專利名稱：一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES cell)也稱ES細胞，是一種存在于著床前早期胚胎中的具有全能性的細胞。全能性即分化發(fā)育成三個胚層的組織細胞的能力。胚胎干細胞能在體外進行培養(yǎng)傳代，保持未分化二倍體狀態(tài)以及其全能性，具有形成嵌合體動物(chimeric animal)的能力。小鼠胚胎干細胞最早由Evans和Kaufman(1981)兩人以及Martin(1981)分別從小鼠早期胚胎中分離培養(yǎng)成功并建立細胞系。由于其具有全能性，故廣泛用于胚胎發(fā)育及胚胎工程方面的研究。例如在培養(yǎng)液中加入不同的分化因子，可定向誘導(dǎo)其分化發(fā)育成心肌細胞、淋巴細胞以及神經(jīng)細胞，甚至可用它培養(yǎng)出器官；可用不同的外源性基因轉(zhuǎn)染胚胎干細胞，或在胚胎干細胞水平上進行基因敲除或基因打靶，經(jīng)體外篩選后建立帶有目的基因的細胞系或?qū)⒑Y選后帶有目的基因的胚胎干細胞注射到宿主著床前胚胎內(nèi)，并移植到假孕母體子宮腔內(nèi)使之發(fā)育成個體。從而建立轉(zhuǎn)基因動物、基因敲除動物和基因打靶動物，研究基因在分化發(fā)育過程中的表達與調(diào)控以及制備人類疾病動物模型等。由于小鼠胚胎干細胞在體外培養(yǎng)過程中極易分化和失去正常二倍體核型，進而失去全能性和喪失形成嵌合體動物的能力，故需要特殊的培養(yǎng)條件。
胚胎干細胞體外培養(yǎng)的原則是在促進胚胎干細胞增殖的同時，維持其未分化二倍體狀態(tài)。胚胎干細胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍體正常核型的細胞則會大大降低形成嵌合體(chimera)的能力，特別是進入種系形成生殖細胞的能力。
目前體外培養(yǎng)胚胎干細胞的方法歸納起來有二大類有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法則是利用各種能分泌抑制分化因子的細胞制備條件培養(yǎng)基，如果使用這樣的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞，可以不使用飼養(yǎng)層細胞，能保證小鼠胚胎干細胞增殖的同時維持未分化二倍體狀態(tài)。由于無滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)方法在大多數(shù)實驗室在長時間難以維持mES多能性。目前主要使用滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)方法。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法主要應(yīng)用MEF和SIM小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系STO細胞作為飼養(yǎng)細胞；經(jīng)絲裂霉素-C或γ-射線處理終止其分裂后制備成飼養(yǎng)單層，將胚胎干細胞種植在這樣的單層上。MEF和STO都能分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制胚胎干細胞自主分化的因子。MEF和STO培養(yǎng)上清中抑制胚胎干細胞自主分化因子-LIF含量在500～1000IU/ml(分泌型)，同時在MEF和STO基質(zhì)上還存在LIF(基質(zhì)型)。STO細胞是已建系的SIM小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏本苷亞系(Hogan et al.1994)。它可以長期進行體外培養(yǎng)傳代和凍存。但效果不如MEF而未能廣泛使用。使用MEF作為飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)胚胎干細胞是一種最早和常用的方法。MEF能產(chǎn)生抑制胚胎干細胞自主分化和促進胚胎干細胞增殖的因子，故它能有效地促進胚胎干細胞增殖并維持其未分化二倍體狀態(tài)和全能性。通常準備12.5～14.5d懷孕小鼠制備MEF。因為第3～5代的MEF生長和各種因子分泌都旺盛，雜細胞也較少，因此選擇第3～5代的MEF制備滋養(yǎng)層細胞。飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)mES時，常要在培養(yǎng)液中加入抑制胚胎干細胞自主分化的因子-人工重組LIF。
小鼠胚胎干細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是高糖的DMEM。培養(yǎng)液配制時，還要添加β-巰基乙醇(β-ME)或單硫甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重組的LIF和胎牛血清等多種成分。高糖的DMEM有助于囊胚的貼壁、內(nèi)細胞團的增殖及小鼠胚胎干細胞集落的形成；胎牛血清是胚胎干細胞培養(yǎng)液中不可缺少的成分。在促進胚胎干細胞增殖方面起到很好的作用；β-巰基乙醇(β-ME)可以保護細胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的硫基不被氧化，從而促進胚胎干細胞的貼壁及克隆形成；LIF是六十年代末發(fā)現(xiàn)的一種多功能細胞因子。在體外具有誘導(dǎo)M1細胞(一種髓樣白血病細胞，myeloid leukaemiccell)向正常分化和抑制胚胎干細胞自主分化能力，以及能夠促進8細胞期以后的桑椹胚至著床前胚胎的發(fā)育，提高囊胚的存活率，促進滋胚層細胞增殖和內(nèi)細胞團生長。許多組織和細胞都有LIF和LIF受體的表達，如子宮內(nèi)膜、蛻膜、胚胎滋胚層細胞、胚胎成纖維細胞、人膀胱癌細胞等有LIF的表達；胚胎干細胞、M1髓樣白血病細胞、巨噬細胞、胚胎瘤(癌)細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞等有LIF受體的表達。LIF分為兩種類型分泌型(D型)和基質(zhì)型(M型)。D型可分泌到細胞外液中，M型則錨定到細胞外基質(zhì)上。人和鼠LIF基因有78％～94％的同源性。有用人LIF培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞抑制其分化的報道，但未見有用鼠LIF培養(yǎng)人胚胎干細胞的報道。目前，人工重組的LIF制品已被商品化，可用來制備LIF條件培養(yǎng)基。LIF最適用量為1000IU/ml。當(dāng)LIF濃度降至50～100單位/ml時，胚胎干細胞未分化的克隆數(shù)會下降至50％～60％。
自從mES建系以來20多年時間內(nèi)，盡管小鼠胚胎干細胞體外培養(yǎng)技術(shù)最為成熟，但是上述培養(yǎng)體系仍存在如下缺點(1)操作復(fù)雜mES體外培養(yǎng)過程包括12.5～14.5d懷孕小鼠的準備、MEF的分離和培養(yǎng)、MEF滋養(yǎng)層細胞制備、條件培養(yǎng)基配制、mES的傳代等。(2)MEF生命期有限，不能在體外長期傳代。在體外傳代時間太長，其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會減弱甚至喪失。這就需要經(jīng)常準備12.5～14.5d懷孕小鼠制備MEF。(3)種植胚胎干細胞前，如果用絲裂霉素-C處理MEF，清洗不徹底時，殘余的絲裂霉素-C會影響胚胎干細胞的增殖。(4)在胚胎干細胞培養(yǎng)過程中，死亡的MEF細胞的染色體釋出可能會引起胚胎干細胞的突變及影響正常核型的保持。(5)培養(yǎng)液成分復(fù)雜在mES培養(yǎng)體系中，除基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清外，需要添加β-巰基乙醇(β-ME)或硫代甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重組的LIF。同時，其中氨基酸成分、重組LIF等長時間放置易導(dǎo)致生物活性喪失。(6)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法中使用孕鼠、各種氨基酸、人工重組LIF等具有非常高昂費用的生物材料和試劑，對于我國科研經(jīng)費相對缺乏的國情，使得有關(guān)mES的研究工作受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、有效、低成本的培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞(mES)的方法，是在滋養(yǎng)層細胞上，用胚胎干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞，其中，所述滋養(yǎng)層細胞為上皮或內(nèi)皮細胞。
所述上皮細胞或內(nèi)皮細胞可來源于人和哺乳動物上皮細胞或內(nèi)皮細胞。
所述上皮細胞或內(nèi)皮細胞具體可來源于人和哺乳動物上皮組織或內(nèi)皮細胞且具有自發(fā)分泌LIF的功能(包括自發(fā)分泌基質(zhì)型LIF和分泌型LIF)。
所述上皮細胞和內(nèi)皮細胞包括已建系的上皮細胞系、內(nèi)皮細胞系和原代培養(yǎng)獲得的上皮細胞及內(nèi)皮細胞。
所述內(nèi)皮細胞優(yōu)選為人臍靜脈內(nèi)皮細胞、心血管內(nèi)皮細胞、骨髓組織內(nèi)皮細胞等；所述上皮細胞優(yōu)選為人膀胱上皮組織、泌尿生殖道上皮組織、呼吸道、消化道等組織來源上皮細胞。
所述人膀胱癌上皮細胞系可為人膀胱癌上皮細胞T24；所述人臍靜脈內(nèi)皮細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304。
人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304源自1984年日本科學(xué)家從新生男嬰臍靜脈分離的，具有永生特性并不依賴任何細胞因子的內(nèi)皮細胞系，后來證實ECV-304細胞系來自人膀胱癌上皮細胞系T24。
因上述動物上皮細胞和內(nèi)皮細胞具有類似MEF滋養(yǎng)層細胞特性如均具有自發(fā)分泌LIF的功能，為小鼠胚胎干細胞自我更新、細胞分裂和增殖提供必需的基質(zhì)成分和必要的細胞因子，故可作為培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的滋養(yǎng)層細胞。
上述方法中，所述胚胎干細胞培養(yǎng)液可為基礎(chǔ)培養(yǎng)基是高糖的DMEM，添加β-巰基乙醇(β-ME)或硫代甘油、和胎牛血清等多種成分。
所述培養(yǎng)液優(yōu)選是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的質(zhì)量百分含量為10-20％，硫代甘油的含量為1.5-3.0×10-4mol/L。
本發(fā)明選擇上皮細胞和內(nèi)皮細胞作為滋養(yǎng)層細胞，用于mES細胞培養(yǎng)，建立了一種新型的mES培養(yǎng)體系。這種體系不依賴于外源的人工重組LIF，同時也不需要利用小鼠胚胎成纖維細胞MEF作為滋養(yǎng)層細胞。而傳統(tǒng)的飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)mES時，在培養(yǎng)液中加入抑制胚胎干細胞自主分化的因子-人工重組LIF。本發(fā)明利用上皮細胞和內(nèi)皮細胞自發(fā)分泌LIF的特點，可以避免增加外源的人工重組的LIF。本發(fā)明所提供的mES培養(yǎng)體系無需孕鼠、無需谷氨酰胺、無需非必需氨基酸、無需人工重組的LIF。傳統(tǒng)培養(yǎng)體系因制備MEF不定期需要孕鼠，需具備養(yǎng)飼小鼠的設(shè)備和條件；同時傳統(tǒng)培養(yǎng)體系需要多種氨基酸和重組LIF。本發(fā)明使得mES的培養(yǎng)成本大大降低。利用本發(fā)明的方法，mES可以穩(wěn)定傳代20代以上，并能夠保持mES未分化的二倍體狀態(tài)和多能性，維持自我更新和快速增值。本發(fā)明的培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法，操作簡便，培養(yǎng)成分簡單，成本低廉，具有重要的應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值。


圖1為ECV-304細胞為滋養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)2天的復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1照片圖2為人膀胱癌上皮細胞T24為滋養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)2天的復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1照片圖3為RT-PCR檢測mES干性分子表達圖4A為未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測照片圖4B為未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測照片圖4C為用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測照片圖4D為用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測照片圖5為ECV-304細胞為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的mES經(jīng)過20代后形成4天的EB
圖6A為Real-time RT-PCR檢測形成的EB中的Neuro D的表達圖6B為Real-time RT-PCR檢測形成的EB中的Sox17的表達圖6C為Real-time RT-PCR檢測形成的EB中的Brachyury(T)的表達具體實施方式
本發(fā)明所提供的培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法無需反復(fù)多次準備孕鼠，無需反復(fù)多次制備MEF，無需反復(fù)多次準備MEF滋養(yǎng)層細胞。本發(fā)明方法直接用上皮細胞或內(nèi)皮細胞按一定密度(與傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系中要求接種的MEF滋養(yǎng)層細胞密度一致)接種在經(jīng)過明膠處理后的培養(yǎng)器皿中后，通過或不經(jīng)過絲裂霉素處理，接種mES(接種密度與傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系中要求接種的mES密度一致)。共同培養(yǎng)2-4天后按照1∶2-5的比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。傳代時，如開始的上皮或內(nèi)皮滋養(yǎng)層細胞未用絲裂霉素處理，只需按照普通貼壁細胞培養(yǎng)方式對滋養(yǎng)層細胞和mES同時進行傳代培養(yǎng)；如在開始對上皮或內(nèi)皮滋養(yǎng)層細胞使用絲裂霉素處理(處理方法與傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系中要求的處理方法一致)，消化、收集mES前，準備上皮或內(nèi)皮滋養(yǎng)層細胞，而消化和收集mES的方法同傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)方法。如使用的為已建系的上皮或內(nèi)皮細胞作為滋養(yǎng)層細胞，可以將此上皮或內(nèi)皮細胞系進行凍存和復(fù)蘇。未用絲裂霉素處理的上皮或內(nèi)皮細胞系和mES共培養(yǎng)時，連同共培養(yǎng)的上皮或內(nèi)皮細胞系和mES同時凍存和復(fù)蘇。
為了簡化研究系統(tǒng)，以人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304(日本DSMZ公司，DSMZno.ACC310)或人膀胱癌上皮細胞系T24(美國ATCC公司，ATCC no.HTB-4TM)為滋養(yǎng)層細胞，以小鼠胚胎干細胞R1(美國ATCC公司。ATCCNumberSCRC-1011)作為mES。以下實驗是在該體系中進行的研究工作，其研究結(jié)果說明了本發(fā)明，同時不限制本發(fā)明的范圍(包括已建系的上皮或內(nèi)皮細胞和原代培養(yǎng)獲得的上皮或內(nèi)皮細胞及其他類型的mES)。另外，下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。下述實施例中，除了CO2的百分含量為體積百分含量外，其它百分含量如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、以人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞一、ECV-304滋養(yǎng)層細胞的制備1、ECV-304細胞培養(yǎng)主要實驗材料細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304(日本DSMZ公司，DSMZ no.ACC310)，以下簡稱ECV-304。
細胞培養(yǎng)液在高糖DMEM(Hyclone公司的產(chǎn)品，貨號為SH30243.01)中添加小牛血清和硫代甘油(MTG)，使小牛血清的質(zhì)量百分含量為10％，使硫代甘油的含量為1.5×10-4mol/L。
消化液0.25％胰蛋白酶以1∶1的體積比加入0.02％EDTA得到的溶液。
2、ECV-304細胞復(fù)蘇(1)細胞復(fù)蘇自凍存液氮罐中取出凍存細胞，迅速置入37℃-42℃水浴中，使細胞快速融化；離心去除凍存液，加入ECV-304細胞培養(yǎng)液，置在37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(2)ECV-304細胞培養(yǎng)復(fù)蘇的細胞在24小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，待細胞生長達到70％融合時，按1∶3～1∶6傳代培養(yǎng)。
2、ECV-304滋養(yǎng)層細胞的制備主要實驗材料絲裂霉素-C絲裂霉素-C 2mg溶解于4ml的0.01mol/L、pH為7.2-7.5 PBS中，配制成0.5mg/ml的母液；4℃避光保存。使用前，用上述細胞培養(yǎng)液配成終濃度為10ug/ml。稀釋后4℃保存，不超過一周。
0.1％明膠水溶液明膠0.1g，超純水100ml。稍加熱溶解后高壓滅菌45min。4℃保存?zhèn)溆谩?br> (1)未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞制備將ECV-304細胞在傳代后2-3天制備滋養(yǎng)層細胞。用上述消化液消化ECV-304細胞，用上述細胞培養(yǎng)液制備成細胞懸液，種植到預(yù)先用0.1％明膠水溶液處理過的培養(yǎng)瓶(皿)內(nèi)。種植的細胞密度為1×104個/cm2。將制備好的飼養(yǎng)單層在37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，第二天備用。
(2)用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞制備A.當(dāng)ECV-304細胞生長連成一片時，在培養(yǎng)上清中加入絲裂霉素-C，使終濃度為10ug/ml，放回培養(yǎng)箱作用2～3hr。
或當(dāng)ECV-304細胞生長連成一片時，用γ-射線照射，照射量為3000～10000rad。
B.用明膠預(yù)先處理培養(yǎng)瓶(皿)。處理方法是將0.1％明膠水溶液吸入培養(yǎng)瓶(皿)內(nèi)，以能覆蓋培養(yǎng)瓶(皿)表面即可，在室溫下靜置2hr以上。使用前，吸棄多余的明膠水溶液，用PBS洗滌一次。
C.棄含有絲裂霉素-C的飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清。用PBS洗滌五次；若用γ-射線處理，則省去用PBS洗滌。
D消化飼養(yǎng)細胞。用上述細胞培養(yǎng)液制備成3×105個/ml密度的細胞懸液，種植到預(yù)先用明膠處理過的培養(yǎng)瓶(皿)內(nèi)。種植的細胞數(shù)為7.5×104～1×105個/cm2。
E.在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
F.待細胞貼壁后進行觀察，若發(fā)現(xiàn)細胞過稀，補加處理過的細胞，以保證細胞能連成一片而沒有間隙。
G.將制備好的飼養(yǎng)單層放置在培養(yǎng)箱內(nèi)備用。當(dāng)細胞貼壁后即可使用(處理的細胞約需6-8小時即可貼壁)，使用前要更換細胞培養(yǎng)液。絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞與小鼠胚胎干細胞共培養(yǎng)時間不超過2天，必須對小鼠胚胎干細胞傳代，否則，因ECV-304滋養(yǎng)層細胞死亡導(dǎo)致小鼠胚胎干細胞的分化或凋亡。
二、已建系的胚胎干細胞體外培養(yǎng)1.胚胎干細胞R1在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中的培養(yǎng)(1)將復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1用上述細胞培養(yǎng)液重懸或?qū)⒁言趥鹘y(tǒng)的mES培養(yǎng)體系MEF滋養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)2-4d、生長旺盛的胚胎干細胞R1克隆消化成單細胞懸液，用于傳代。
(2)重懸復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1直接接種到步驟一制備的新的未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304飼養(yǎng)單層細胞上(飼養(yǎng)單層細胞密度為1×104/cm2)。需傳代的小鼠胚胎干細胞R1用ECV-304細胞培養(yǎng)液以1∶3～1∶6比例轉(zhuǎn)種到步驟一制備的新的未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304飼養(yǎng)單層細胞上(飼養(yǎng)單層細胞密度為1×104/cm2)。37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。結(jié)果表明無論是復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1，還是傳代的小鼠胚胎干細胞R1，2天后均觀察到mES有胚胎干細胞樣小集落出現(xiàn)，3-4天增大。圖1顯示的是培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細胞R1照片。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細胞R1相同。
(3)培養(yǎng)2-4天后，將培養(yǎng)的ECV-304滋養(yǎng)層細胞和上述mES細胞同時按常規(guī)細胞傳代方法消化，以1∶3～1∶6比例將兩種細胞同時轉(zhuǎn)接種到用0.1％明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)器皿中。此過程無需再制備ECV-304滋養(yǎng)層細胞。
(4)按上述方法連續(xù)傳代。3-4代后，根據(jù)ECV-304滋養(yǎng)層細胞密度變化，適當(dāng)增加ECV-304滋養(yǎng)層細胞，保持細胞密度≥7.5×104個/cm2。過低密度的ECV-304滋養(yǎng)層細胞不易保持mES的多能性。
(5)凍存和復(fù)蘇細胞凍存用消化液消化ECV-304滋養(yǎng)層細胞和上述mES細胞5-15分鐘，加入上述細胞培養(yǎng)液終止反應(yīng)，離心后去除上清，用凍存液---上述細胞培養(yǎng)液含有10-15％DMSO(體積比)，重懸細胞至4.0-6.0×106個/ml，每個凍存管加入1ml細胞懸液，按照4℃放置0.5-2小時，-20℃放置2小時，-80℃放置24小時，凍入液氮罐中。
ECV-304滋養(yǎng)層細胞和上述mES細胞的復(fù)蘇按照上述“ECV-304細胞復(fù)蘇”的方法操作。
2.胚胎干細胞在用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中的培養(yǎng)(1)將步驟一制備的用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞接種到用0.1％明膠預(yù)處理的培養(yǎng)器皿中，接種密度為7.5×104個/cm2，作為飼養(yǎng)單層。
(2)第二天，將復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1用上述細胞培養(yǎng)液重懸或?qū)⒁言趥鹘y(tǒng)的mES培養(yǎng)體系MEF滋養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)2-4d、生長旺盛的小鼠胚胎干細胞R1克隆分別消化成單細胞后用上述細胞培養(yǎng)液重懸。
(3)將重懸的mES接種到用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中，37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。
結(jié)果表明無論是復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1，還是在傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系MEF滋養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞R1，2天后均觀察到mES有胚胎干細胞樣小集落出現(xiàn)，3-4天增大。它們的增殖速度和胚胎干細胞克隆的形態(tài)均與圖1顯示的在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)2天的復(fù)蘇的小鼠胚胎干細胞R1相同。
(4)培養(yǎng)2-4天后，按傳統(tǒng)mES培養(yǎng)方法繼續(xù)傳代。但需在傳代的前一天制備ECV-304滋養(yǎng)層細胞A.將已培養(yǎng)2～3d、生長旺盛的胚胎干細胞克隆消化成單細胞懸液。消化方法同前。
B.添加上述細胞培養(yǎng)液，以1∶3-1∶6比例轉(zhuǎn)種到新的飼養(yǎng)單層上。
C.37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
(5)凍存和復(fù)蘇同步驟1的(5)。
實施例2、以人膀胱癌上皮細胞T24為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞一、T24滋養(yǎng)層細胞的制備除了實驗材料中的細胞和細胞培養(yǎng)液外，其它實驗材料和實驗方法均同實施例1的步驟一。
細胞為人膀胱癌上皮細胞T24(美國ATCC公司，ATCC no.HTB-4TM)；細胞培養(yǎng)液為T24細胞培養(yǎng)液在高糖DMEM(Hyclone公司的產(chǎn)品，貨號為SH30243.01)中添加胎牛血清和硫代甘油(MTG)，使胎牛血清的質(zhì)量百分含量為20％，使硫代甘油的含量為3.0×10-4mol/L。
二、已建系的胚胎干細胞體外培養(yǎng)除了滋養(yǎng)層細胞為人膀胱癌上皮細胞T24、細胞培養(yǎng)液為T24細胞培養(yǎng)液外，其它實驗材料和實驗方法均同實施例1的步驟二。
結(jié)果表明，以用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞，與未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為為滋養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)復(fù)蘇或傳代的小鼠胚胎干細胞，2天后均觀察到mES有胚胎干細胞樣小集落出現(xiàn)，3-4天增大。圖2顯示的是用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細胞R1照片。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細胞R1相同。
實施例3、以ECV-304或人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的mES干性標記分子檢測。
一.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測mES干性分子標記在mRNA水平表達1.小鼠胚胎干細胞干性分子(標記分子)轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4，Nanog，Sox2。
2.RT-PCR反應(yīng)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA使用通用引物OligodT，PCR擴增上述基因引物序列分別是OctP15’AATGCCGTGAAGTTGGAG3’，OctP25’GAAGCGACAGATGGTGGT3’；NanogP15’GCCCTGATTCTTCTACCA3’，NanogP25’AGATGCGTTCACCAGATAG3’；Sox2P15’CCCGTGGTTACCTCTTCC3’，Sox2P25’TTCTCCAGTTCGCAGTCC3’；內(nèi)參基因β-actin P15’GCTGTCCCTGTATGCCTCT3’，β-actin P25’TTGATGTCACGCACGATTT3’。其中，OctP1和OctP2是擴增轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4的引物，NanogP1和NanogP2是擴增轉(zhuǎn)錄因子Nanog的引物，Sox2P1和Sox2P2是擴增轉(zhuǎn)錄因子Sox2的引物。
3.收集在上述ECV-304滋養(yǎng)層細胞或人膀胱癌上皮細胞T24中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1，常規(guī)方法提取細胞總RNA，并按照常規(guī)方法進行RT-PCR擴增。PCR擴增條件如下94℃4分鐘變性；(94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)40個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。
同時以按照下述方法得到的傳統(tǒng)mES培養(yǎng)體系培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞R1作為對照(1)用絲裂霉素-C或γ-射線處理已生長成片的MEF飼養(yǎng)細胞，制備成飼養(yǎng)單層。制備方法同實施例1。
(2)將已培養(yǎng)2～3d、生長旺盛的胚胎干細胞R1克隆消化成單細胞懸液。消化方法同實施例1。
(3)添加胚胎干細胞培養(yǎng)液DMEM中添加15％小牛血清(FBS)、1000IU/ml LIF、0.1mMβ-琉基乙醇(β-ME)或0.15mM單硫甘油(monothioglycerol)、2mM L-谷氨酰胺、2mM非必需氨基酸、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml，以1∶3～1∶6比例轉(zhuǎn)種到新的飼養(yǎng)單層上。
(4)37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
結(jié)果表明，在下述滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中，均擴增得到198bp的Oct3/4條帶，383bp的Nanog條帶和221bp的Sox2條帶a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞。說明在上述滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1有Oct3/4，Nanog，Sox2分子的表達。傳統(tǒng)mES培養(yǎng)體系和本發(fā)明的mES培養(yǎng)體系培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞仍具有相同的干性。
圖3顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1。圖3中，mES傳統(tǒng)mES培養(yǎng)體系培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞R1；co-mES未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞R1。
二.細胞免疫熒光檢測干性標記分子在蛋白質(zhì)水平表達(1)小鼠胚胎干細胞干性分子Oct3/4，SSEA-1。
(2)檢測用抗體鼠源抗鼠Oct3/4單克隆抗體(R&D公司，Cat No.MAB1759)；鼠源抗鼠SSEA-1單克隆抗體(R&D公司，Cat No.MAB2155)；FITC標記的兔抗鼠IgG(北京中杉金橋公司，Cat No.ZF-0304)。
(3)收集在上述滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞，按細胞免疫熒光常規(guī)操作染mES，并用DAPI染細胞核。
結(jié)果表明，在下述滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中，均有Oct3/4和SSEA-1分子的表達a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞。
圖4A顯示的是，未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測照片；圖4B顯示的是，未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測照片；圖4C顯示的是，用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測照片；圖4D顯示的是，用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測照片。
圖4A和圖4C為細胞免疫熒光法檢測mES干性標記分子Oct3/4一抗為鼠源抗鼠Oct3/4單克隆抗體，二抗為FITC標記的兔抗鼠IgG；DAPI為染色體染料。左側(cè)圖片為用FITC標記的Oct3/4的熒光圖像，中間的圖片為DAPI標記的細胞核圖像，右側(cè)圖片為其左邊兩張圖像的疊加。
圖4B和圖4D為細胞免疫熒光法檢測mES干性標記分子SSEA-1一抗為是鼠源抗鼠SSEA-1單克隆抗體，二抗為FITC標記的兔抗鼠IgG；DAPI為染色體染料。左側(cè)圖片為用FITC標記的SSEA-1的熒光圖像，中間的圖片為DAPI標記的細胞核圖像，右側(cè)圖片為其左邊兩張圖像的疊加。
實施例4、以ECV-304或人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的mES多能性分析一.胚胎體(embry body，EB)形成實驗1、實驗材料EB培養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM，加入15％胎牛血清，50ng/ml ascorbic acid(維生素A)，0.5％-1％iron-saturated transferrin(鐵離子飽和的運鐵蛋白)，3.0×10-4M MTG，2mM谷氨酰胺，青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml。上述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
低黏附力φ6cm培養(yǎng)皿BRAND公司，Cat No.452010。
2、制備EB。為去除混合在mES中的ECV-304細胞，將在上述滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1用消化液消化成單個細胞，PBS洗一次，用含10％小牛血清的DMEM重懸細胞，將細胞轉(zhuǎn)移到普通的φ6cm培養(yǎng)皿中，37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置15分鐘，小心吸取懸浮細胞，轉(zhuǎn)移到另一個干凈的φ6cm培養(yǎng)皿中，重復(fù)操作一次。再小心吸取懸浮細胞(因ECV-304細胞較mES更易貼壁，兩次沉降后，去除了ECV-304細胞，懸浮的細胞是mES)，計數(shù)后，離心，改用EB培養(yǎng)液重懸細胞。按照1.8-3.0×104個/φ6cm培養(yǎng)皿，將細胞接種在低黏附力φ6cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿至少加入6ml EB培養(yǎng)液。結(jié)果表明，懸浮培養(yǎng)3-5天后，在下述滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1均形成胚胎體(mEB)a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞。
圖5顯示的是在用絲裂霉素-C處理的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1在EB培養(yǎng)液培養(yǎng)4天后的EB。
3、Real-time RT-PCR檢測形成EB的三個胚層標記分子(1)三個胚層標記分子內(nèi)胚層標記分子Sox17；中胚層標記分子Brachyury(T)；外胚層標記分子Neuro D。
(2)RT-PCR反應(yīng)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA使用通用引物OligodT，PCR擴增Sox17基因的引物是Sox17P15’GCGGACTACAGCAGACAGG 3’和Sox17P25’AGCCACAAATGCCACAAG 3’；PCR擴增Brachyury(T)基因的引物是TP15’TCCCAGACCTACAGCACC 3’和TP25’CATCCACATTGTTCACCC 3’；PCR擴增Neuro D基因的引物是NeuP15’CTGCTGAGTCTCGGGATAGTGT 3’和NeuP25’TAGGGTGAAGGCGTTTGG 3’。PCR擴增內(nèi)參基因β-actin的引物是β-actin P15’GCTGTCCCTGTATGCCTCT3’，β-actin P25’TTGATGTCACGCACGATTT3’。
(3)收集培養(yǎng)3-5天的EB，PBS洗一次，用0.25％胰酶37℃消化10-15分鐘，制備單細胞懸液。提取總RNA。并按照常規(guī)方法進行Real-time RT-PCR擴增。
結(jié)果表明，在下述滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1形成的胚胎體中，均有上述三個胚層的標記分子的表達a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細胞T24作為滋養(yǎng)層細胞。
圖6A顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1來源的mEB，Neuro D在不同分化時間的表達譜；圖6B顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1來源的mEB，Sox17在不同分化時間的表達譜；
圖6C顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1來源的mEB，Brachyury(T)在不同分化時間的表達譜；圖6A-C中，co2d、co3d、co4d、co5d-表示未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細胞R1來源的mEB在2天、3天、4天和5天中三種基因的表達；縱坐標為檢測基因與內(nèi)參基因的相對表達量。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法，是在滋養(yǎng)層細胞上，用胚胎干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞，其特征在于所述滋養(yǎng)層細胞為上皮或內(nèi)皮細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述上皮細胞來源于人膀胱上皮組織；所述內(nèi)皮細胞來源于人臍靜脈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述上皮細胞來源于人膀胱癌上皮細胞系；所述內(nèi)皮細胞來源于人臍靜脈內(nèi)皮細胞；所述內(nèi)皮細胞包括已建系的內(nèi)皮細胞和原代培養(yǎng)所獲得的內(nèi)皮細胞；所述上皮細胞包括已建系的上皮細胞和原代培養(yǎng)獲得的上皮細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述人膀胱癌上皮細胞系為人膀胱癌上皮細胞T24；所述人臍靜脈內(nèi)皮細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎干細胞培養(yǎng)液是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的質(zhì)量百分含量為10-20％，硫代甘油的含量為1.5-3.0×10-4mol/L。
6.一種用于培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)基，由滋養(yǎng)層細胞和胚胎干細胞培養(yǎng)液組成；所述滋養(yǎng)層細胞為上皮或內(nèi)皮細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述上皮細胞來源于人膀胱上皮組織；所述內(nèi)皮細胞來源于人臍靜脈。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述上皮細胞來源于人膀胱癌上皮細胞系；所述內(nèi)皮細胞來源于人臍靜脈內(nèi)皮細胞；所述內(nèi)皮細胞包括已建系的內(nèi)皮細胞和原代培養(yǎng)所獲得的內(nèi)皮細胞；所述上皮細胞包括已建系的上皮細胞和原代培養(yǎng)獲得的上皮細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述人膀胱癌上皮細胞系為人膀胱癌上皮細胞T24；所述人臍靜脈內(nèi)皮細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述胚胎干細胞培養(yǎng)液是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的質(zhì)量百分含量為10-20％，硫代甘油的含量為1.5-3.0×10-4mo1/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的方法，是在滋養(yǎng)層細胞上，用胚胎干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞，其中，所述滋養(yǎng)層細胞為上皮細胞或內(nèi)皮細胞。該方法中所用的培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)基由上皮細胞或內(nèi)皮細胞和胚胎干細胞培養(yǎng)液組成。該胚胎干細胞培養(yǎng)液優(yōu)選是高糖DMEM，10－20％胎牛血清或小牛血清，1.5－3.0×10
文檔編號C12N5/06GK1995334SQ200610169528
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者周海勝, 孫曉萌, 鄧宏魁, 丁明孝 申請人:北京維通達生物技術(shù)有限公司