專利名稱：舟形藻的一種開放式培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藻類的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，特別是涉及舟形藻的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
舟形藻(Navicula sp)是一類富含多不飽和脂肪酸的底棲海洋硅藻，是海洋生態(tài)系統(tǒng)的常見初級生產(chǎn)力種群。由于舟形藻含有γ-亞麻酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，已成為很多珍貴水產(chǎn)動物重要開口餌料之一。舟形藻在生長過程中還向胞外分泌大量的多糖類成分，初步藥理實驗表明，舟形藻胞外總多糖含21.24％的SO42-，對S-180肉瘤的抑制率達60％以上，具有藥學價值，使舟形藻成為海洋生物制藥的重要原料。
天然海水中舟形藻與其他底棲藻類混雜生長，種群密度很低，無法滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖的需要。目前，舟形藻的人工培養(yǎng)多采用f/2培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中舟形藻生長速度緩慢，尤其在開放式培養(yǎng)時很難形成種群優(yōu)勢，極易被小球藻、鹽藻等單細胞綠藻污染。這些單細胞綠藻生長速度快，大量消耗培養(yǎng)基養(yǎng)分的同時還分泌胞外產(chǎn)物抑制舟形藻的生長，容易導致培養(yǎng)失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能使舟形藻快速生長的培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的舟形藻培養(yǎng)基命名為ZWN，其配方是硝酸鉀，180-220mg；磷酸二氫鈉，18-22mg；硅酸鈉，270-330mg；脲素，7-9mg；維生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二鈉，5-7mg；氯化鐵，5-7mg；海水定容至1L。
培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為硝酸鉀，200mg；磷酸二氫鈉，20mg；硅酸鈉，300mg；脲素，8mg；維生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二鈉，6mg；氯化鐵，6mg；海水定容至1L。
為了防止在培養(yǎng)過程中舟形藻受到綠藻等雜藻的污染，在培養(yǎng)基中還加有350-450mg/L碘化鉀；優(yōu)選為400mg/L。
海水在配制培養(yǎng)基前按如下步驟處理1)用鹽酸調(diào)節(jié)天然海水pH為2-4，靜置12-24h；2)用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0-8.0。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種應(yīng)用本發(fā)明所提供的ZWN培養(yǎng)基培養(yǎng)舟形藻的方法。
應(yīng)用ZWN培養(yǎng)基培養(yǎng)舟形藻的方法，包括如下步驟1)用海水配置培養(yǎng)基；2)按新月菱形藻與培養(yǎng)基體積比為1∶5-9的比例將新月菱形藻接種到培養(yǎng)基中，在19-25℃，光照強度3000-6000Lux，光照時間8-12h/天條件下通氣培養(yǎng)。
培養(yǎng)過程的通氣量為0.5m3/min；培養(yǎng)6-8天即可達到培養(yǎng)終點。優(yōu)選培養(yǎng)條件為溫度為25℃；光照強度為5000Lux；光照時間為10h/天。
人工培養(yǎng)舟形藻主要涉及兩方面的關(guān)鍵技術(shù)即培養(yǎng)基的組成和綠藻污染的防治。本發(fā)明所提供的ZWN培養(yǎng)基能使舟形藻細胞快速利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，達到細胞快速分裂，生長周期比傳統(tǒng)f/2培養(yǎng)基縮短3-4天，并可利于舟形藻生物量的積累，比傳統(tǒng)培養(yǎng)基高出0.4-1倍；在ZWN培養(yǎng)基中加入碘化鉀，能有效達到防治綠藻污染的目的，可以采用開放式的培養(yǎng)方式大規(guī)模獲得舟形藻及其目標產(chǎn)物，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋生物制藥有著十分重要的意義。


圖1為三種舟形藻在ZWN培養(yǎng)基和f/2培養(yǎng)基的生長曲線圖2為舟形藻在含碘化鉀和不含碘化鉀ZWN培養(yǎng)基中開放培養(yǎng)的生長曲線圖3為舟形藻在含碘化鉀和不含碘化鉀ZWN培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)的生長曲線具體實施方式
實施例1、舟形藻在ZWN培養(yǎng)基中的培養(yǎng)1、ZWN培養(yǎng)基配制1)取1L天然靜置海水，加入1N鹽酸調(diào)節(jié)海水pH為3，靜置12h，除去沉淀物；然后加入1N NaOH調(diào)節(jié)至pH為7.5左右，靜置除去沉淀物。
2)定量稱取ZWN配方中各種營養(yǎng)鹽硝酸鉀(KNO3)，200mg；磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，20mg；硅酸鈉(Na2SiO3l0H2O)，300mg；脲素(NH2)2CO，8mg；維生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，6mg；氯化鐵(FeCl3)，6mg。
3)將上述物質(zhì)溶解在1)所得海水中，并定容至1000毫升，然后加入400mg碘化鉀。
2、舟形藻的培養(yǎng)本實施例所用舟形藻有三種，分別為舟形藻YT01、舟形藻LY01、舟形藻LY02。這三種硅藻系發(fā)明人在2001-2002年分別從煙臺、連云港海濱采集，在實驗室分離后獲得，作為發(fā)明人實驗室保存藻種。
舟形藻藻種密度為3×105細胞/毫升，按1∶5的體積比接種到ZWN培養(yǎng)基中，在溫度為25℃、光照時間為10h/天、光強5000Lux條件下，以0.5m3/min通氣量通氣培養(yǎng)。
以f/2培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式與上相同。
三種舟形藻在ZWN培養(yǎng)基和f/2培養(yǎng)基中生長曲線如圖1所示，圖中A、B、C分別為在ZWN培養(yǎng)基中培養(yǎng)的舟形藻YT01、LY01、LY02；D、E、F分別為在f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)的舟形藻YT01、LY01、LY02。
結(jié)果表明，這三種舟形藻在ZWN培養(yǎng)基中生長周期為6-8天，隨初始培養(yǎng)的接種密度和比例不同而有差異。通常情況下當藻種密度為3×103cells/ml、接種比例為1∶5時，培養(yǎng)第2天即進入指數(shù)生長期，第6-7天藻細胞密度達最大值；接著是3-5天的穩(wěn)定期，此時的藻細胞分裂、生長變慢，生長結(jié)束。與f/2培養(yǎng)基相比，舟形藻提前4天進入對數(shù)期，生物量分別高出0.4-1倍。
實施例2、舟形藻在ZWN培養(yǎng)基中藻體脂肪酸的組成按照如下配方配制ZWN培養(yǎng)基硝酸鉀，180mg；磷酸二氫鈉，22mg；硅酸鈉，270mg；脲素，9mg；維生素B1，350μg；乙二胺四乙酸二鈉，7mg；氯化鐵，5mg；海水定容至1升，加入碘化鉀使其濃度為400mg/L。
以ZWN為培養(yǎng)基，在溫度為25℃、光照時間為8h、接種量為1∶9、光強5000Lux條件下通氣培養(yǎng)舟形藻8天，其他操作與實施例1相同。培養(yǎng)結(jié)束后，收集藻體細胞，按GC-MS法測定藻體脂肪酸的組成，結(jié)果如表1所示，其中表中i-14:0表示十四碳酸；15:0表示十五碳酸；16:2(n-6)表示十六碳二烯酸；ai-17:0表示十七碳酸；其余與此類似。
結(jié)果表明，以ZWN培養(yǎng)基培養(yǎng)的舟形藻其藻體多不飽和脂肪酸以EPA、GLA和DHA為主要成分，分別為總脂肪酸含量的31.8-11.1％、15-18％及1.84-7.82％。
表1.以ZWN培養(yǎng)的幾種舟形藻體脂肪酸組成(占總脂肪酸百分比)


實施例3、碘化鉀ZWN培養(yǎng)基對舟形藻綠藻污染的防治作用按照如下配方配制ZWN培養(yǎng)基硝酸鉀，220mg；磷酸二氫鈉，18mg；硅酸鈉，330mg；脲素，7mg；維生素B1，450μg；乙二胺四乙酸二鈉，5mg；氯化鐵，7mg；海水定容至1升。
一部分培養(yǎng)基中加入碘化鉀使其濃度為450mg/L，另一部分不加碘化鉀，在溫度為19℃、光照時間為12h/天、接種量為1∶9(藻種密度為3×105細胞/毫升)、光強5000Lux條件下通氣培養(yǎng)舟形藻10天，其他操作與實施例1相同。舟形藻YT01在兩種培養(yǎng)基中的生長曲線如圖2所示，圖中A為ZWN培養(yǎng)基+400mg/L碘化鉀；B為ZWN培養(yǎng)基。
結(jié)果表明，在ZWN培養(yǎng)基中，接種后的第5天，單細胞綠藻的數(shù)量開始急劇上升，這些單細胞綠藻在生長的過程中向培養(yǎng)基釋放舟形藻生長抑制物，從而使舟形藻生長受到抑制，導致培養(yǎng)失敗；在培養(yǎng)液中加入400mg/L的碘化鉀，可有效預(yù)防綠藻的污染；對已污染的舟形藻培養(yǎng)液中單細胞綠藻也能有效遏制，具體表現(xiàn)為單細胞綠藻類種群數(shù)量增長停止并逐漸減少，存活的單細胞綠藻多附著在容器液面上方的器壁上。
實施例4、碘化鉀對于舟形藻培養(yǎng)的影響按照如下配方配制ZWN培養(yǎng)基硝酸鉀(KNO3)，200mg；磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，20mg；硅酸鈉(Na2SiO310H2O)，300mg；脲素(NH2)2CO，8mg；維生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，6mg；氯化鐵(FeCl3)，6mg；海水定容至1升。
一部分培養(yǎng)基中加入碘化鉀使其濃度為400mg/L，另一部分不加碘化鉀，然后將兩種培養(yǎng)基用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，按1∶9接種量在無菌條件下接種、培養(yǎng)舟形藻藻種YT01，培養(yǎng)條件與實施例1相同。
舟形藻YT01在兩種培養(yǎng)基的生長曲線如圖3所示，圖中A為ZWN培養(yǎng)基；B為ZWN培養(yǎng)基+400mg/L碘化鉀。舟形藻培養(yǎng)的潛伏期、生長周期及生物量等生長指標如表2所示。
結(jié)果表明，該濃度的碘化鉀對舟形藻生物量積累沒有抑制作用。
表2.碘化鉀對舟形藻生長指標的影響

培養(yǎng)結(jié)束后，收集藻體，按常規(guī)方法測定藻體細胞的不飽和脂肪酸含量，結(jié)果如表3所示，表中表示方法與實施例2相同。結(jié)果表明，碘化鉀加入ZWN培養(yǎng)基后，舟形藻的多不飽和脂肪酸含量沒有顯著的變化，而且EPA含量略有增加。
表3.碘化鉀對ZWN培養(yǎng)舟形藻多不飽和脂肪酸含量的影響

權(quán)利要求
1.一種舟形藻培養(yǎng)基，其配方為硝酸鉀，180-220mg；磷酸二氫鈉，18-22mg；硅酸鈉，270-330mg；脲素，7-9mg；維生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二鈉，5-7mg；氯化鐵，5-7mg；海水定容至11。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述硝酸鉀為200mg；所述磷酸二氫鈉為20mg；所述硅酸鈉為300mg；所述脲素為8mg；所述維生素B1為400μg；所述乙二胺四乙酸二鈉為6mg；所述氯化鐵為6mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基還含有350-450mg/L碘化鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述海水按如下步驟處理1)用鹽酸調(diào)節(jié)天然海水pH為2-4，靜置12-24h；2)用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0-8.0。
5.一種培養(yǎng)舟形藻的方法，包括如下步驟1)用海水配置培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基配方為硝酸鉀，180-220mg；磷酸二氫鈉，18-22mg；硅酸鈉，270-330mg；脲素，7-9mg；維生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二鈉，5-7mg；氯化鐵，5-7mg；海水定容至1升；2)按新月菱形藻與培養(yǎng)基體積比為1∶5-9的比例將新月菱形藻接種到培養(yǎng)基中，在19-25℃，光照強度3000-6000Lux，光照時間8-12h/天條件下通氣培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)所述硝酸鉀為200mg；所述磷酸二氫鈉為20mg；所述硅酸鈉為300mg；所述脲素為8mg；所述維生素B1為400μg；所述乙二胺四乙酸二鈉為6mg；所述氯化鐵為6mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)所述培養(yǎng)基中還含有350-450mg/L碘化鉀。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述海水在配置培養(yǎng)基前按如下步驟處理1)用鹽酸調(diào)節(jié)天然海水pH為2-4，靜置12-24h；2)用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0-8.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述通氣培養(yǎng)的通氣量為0.5m3/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述培養(yǎng)溫度為25℃；光照強度為5000Lux；光照時間為10h/天。
全文摘要
本發(fā)明公開了舟形藻的一種開放式培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基為ZWN，其配方為硝酸鉀，180－220mg；磷酸二氫鈉，18－22mg；硅酸鈉，270－330mg；脲素，7－9mg；維生素B
文檔編號C12N1/12GK1710062SQ20041004788
公開日2005年12月21日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日
發(fā)明者鄭維發(fā), 王雪梅 申請人:江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室