專利名稱：蟾蜍二烯內(nèi)酯在抑制血管生成中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的新用途，特別是涉及蟾蜍二烯內(nèi)酯的新用途。
背景技術(shù)：
研究表明，腫瘤自身具備啟動和促進新生血管生成的能力，以滿足自身的新陳代謝和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的需要。腫瘤新生血管的生成(angiogenesis)從已有血管床開始。如果沒有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長不會超過1～2mm，也不會出現(xiàn)浸潤和轉(zhuǎn)移。抑制腫瘤血管生成，與阻斷腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。抑制腫瘤血管生成，還可阻止癌前病變向癌的惡性轉(zhuǎn)變。不僅實體腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴新生血管生成，血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如惡性淋巴瘤、淋巴細胞白血病等)的生長和轉(zhuǎn)移也與血管生成密切相關(guān)。腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后與血管生成密切相關(guān)，以腫瘤的血管生成為靶點，開發(fā)血管生成抑制劑，不但可用于大多數(shù)實體腫瘤的治療，還可用于癌的預(yù)防和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，具有重要的理論及現(xiàn)實意義。
中藥蟾酥通過蟾綜科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的分泌物經(jīng)加工干燥而成，具有解毒，消腫，止痛、強心的功效。中醫(yī)臨床將其用于麻醉、瘡癤癰腫、中暑吐瀉、咽喉腫痛、牙痛、心力衰竭、癌腫等癥。
蟾酥中含有大量的蟾蜍毒素類物質(zhì)，此類物質(zhì)皆有強心活性，屬于甾族化合物，在C17上再接一個吡喃酮基，為蟾蜍二烯內(nèi)酯(bufadienolide)，是蟾酥及蟾蜍漿液的主要有效成分。在以往的應(yīng)用和研究中，蟾蜍二烯內(nèi)酯主要用于治療心血管系統(tǒng)方面的疾病，具有洋地黃樣強心作用，能明顯增強動物離體心臟的收縮力，并能增加缺血心肌的血流量。蟾酥雖然已經(jīng)用于臨床治療腫瘤，有一定療效，但由于其活性成分的抗癌作用機制不明確，劑量使用不合理，限制了其抗癌作用的發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供蟾蜍二烯內(nèi)酯的一種新用途。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，蟾蜍二烯內(nèi)酯具有抑制血管生成的作用。因此本發(fā)明的技術(shù)方案是式I化合物在制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用，其中，所述式I化合物中的R為H、OCOCH3、CH3、OH或COOH。
(式I)當式I化合物中的R為H時，得到的化合物是式II化合物，為酯蟾毒配基(Resibufogenin)；當式I化合物中的R為OCOCH3時，得到的化合物是式III化合物，為華蟾蜍毒基(Cinobufagin)。
(式II) (式III)需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為華蟾蜍毒基0.0143-0.0857mg/kg體重/天，酯蟾毒配基0.2857-2.8571mg/kg體重/天。
本發(fā)明的研究表明，除了治療和/或預(yù)防癌癥，以蟾蜍二烯內(nèi)酯為活性成分的抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物，對于與血管生成有關(guān)的疾病如糖尿病、視網(wǎng)膜病變、風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等疾病具有確切的治療和預(yù)防作用，對傷口愈合中的斑痕形成也有顯著的抑制作用。
本發(fā)明巧妙地以血管生成做為治療疾病的靶點，具有以下優(yōu)點1、治療針對已經(jīng)啟動的新生血管進行，具有特異性；2、由于血管內(nèi)皮細胞暴露于血流中，藥物直接發(fā)揮作用，故劑量小，療效高，副作用??；3、由于內(nèi)皮細胞基因表達相對穩(wěn)定，故不易產(chǎn)生耐藥性。


圖1為二種蟾蜍二烯內(nèi)酯對人類血管內(nèi)皮細胞增殖的劑量依賴性抑制作用曲線。
圖2為不同濃度華蟾蜍毒基處理后人類血管內(nèi)皮細胞管形成的光學(xué)顯微鏡照片。
圖3為不同濃度酯蟾毒配基處理后人類血管內(nèi)皮細胞管形成的光學(xué)顯微鏡照片。
圖4為不同濃度華蟾蜍毒基處理后人類血管內(nèi)皮細胞遷移結(jié)果的光學(xué)顯微鏡照片。
圖5為不同濃度酯蟾毒配基處理后人類血管內(nèi)皮細胞遷移結(jié)果的光學(xué)顯微鏡照片。
具體實施例方式
實施例1華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基對人類血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用。
將人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC，購自Cascade Biologics公司，CotC-003-5C)置于含10％胎牛血清(FBS)的Medium 200(購自Cascade Biologics公司)中培養(yǎng)(37℃、5％CO2、95％濕度)培養(yǎng)，取第四代細胞按密度4000/250ul接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)定對照組、各個濃度梯度的用藥組及空白對照，每組均做3個復(fù)孔。待細胞生長密度達80％，分別加入5ul各濃度梯度的華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基(以DMSO溶解)，使終濃度分別為1000uM、100uM、10uM、5uM和1uM，對照組加入5ulDMSO，繼續(xù)培養(yǎng)(M200培養(yǎng)基，2％FBS)48小時后，加入5mg/ml的四唑溴鹽(MTT)20ul，37℃繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150ulDMSO，輕輕振蕩，1小時后在490nm波長處用BIO-RAD Model 3500微板讀數(shù)儀測定各孔吸光值，以吸光值表示各孔中活細胞的數(shù)量。上述實驗重復(fù)3次。結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基對人類臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖呈劑量依賴性抑制作用，其半數(shù)抑制量分別為1uM和5uM。
實施例2華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基對人類血管內(nèi)皮細胞管形成能力的抑制作用。
24孔培養(yǎng)板每孔加入BD MatrigelTMMatrix原膠200ul，使之聚合成膠，第四代人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)懸液按30000cell/500ul密度接種至涂有Matrigel膠的24孔板中，設(shè)定對照組、各個濃度梯度的用藥組(華蟾蜍毒基分別為0.5uM、1uM、5uM、10uM；酯蟾毒配基分別為1uM、2.5uM、5uM、10uM，以DMSO溶解)，用藥組分別加入10ul具濃度梯度的華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基，對照組加入無菌DMSO10ul，每組均做3個復(fù)孔。37℃、5％CO2、95％濕度培養(yǎng)24小時，OLYMPUS CK40-RFL光學(xué)顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細胞管形成，每孔取4個低倍視野計數(shù)，以O(shè)LYMPUS CK40數(shù)碼照相機拍照。結(jié)果如圖2、圖3所示，顯示華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基對人類血管內(nèi)皮細胞管形成能力呈劑量依賴性抑制，其半數(shù)抑制量分別為0.5uM和2.5uM。
實施例3華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基對人類血管內(nèi)皮細胞遷移能力的抑制作用。
1、制備趨化因子取傳代后第二天長勢良好的NIH3T3細胞。無血清DMEM輕柔漂洗2次。無血清DMEM，5％CO2，37℃培養(yǎng)24-48hours。收集細胞上清。離心(12000g，4℃，10min)。上清濾菌(0.22um濾膜)，分裝保存(-20℃)。
2、Matrigel侵襲實驗取稀釋的Matrigel 25ul(原膠以DMEM按1∶2比例稀釋)加入Transwell板上室，覆蓋整個聚酯膜表面，37℃孵育30min，使Matrigel聚合成膠。第四代人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)懸液按30000/250ul密度接種至上室，PBS洗滌3次從培養(yǎng)瓶中消化并收獲細胞。用無血清DMEM制成單細胞懸液，5×105cells/ml，用藥組加入各濃度梯度的藥物(華蟾蜍毒基分別為0.5uM、1uM、5uM、10uM；酯蟾毒配基分別為1uM、2.5uM、5uM、10uM)，對照組加入同體積的DMSO。Transwell板下室加入500ul步驟1制備的趨化因子。5％CO2，37℃培養(yǎng)24小時。用DMEM濕棉簽輕輕擦去凝膠及聚酯膜上表面的細胞。小心取出上室，用冰預(yù)冷的甲醇固定30分鐘。蘇木素染色1分鐘。梯度酒精脫水(80％，95％，100％，100％)，二甲苯透明。小心將聚酯膜從上室切取下來，置于載玻片上中性樹脂封片。附著于聚酯膜下表面的細胞在高倍鏡下(400×)隨機取6個視野計數(shù)取平均值并拍照。重復(fù)實驗2次。結(jié)果如圖4，5所示，表明華蟾蜍毒基和酯蟾毒配基對人類血管內(nèi)皮細胞的遷移能力呈劑量依賴性抑制作用。
實施例4荷瘤裸鼠體內(nèi)試驗。
收獲人類結(jié)腸癌細胞系LoVo細胞，用PBS制成細胞懸液，以200萬/200ul接種至8周大的BALB/cAnN-nu/nu裸鼠的右股部皮下。待瘤體生長至5mm×5mm大小時，隨機分成兩組，每組5只。華蟾蜍毒基用藥組給藥劑量為0.7mg/kg，酯蟾毒配基用藥組給藥劑量為5.1mg/kg(藥物均以含10％DMSO的PBS溶液溶解)，對照組給含10％DMSO的PBS溶液200ul，連續(xù)給藥60天，每天記錄瘤體的長徑和短徑。用藥期間，小鼠未出現(xiàn)不良反應(yīng)。處死小鼠后，取出腫瘤，檢測腫瘤的微血管密度。結(jié)果顯示，兩用藥組瘤體較對照組縮小，生長明顯減慢，微血管密度明顯低于對照組。說明兩藥均具有體內(nèi)抑制腫瘤的作用，而且副作用很小。
權(quán)利要求
1.式I化合物在制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用，其中，所述式I化合物中的R為H、OCOCH3、CH3、OH或COOH。 (式I)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述式I化合物中的R為H或OCOCH3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于在所述抑制血管生成的藥物中，華蟾蜍毒基的有效劑量為0.0143-0.0857mg/kg體重/天，酯蟾毒配基0.2857-2.8571mg/kg體重/天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于在制備抑制血管生成的藥物中還加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防癌癥的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為傷口愈合中抑制斑痕形成的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防糖尿病、視網(wǎng)膜病、早熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防老年盤狀斑變性、風濕性關(guān)節(jié)炎及銀屑病的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防血管瘤的藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了蟾蜍二烯內(nèi)酯在抑制血管生成中的新用途，研究表明，蟾蜍二烯內(nèi)酯具有抑制血管生成的作用。其技術(shù)方案是式I化合物在制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用，其中，所述式I化合物中的R為H、OCOCH
文檔編號A61P9/10GK1511533SQ0215968
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者王振軍, 趙博 申請人:北京大學(xué)第一醫(yī)院