專(zhuān)利名稱(chēng)：：紫背天葵葉片組織培養(yǎng)的方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種紫背天葵葉片組織培養(yǎng)的方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：紫背天葵，學(xué)名GynurabicolorDC，別名紫背菜、兩色三七草、紅背菜、觀音菜，為菊科三七草屬多年生宿根草本植物。其整個(gè)植株呈紫綠色，葉長(zhǎng)卵型，邊緣有鋸齒，葉面綠色略帶紫，背面紫紅色具蠟質(zhì)，有光澤，是有藥用價(jià)值的野生蔬菜。紫背天葵作為一種值得推廣的高營(yíng)養(yǎng)保健蔬菜，含有較為豐富全面的營(yíng)養(yǎng)成分，除一般蔬菜所具有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還富含可提高動(dòng)物抗病能力，并對(duì)惡性生長(zhǎng)細(xì)胞具有中度抗性的黃酮類(lèi)化合物及鐵、錳、鋅等對(duì)人體有益的微量元素。在我國(guó)南方一些地區(qū)更是把紫背天葵作為一種補(bǔ)血的“良藥”，是產(chǎn)后婦女食用的主要蔬菜之一。同時(shí)它也是很好的天然紅色素原料，這種色素就是花青素。隨著眾多的合成色素被發(fā)現(xiàn)有毒害作用以及人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，傳統(tǒng)工業(yè)合成色素的應(yīng)用范圍逐步縮小，前期影響廣泛的“蘇丹紅”事件使人們談“紅”色變；植物體花青素作為一種天然色素，安全、無(wú)毒、資源豐富，具有相當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)和藥理作用，對(duì)人類(lèi)健康影響廣泛，在食品、化妝品以及醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛力。紫背天葵可用扦插及種子繁殖，但主要采用扦插繁殖。但是長(zhǎng)期使用無(wú)性繁殖易感染病菌，需用種子繁殖更新，或用組培技術(shù)脫毒重新育苗。組培技術(shù)具有繁殖速度快、不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)建立高效的再生體系也是植物遺傳轉(zhuǎn)化的前提，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以豐富種質(zhì)資源，提高作物的抗逆性或改良其品質(zhì)。對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，林碧英、林義章在《植物生理學(xué)通訊》2003年第39卷第4期346頁(yè)發(fā)表了題為“紫背天葵的組織培養(yǎng)和快速繁殖”；陳銀龍等在《現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技》2006年7月刊發(fā)表了“紫背天葵的組培快繁技術(shù)”，但兩者所采用的外植體均為在帶芽莖段，屬于快繁技術(shù)，并不屬于經(jīng)典組織培養(yǎng)方法。遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，以葉片等為外植體的經(jīng)典組培方法，要比以帶芽莖段為外植體的快繁方法更有利于減少產(chǎn)生嵌合體，假陽(yáng)性的現(xiàn)象。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未有紫背天葵以葉片為外植體的組織培養(yǎng)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種紫背天葵葉片誘導(dǎo)愈傷組織的專(zhuān)用培養(yǎng)基。本發(fā)明的紫背天葵葉片的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基2，4-D、6_BA、碳源和凝膠劑；上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D的終濃度是l-3mg/L、6-BA終濃度是0.2_lmg/L；上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。表1.MS基本培養(yǎng)液的溶質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</table>上述紫背天葵葉片的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D的終濃度優(yōu)選是2mg/L，6_BA的終濃度優(yōu)選是0.5mg/L。上述紫背天葵葉片的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中凝膠劑可以是瓊脂、卡拉膠或Gelrite等，優(yōu)選可是瓊脂；所述瓊脂的終濃度是7_9g/L；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的碳源可以是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖等，優(yōu)選為蔗糖，蔗糖的終濃度是20-40g/L。本發(fā)明的另一目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以紫背天葵葉片為外植體進(jìn)行生產(chǎn)紫背天葵再生苗的方法。本發(fā)明的生產(chǎn)紫背天葵再生苗的方法，包括以下步驟1)將紫背天葵葉片置于上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)得到愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得叢生芽；3)將步驟2)中獲得的叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)生根培養(yǎng)得到再生苗。上述步驟1)、步驟2)和步驟3)中培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均可為溫度為24-27°C，光照時(shí)間為14-18小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000-30001UX。上述步驟2)中，分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加噻苯隆(TDZ，N_苯基-N'-1，2，3-噻二唑-5脲)48而3、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中噻苯隆(TDZ)的終濃度為0.2-0.8mg/L,AgNO3的終濃度為2_6mg/L；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。上述分化培養(yǎng)基中噻苯隆(TDZ)的終濃度優(yōu)選為0.5mg/L,AgNO3的終濃度優(yōu)選為4mg/L。本發(fā)明方法還在步驟2)和步驟3)之間還包括一叢生芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)，所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)是將步驟2)得到的叢生芽接種到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到伸長(zhǎng)的叢生芽。上述伸長(zhǎng)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件與步驟1)、步驟2)和步驟3)的培養(yǎng)條件一致。上述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加噻苯隆(TDZ)、AgNO3、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中噻苯隆(TDZ)的終濃度為0.2mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。上述誘導(dǎo)生根培養(yǎng)是在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行的，所采用的生根培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示ο本發(fā)明的方法還包括預(yù)處理步驟，該預(yù)處理步驟是將紫背天葵葉片置于70%(ν/ν)的酒精里滅菌20-40秒，用無(wú)菌水沖洗，再用滴加了吐溫的0.1%(ν/ν)的升汞浸泡6-10分鐘后，用無(wú)菌水沖洗干凈。本發(fā)明中所采用的培養(yǎng)基(即分化培養(yǎng)基、伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基)中的碳源可為葡萄糖、麥芽糖或蔗糖等，優(yōu)選為蔗糖，蔗糖的用量為在培養(yǎng)基中的終濃度為20-40g/L；凝膠劑可為瓊脂、卡拉膠或Gelrite等，優(yōu)選是瓊脂，瓊脂的用量可為在培養(yǎng)基中的終濃度為7-9g/L；凝膠劑的用量以能達(dá)到培養(yǎng)基的硬度為基礎(chǔ)，可適當(dāng)調(diào)整用里。本發(fā)明的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基可有效地誘導(dǎo)紫背天葵葉片形成愈傷組織，由實(shí)施例1可知，其愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到了100%，愈傷組織的分化率達(dá)69%以上，分化得到叢生芽的增殖倍數(shù)平均為7.12，生根培養(yǎng)的生根率最高可達(dá)到100%。本發(fā)明第一次建立紫背天葵的經(jīng)典組培體系，以紫背天葵葉片作為外植體進(jìn)行繁殖，取材方便，來(lái)源充足，可高頻率的誘導(dǎo)出大量的紫背天葵再生植株，產(chǎn)生的植株易于生根，再生植株成活率高，最高可達(dá)95%以上。而且具有再生植株變異性小，遺傳穩(wěn)定性高，若進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，比以腋芽為外植體的再生系統(tǒng)的有假陽(yáng)性率低的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為擴(kuò)大紫背天葵繁殖系數(shù)、種質(zhì)保存及其遺傳轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1紫背天葵葉片外植體的切割方法。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1誘導(dǎo)的愈傷組織。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1由愈傷組織分化的不定芽。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1紫背天葵再生苗。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、紫背天葵再生苗的獲得及其統(tǒng)計(jì)觀察1、愈傷組織的制備1)外植體的預(yù)處理選取幼嫩平展的紫背天葵(品種為紅葉，購(gòu)于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜中心)葉片為外植體，先在70%(體積百分比)的酒精里滅菌30s，用無(wú)菌水沖洗5次，再用滴加了吐溫的0.(體積百分比)的升汞浸泡8min，然后用無(wú)菌水沖洗干凈。2)愈傷組織的獲得將上述步驟1)中預(yù)處理好的紫背天葵葉片剪成IcmXIcm左右(切割方法如圖1所示)的小塊，葉背朝下的接種在紫背天葵葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上，在溫度為26°C，光照強(qiáng)度為25001ux，光照時(shí)間為16小時(shí)/天的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)約12天，得到愈傷組織(如圖2所示)。上述紫背天葵葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加2，4_D、6-BA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；其中各物質(zhì)的終濃度為2，4-D為2mg/L，6-BA為0.5mg/L，蔗糖為30g/L，瓊脂為8g/L；培養(yǎng)基的pH為5.9，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。3)統(tǒng)計(jì)觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察上述步驟2)中愈傷組織的誘導(dǎo)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表2。從表2可以看出，紫背天葵葉片在培養(yǎng)12天左右開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織，培養(yǎng)20天后愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)到100%。表2.培養(yǎng)20天后愈傷組織的誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</table>2、愈傷組織分化叢生芽及統(tǒng)計(jì)觀察1)叢生芽的分化將上述步驟1中步驟2)得到的愈傷組織培養(yǎng)生長(zhǎng)40天時(shí)，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，在溫度為26°C，光照強(qiáng)度為25001UX，光照時(shí)間為16小時(shí)/天的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)約42天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)，分化得到叢生芽(如圖3所示)。在分化誘導(dǎo)叢生芽的過(guò)程中為得到所需數(shù)量的叢生芽，可每30天在相同培養(yǎng)基(即本實(shí)施例的分化培養(yǎng)基)上繼代一次，也可根據(jù)各愈傷組織分化情況及時(shí)進(jìn)行繼代。上述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加TDZ(噻苯隆，購(gòu)自北京綠生源科技有限公司)、AgNO3、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；其中TDZ的終濃度為0.5mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為8g/L；培養(yǎng)基的pH為5.9，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。2)統(tǒng)計(jì)觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察上述步驟2中步驟1)叢生芽的分化情況。愈傷組織培養(yǎng)約42天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)，但其中只有70%的外植體能分化，這些外植體上可陸續(xù)分化出8-15不定芽，培養(yǎng)60天后，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表3，從表3可以看出，愈傷組織的分化率可達(dá)到69%以上，分化得到叢生芽的增殖倍數(shù)平均為7.12。表3.分化培養(yǎng)的分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</table>3、伸長(zhǎng)培養(yǎng)將步驟2中步驟1)誘導(dǎo)出的叢生芽進(jìn)行分割，每2-5株一叢，轉(zhuǎn)接到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，在溫度為26°C，光照強(qiáng)度為25001UX，光照時(shí)間為16小時(shí)/天的培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到伸長(zhǎng)的叢生芽。上述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加TDZ(噻苯隆，購(gòu)自北京綠生源科技有限公司)、AgNO3、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；其中TDZ的終濃度為0.2mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為8g/L，培養(yǎng)基的pH為5.9，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。4、生根培養(yǎng)及統(tǒng)計(jì)觀察1)生根培養(yǎng)得到再生苗將上述步驟3中得到的伸長(zhǎng)至1.5-2cm的叢生芽植株分離成單株，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中，在溫度為26°C，光照強(qiáng)度為25001UX，光照時(shí)間為16小時(shí)/天的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)生根培養(yǎng)約30天，最終得到紫背天葵再生苗。上述生根培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基，其中蔗糖的終濃度是30g/L，瓊脂的終濃度是8g/L，培養(yǎng)基的PH=5.9；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。2)統(tǒng)計(jì)觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察上述步驟4中步驟1)的生根培養(yǎng)情況。培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表4，從表4可以看出生根培養(yǎng)叢生芽的生根率分別為100%，96%，92%，最高可達(dá)到100%，每株植株平均生根5.0根。表5.生根培養(yǎng)的生根率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</table>5、煉苗移栽將上述步驟4中得到的再生苗，進(jìn)行煉苗，開(kāi)蓋將其與空氣接觸，26°C下生長(zhǎng)5天；然后用流水洗去掉再生苗根系上的培養(yǎng)基，將其移栽到消毒栽培基質(zhì)(蛭石草炭=11，體積比)中培養(yǎng)，得到紫背天葵再生植株(如圖4所示)，再生植株的成活率可達(dá)95%以上。權(quán)利要求一種紫背天葵葉片的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基2，4-D、6-BA、碳源和凝膠劑；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D的終濃度是1-3mg/L、6-BA終濃度是0.2-1mg/L；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D的終濃度是2mg/L，6-BA的終濃度是0.5mg/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優(yōu)選是瓊脂；所述瓊脂的終濃度是7_9g/L；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖；所述蔗糖的終濃度是20-40g/L。4.一種生產(chǎn)紫背天葵再生苗的方法，包括以下步驟1)將紫背天葵葉片置于權(quán)利要求1-3中任一所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)得到愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得叢生芽；3)將步驟2)中獲得的叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)生根得到再生苗。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加噻苯隆、AgNO3、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中噻苯隆的終濃度為0.2-0.8mg/L,AgNO3的終濃度為2_6mg/L；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述分化培養(yǎng)基中噻苯隆的終濃度為0.5mg/L，AgNO3的終濃度為4mg/L。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述分化培養(yǎng)基中，所述凝膠劑是瓊月旨、卡拉膠或Gelrite，優(yōu)選為瓊脂，所述瓊脂的終濃度為7_9g/L；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖，所述蔗糖的終濃度為20-40g/L。8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法在步驟2)和步驟3)之間還包括一叢生芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)，所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)是將步驟2)得到的叢生芽接種到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到伸長(zhǎng)的叢生芽。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加噻苯隆、AgNO3、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中噻苯隆的終濃度為0.2mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖，所述蔗糖的終濃度為20-40g/L；所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優(yōu)選為瓊脂，所述瓊脂的終濃度為7_9g/L；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)生根是在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行的，所述生根培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖，所述蔗糖的終濃度為20-40g/L；所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優(yōu)選為瓊脂，所述瓊脂的終濃度為7_9g/L；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種紫背天葵葉片組織培養(yǎng)的方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的紫背天葵葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基2，4-D、6-BA、碳源和凝膠劑；培養(yǎng)基中2，4-D的終濃度是1-3mg/L、6-BA終濃度是0.2-1mg/L。本發(fā)明的方法是將紫背天葵葉片置于誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到愈傷組織后，進(jìn)行分化培養(yǎng)得到叢生芽，叢生芽再誘導(dǎo)生根得到再生苗。本發(fā)明建立紫背天葵的經(jīng)典組培體系，以紫背天葵葉片作為外植體進(jìn)行繁殖，取材方便，來(lái)源充足，可高頻率的誘導(dǎo)出大量的紫背天葵再生植株，產(chǎn)生的植株易于生根，再生植株成活率高，最高可達(dá)95％以上。文檔編號(hào)A01H4/00GK101836593SQ20101019785公開(kāi)日2010年9月22日申請(qǐng)日期2010年6月3日優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日發(fā)明者劉莉莎,溫常龍,王玉玨,程琳,趙永欽,趙立群,郭仰東申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)