大量表達(dá)時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出tRNA的匱乏。因此在基因工程中表達(dá)外源基因時(shí)，tRNA豐度是應(yīng)該優(yōu)先考慮的一個(gè)問題。
基因組測(cè)序表明漢遜酵母tRNA基因的豐度與乙肝病毒表面抗原基因的密碼子不適應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合在多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)中表達(dá)的乙肝表面抗原基因。
本發(fā)明所提供的乙肝表面抗原基因，名稱為HBsAgHan，是按照多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)tRNA的密碼子豐度對(duì)Genbank上報(bào)道的人乙型肝炎病毒的S蛋白(S protein)序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)得到的，具有序列表中SEQ ID №.1的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由681個(gè)堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第1位到678位堿基。
含有本發(fā)明乙肝表面抗原基因HBsAgHan的表達(dá)載體，如pHFMDHZ-HBsAgHan、pHFMDHZ-R-HBsAgHan和工程菌，如含有HBsAgHan的多形漢遜酵母均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明利用多形漢遜酵母tRNA豐度重新設(shè)計(jì)了乙肝表面抗原基因，克服了天然乙肝表面抗原基因在漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)中的不適應(yīng)性，從而使該基因可在漢遜酵母中高效表達(dá)乙肝表面抗原，該乙肝表面抗原形成的顆粒為20nm，其中不含有磷脂成分。含有本發(fā)明乙肝表面抗原基因HBsAgHan的表達(dá)載體，特別是pHFMDHZ-HBsAgHan和pHFMDHZ-R-HBsAgHan轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母表達(dá)得到的乙肝表面抗原作為乙肝疫苗免疫機(jī)體產(chǎn)生的體液和細(xì)胞應(yīng)答率明顯高于血源、釀酒酵母和CHO的抗原，如5μg漢遜酵母表達(dá)的抗原和CHO表達(dá)的抗原免疫小鼠產(chǎn)生的CTL應(yīng)答率分別為84％和39％，體液免疫應(yīng)答(血清抗體滴度)相似，并且該抗原不含致癌因子和外源病毒，使它成為一種很有市場(chǎng)前景的安全高效的疫苗。本發(fā)明的乙肝表面抗原基因HBsAgHan將在乙肝的防治中發(fā)揮重要作用。


圖1為漢遜酵母表達(dá)載體pHFMDHZ-A中的物理圖譜圖2為pHFMDHZ-R-A的物理圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、HBsAgHan的合成及其在多形漢遜酵母中的表達(dá)1、HBsAgHan的合成利用本發(fā)明的發(fā)明人建立的多形漢遜酵母偏愛密碼子用法表(表1)，根據(jù)Genbank上報(bào)道的乙肝表面抗原S蛋白序列，按照漢遜酵母密碼子設(shè)計(jì)乙肝表面抗原基因，該基因全長681(含終止密碼子)，即SEQ ID №.1。通過基因合成儀，人工合成新設(shè)計(jì)的乙肝表面抗原(S蛋白)的編碼基因，如SEQ ID №.1所示，測(cè)序結(jié)果表明序列正確。
表1.多形漢遜酵母偏愛密碼子用法表

2、轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母合成的乙肝表面抗原基因(S基因)HBsAgHan用BspH I/Xba I連接到漢遜酵母表達(dá)載體pHFMDHZ-A中(物理圖譜如圖1所示)，用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在25ug/ml Zeocin的LB培養(yǎng)基上(10g/l蛋白胨，5g/l酵母抽提物，5g/l NaCl，pH5.0)37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切分析和DNA序列分析確證后進(jìn)行多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。從大腸桿菌提取質(zhì)粒，得到重組子pHFMDHZ-HBsAgHan。用Apa I線化后，用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母。用含100ug/mlZeocin的YPD培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2-4天獲得轉(zhuǎn)化子。
3、多形漢遜酵母培養(yǎng)和發(fā)酵條件挑選多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化子，經(jīng)比較試驗(yàn)選取高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子作為種子。種子在YPD液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h，按照1∶20的比例接種到新鮮的YPD培養(yǎng)液中(含1.5％甘油，pH 5.0)。維持發(fā)酵溫度37℃，pH4-5，溶氧量20％，空氣流量5-10L/min，轉(zhuǎn)速600-800rpm。24h后開始補(bǔ)料(含50％甘油的YPD)嚴(yán)格控制加料速度，使發(fā)酵液中甘油的終濃度維持在0.05-0.4％之間，發(fā)酵48-72h后，終止發(fā)酵。離心收集菌體，經(jīng)高壓細(xì)胞破碎儀破碎后供純化用。細(xì)胞破碎后經(jīng)一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等工序，再經(jīng)過疏水層析，可使產(chǎn)品抗原蛋白純度達(dá)99％以上。通過測(cè)定其表達(dá)量比乙肝表面抗原未改造基因的產(chǎn)量提高了30％。
實(shí)施例2、HBsAgHan在多形漢遜酵母中的分泌表達(dá)1、分泌表達(dá)載體的構(gòu)建人工合成引物5’CCGCTCGAGAAAAGAATGGAGACATACTTCTGG 3’和5’GCTCTAGATGTAAACCCACAAGC 3’，以人工合成的HBsAgHan全序列為模板，PCR擴(kuò)增HBsAgHan。其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系雙蒸水40μl、10×PCR buffer 5μl、5’Primer1μl、3’Primer 1μl、ExTaq polymerase 1μl、模板DNA 1μl、dNTP 1μl，總體積50μl。PCR擴(kuò)增循環(huán)程序94℃6min(initial denaturing step)，25次循環(huán)的94℃30sec，54℃50sec，72℃1min，及72℃7min(final elongationstep)，最后降溫至4℃?zhèn)溆?。用XhoI/XbaI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后插入相應(yīng)酶切的pHFMDHZ-R-A(物理圖譜如圖2所示)分泌表達(dá)載體中，按照CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切分析及序列分析后獲得重組表達(dá)載體pHFMDHZ-R-HBsAgHan。
2、轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母乙肝表面抗原分泌表達(dá)載體pHFMDHZ-R-HBsAgHan用ApaI線性化后，用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母。在含有Zeocin的YPD培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2-4天，挑取單克隆培養(yǎng)，表達(dá)，選擇高效分泌表達(dá)株進(jìn)行發(fā)酵研究。
3、多形漢遜酵母培養(yǎng)和發(fā)酵條件將高效分泌表達(dá)的轉(zhuǎn)化子經(jīng)劃線分離的單克隆在YPD培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h，按照1∶20的比例接種到新鮮的YPD培養(yǎng)液中(含1.5％甘油，pH5.0)。維持發(fā)酵溫度為37℃，pH4-5，溶氧量20％，空氣流量5-10L/min，轉(zhuǎn)速600-800rpm。24h后開始補(bǔ)料(含50％甘油的YPD)嚴(yán)格控制加料速度，使發(fā)酵液中甘油的終濃度保持在0.05-0.4％之間，發(fā)酵48-72h后，終止發(fā)酵。離心除去菌體，上清液超濾濃縮后供純化用。純化方法和檢測(cè)實(shí)施例1。表達(dá)量達(dá)比乙肝表面抗原未改造基因的分泌乙肝表面抗原提高20％。
序列表<160>1<210>1<211>681<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atggagaaca ttactagcgg cttcttgggc ccattgttgg ttttgcaagc tggcttcttc 60ttgttgacta gaattttgac tattccacaa agcttggaca gctggtggac tagcttgaac120ttcttgggcg gcactactgt ttgcttgggc caaaacagcc aaagcccaac tagcaaccac180agcccaacta gctgcccacc aacttgccca ggctacagat ggatgtgctt gagaagattc240attattttct tgttcatttt gttgttgtgc ttgattttct tgttggtttt gttggactac300caaggcatgt tgccagtttg cccattgatt ccaggcagca gcactactag cactggccca360tgcaagactt gcactactcc agctcaaggc aacagcatgt tcccaagctg ctgctgcact420aagccaagcg acggcaactg cacttgcatt ccaattccaa gcagctgggc tttcgctaag480tacttgtggg agtgggctag cgttagattc agctggttga gcttgttggt tccattcgtt540caatggttcg ttggcttgag cccaactgtt tggttgagcg ctatttggat gatgtggtac600tggggcccaa gcttgtacag cattgttagc ccattcattc cattgttgcc aattttcttc660tgcttgtggg tttacatcta g 68權(quán)利要求
1.一種乙肝表面抗原基因，它具有序列表中SEQ ID №.1的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述乙肝表面抗原基因的開放閱讀框架為自序列表中的SEQ ID №.1的5’端第1位到681位。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為pHFMDHZ-HBsAgHan或pHFMDHZ-R-HBsAgHan。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于所述工程菌為含有表達(dá)載體HBsAgHan或pHFMDHZ-R-HBsAgHan的多形漢遜酵母。
7.權(quán)利要求1所述基因在生產(chǎn)乙肝病毒表面抗原中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙肝表面抗原基因與應(yīng)用，其目的是提供一種適合在多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)中表達(dá)的乙肝表面抗原基因與該基因在生產(chǎn)乙肝表面抗原中的應(yīng)用。本發(fā)明的乙肝表面抗原基因具有序列表中SEQ ID №.1的DNA序列。本發(fā)明利用多形漢遜酵母tRNA豐度重新設(shè)計(jì)了乙肝表面抗原基因，克服了天然乙肝表面抗原基因在漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)中的不適應(yīng)性，從而使該基因可在漢遜酵母中高效表達(dá)乙肝表面抗原。多形漢遜酵母表達(dá)得到的乙肝表面抗原是一種很有市場(chǎng)前景的安全高效的疫苗。本發(fā)明的乙肝表面抗原基因HBsAgHan將在乙肝的防治中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/51GK1706952SQ20041004790
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月10日
發(fā)明者邱并生, 方洪波, 張鋒 申請(qǐng)人:大連昆陽科技開發(fā)有限公司