本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種ilv衰減子的突變體，以及含有該突變體的工程菌，以及該工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：l-纈氨酸是人體必需的8種氨基酸之一，與亮氨酸、異亮氨酸統(tǒng)稱為分支鏈氨基酸。由于它特殊的結(jié)構(gòu)和功能，l-纈氨酸在人和動(dòng)物生命代謝中具有重要作用。l-纈氨酸是食品行業(yè)中常用的風(fēng)味劑、營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑。l-纈氨酸可作為動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充產(chǎn)品，用于飼料添加劑，能改善禽畜的免疫機(jī)能。醫(yī)藥上，高純度的l-纈氨酸常被用于制造復(fù)合氨基酸輸液或氨基酸注射液，還可用于合成抗高血壓藥和抗腫瘤藥物等。此外，l-纈氨酸也可用于抗生素、除草劑以及化妝品等領(lǐng)域。目前國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)l-纈氨酸的主要方法是微生物發(fā)酵法。然而，微生物中l(wèi)-纈氨酸的合成途徑及調(diào)控方式較復(fù)雜，是高效發(fā)酵生產(chǎn)l-纈氨酸及其衍生物的關(guān)鍵限制因素。微生物合成氨基酸(如l-組氨酸、l-蘇氨酸、l-苯丙氨酸、l-亮氨酸、l-纈氨酸和l-色氨酸等)的操縱子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在衰減調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)胞內(nèi)特定氨基酸濃度較高時(shí)，氨基酸操縱子的轉(zhuǎn)錄提前終止。相反地，當(dāng)胞內(nèi)特定氨基酸缺乏時(shí)，rna聚合酶轉(zhuǎn)錄氨基酸操縱子。生物法生產(chǎn)l-纈氨酸或其衍生物的過程中，胞內(nèi)l-纈氨酸逐步積累，通過上述衰減調(diào)控機(jī)制反饋?zhàn)瓒鬷lvlxgmed操縱子的表達(dá)，不利于l-纈氨酸或其衍生物的生物合成。因此，高效解除纈氨酸對(duì)ilvlxgmed操縱子的衰減調(diào)控，是生物合成l-纈氨酸及其衍生物的關(guān)鍵。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種ilv衰減子的突變體、相關(guān)工程菌及其在生產(chǎn)纈氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明首先保護(hù)一種dna分子甲(ilv衰減子突變體)，為如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列2第n1至n2位核苷酸所示的dna分子；n1為129以上148以下的自然數(shù)(n1優(yōu)選為137)，n2為155以上215以下的自然數(shù)(n2具體可為155以上185以下的自然數(shù)或186以上215以下的自然數(shù)，更具體可為155、185或215)；(a2)在(a1)的末端連接標(biāo)簽序列得到的dna分子；(a3)在(a1)的末端連接連接序列得到的dna分子。ilv衰減子突變體為ilv衰減子截短體或ilv衰減子變體。ilv衰減子截短體如序列表的序列2第n1至155位核苷酸所示。ilv衰減子變體如序列表的序列2第n1至n3位核苷酸所示，n3為156以上215以下的自然數(shù)(n3具體可為156以上185以下的自然數(shù)或186以上215以下的自然數(shù)，更具體可為185或215)。本發(fā)明還保護(hù)所述dna分子甲在促進(jìn)下游目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用中，所述dna分子甲作為調(diào)控元件。所述應(yīng)用中，所述dna分子甲位于所述目的基因的啟動(dòng)子和所述目的基因的起始密碼子之間。所述應(yīng)用中，所述啟動(dòng)子具體可為序列表的序列1所示的啟動(dòng)子pthr-trc。所述應(yīng)用中，所述目的基因具體可為序列表的序列3所示的gfp基因。本發(fā)明還保護(hù)dna分子乙，自上游至下游依次包括：所述dna分子甲和目的基因。所述目的基因具體可為序列表的序列3所示的gfp基因。本發(fā)明還保護(hù)dna分子丙，自上游至下游依次包括：?jiǎn)?dòng)子、所述dna分子甲、目的基因和終止子。所述啟動(dòng)子具體可為序列表的序列1所示的啟動(dòng)子pthr-trc。所述目的基因具體可為序列表的序列3所示的gfp基因。所述終止子具體可為ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。所述dna分子甲或所述dna分子乙或所述dna分子丙中，不具有ilv衰減子的第1至n4位核苷酸，n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述dna分子乙自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列2第137至215位核苷酸，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因。所述dna片段丙自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列1所示的啟動(dòng)子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識(shí)別序列，序列表的序列2第137至215位核苷酸，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。本發(fā)明還保護(hù)dna分子丁(解除反饋?zhàn)瓒舻膇lvlxgmed操縱子基因，又稱ilvlxgmed操縱子基因突變體)，是將ilvlxgmed操縱子基因中從ilv衰減子第1位開始計(jì)數(shù)的第1至n4位核苷酸去除得到的dna分子；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述dna分子丁具體可為序列表的序列2第137至5009位核苷酸所示的雙鏈dna分子。本發(fā)明還保護(hù)dna分子戊，自上游至下游依次包括如下元件：?jiǎn)?dòng)子、所述dna分子丁和終止子。所述啟動(dòng)子具體可為序列表的序列6所示的啟動(dòng)子pjj。所述終止子具體可為ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。所述dna分子戊自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列6所示的啟動(dòng)子pjj，限制性內(nèi)切酶bamhi的酶切識(shí)別序列，序列表的序列2第137至5057位核苷酸所示的雙鏈dna分子。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組菌是將所述dna分子丁或所述dna分子戊導(dǎo)入出發(fā)菌得到的。所述出發(fā)菌可為埃希氏菌屬細(xì)菌或棒桿菌屬細(xì)菌。所述埃希氏菌屬細(xì)菌具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌k-12或其衍生菌株，更具體可為大腸桿菌k12mg1655或e.colik-12mg1655△ilva。所述棒桿菌屬細(xì)菌具體可為谷氨酸棒桿菌，例如谷氨酸棒桿菌13032等。e.colik-12mg1655△ilva是將大腸桿菌k12mg1655基因組中編碼ilva蛋白的基因敲除得到的菌株。e.colik-12mg1655△ilva是將大腸桿菌k12mg1655基因組中編碼ilva蛋白的基因的開放閱讀框敲除得到的菌株。所述敲除的實(shí)現(xiàn)方法具體可為向大腸桿菌k12mg1655中導(dǎo)入干擾片段或干擾質(zhì)粒。所述干擾片段具體可為如下dna分子：自上游至下游依次由序列表的序列4第140-637位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列4第2183-2712位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。所述干擾質(zhì)粒具體可為將所述干擾片段插入pkov質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。ilva蛋白為如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b2)將序列的氨基酸序列5經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列5衍生的蛋白質(zhì)。編碼ilva蛋白的基因具體可如序列表的序列4所示。編碼ilva蛋白的基因的開放閱讀框具體可為序列表的序列4第638-2182位核苷酸。本發(fā)明還保護(hù)所述重組菌在制備纈氨酸中的應(yīng)用。應(yīng)用所述重組菌生產(chǎn)纈氨酸時(shí)，采用葡萄糖作為碳源。應(yīng)用所述重組菌生產(chǎn)纈氨酸時(shí)，采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組菌。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以是豐富培養(yǎng)基，也可以是無機(jī)鹽培養(yǎng)基。培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機(jī)離子、抗生素和其它的營(yíng)養(yǎng)因子。作為碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖類；也可以是甘油、甘露醇等醇類；也可以使用葡萄糖酸、檸檬酸、丁二酸等有機(jī)酸類。作為氮源，可以使用氨水、硫酸銨、磷酸銨、氯化銨等無機(jī)氮源；也可以使用玉米漿、豆粕水解液、毛發(fā)粉、酵母提取物、蛋白胨等有機(jī)氮源。無機(jī)離子包含鐵、鈣、鎂、錳、鉬、鈷、銅、鉀等離子中的一種或多種。其它營(yíng)養(yǎng)因子還包括生物素、維生素b1、吡哆醛等維生素。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖。所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體可為：發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/l、硫酸銨15.0g/l、磷酸二氫鉀2.0g/l、七水硫酸鎂2.0g/l、酵母粉2.0g/l、異亮氨酸0.6g/l、碳酸鈣15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量為水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量為水。所述培養(yǎng)的條件具體可為：37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)36h。所述培養(yǎng)的條件具體可為：將種子液以3％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)36h。種子液的制備方法如下：將重組菌接種至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液。所述種子液的od600nm值具體可為5.0。所述培養(yǎng)的過程中進(jìn)行如下過程控制：培養(yǎng)過程中，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph值使其維持在6.8-7.0；培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，檢測(cè)葡萄糖含量，當(dāng)體系中的葡萄糖含量低于5g/l時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達(dá)到10g/l。本發(fā)明還保護(hù)一種提高微生物生產(chǎn)纈氨酸的能力的方法，包括如下步驟：刪除微生物的ilvlxgmed操縱子基因中從ilv衰減子第1位開始計(jì)數(shù)的第1至n4位核苷酸；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述微生物為具有ilvlxgmed操縱子的微生物。所述微生物具體可為埃希氏菌屬微生物。所述埃希氏菌屬微生物具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌k-12或其衍生菌株，更具體可為大腸桿菌k12mg1655或e.colik-12mg1655△ilva。本發(fā)明還保護(hù)一種解除微生物中ilvlxgmed操縱子反饋?zhàn)瓒舻姆椒?，包括如下步驟：刪除微生物的ilvlxgmed操縱子基因中從ilv衰減子第1位開始計(jì)數(shù)的第1至n4位核苷酸；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述微生物為具有ilvlxgmed操縱子的微生物。所述微生物具體可為埃希氏菌屬微生物。所述埃希氏菌屬微生物具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌k-12或其衍生菌株，更具體可為大腸桿菌k12mg1655或e.colik-12mg1655△ilva。以上任一所述ilvlxgmed操縱子可為來源于埃希氏菌屬微生物的ilvlxgmed操縱子，具體可為來源于大腸桿菌的ilvlxgmed操縱子。埃希氏菌屬微生物并不特別限定用哪一種微生物，若野生型株用作含有ilvlxgmed操縱子的dna供體株，可以得到含有野生型ilvlxgmed操縱子的dna。然而，大腸桿菌k-12株不表達(dá)活性的ilvg基因，因此本發(fā)明的ilvg基因來源于大腸桿菌bl21株的染色體。以上任一所述ilvlxgmed操縱子基因包括ilv衰減子、編碼ilvx蛋白的基因，編碼ilvg蛋白(乙酰乳酸合酶)的基因、編碼ilvm蛋白(乙酰乳酸合酶)的基因、編碼ilve蛋白(支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶)的基因和編碼ilvd蛋白(二羥酸脫水酶)的基因。所述ilvx蛋白可為如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c2)將序列的氨基酸序列7經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。ilvg蛋白可為如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d2)將序列的氨基酸序列8經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乳酸合酶功能的由序列8衍生的蛋白質(zhì)。ilvm蛋白可為如下(e1)或(e2)：(e1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(e2)將序列的氨基酸序列9經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乳酸合酶功能的由序列9衍生的蛋白質(zhì)。ilve蛋白可為如下(f1)或(f2)：(f1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(f2)將序列的氨基酸序列10經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶功能的由序列10衍生的蛋白質(zhì)。ilvd蛋白可為如下(g1)或(g2)：(g1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(g2)將序列的氨基酸序列11經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有二羥酸脫水酶功能的由序列11衍生的蛋白質(zhì)。編碼ilvx蛋白的基因具體可如序列表的序列2第186-236位核苷酸所示。編碼ilvg蛋白的基因具體可如序列表的序列2第239-1885位核苷酸所示。編碼ilvm蛋白的基因具體可如序列表的序列2第1882-2145位核苷酸所示。編碼ilve蛋白的基因具體可如序列表的序列2第2165-3094位核苷酸所示。編碼ilvd蛋白的基因具體可如序列表的序列2第3159-5009位核苷酸所示。ilv衰減子如序列表的序列2第1至155位核苷酸所示。ilvlxgmed操縱子基因具體可如序列表的序列2所示。ilvlxgmed操縱子基因具體可如序列表的序列2第1-5009位核苷酸所示。以上任一所述纈氨酸具體可為l-纈氨酸。本發(fā)明通過去除ilv衰減子的特定序列，意外的獲得了可以顯著提高基因表達(dá)水平的ilv衰減子突變體。本發(fā)明通過刪除衰減子中編碼前導(dǎo)肽的基因ilvl和終止子莖環(huán)結(jié)構(gòu)中前段反向互補(bǔ)回文序列，可以顯著提高后續(xù)基因的表達(dá)水平。顯而易見，根據(jù)本專利的試驗(yàn)結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易推論得到，在本發(fā)明保護(hù)的ilv衰減子突變體上同時(shí)保留上述衰減子終止子莖環(huán)結(jié)構(gòu)中前段反向互補(bǔ)回文序列的部分序列，但尚未形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，同樣可能得到相似性能的ilv衰減子突變體和ilvlxgmed操縱子基因突變體。因此，這種類似的改造ilv衰減子的方法也在本專利的保護(hù)范圍之中。顯而易見，在改造菌株染色體上的ilv衰減子同時(shí)刪除ilvl開放閱讀框上游若干堿基對(duì)，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。顯而易見，本發(fā)明解除大腸桿菌的ilv衰減子的方法，同樣可應(yīng)用于其它菌屬的ilv衰減子。本發(fā)明可以用于生產(chǎn)纈氨酸，因此，顯而易見，本發(fā)明還可用于纈氨酸代謝途徑下游化合物的生物合成。采用本發(fā)明提供的方案，可以顯著提高纈氨酸及其衍生物產(chǎn)量，對(duì)于纈氨酸及其衍生物的生產(chǎn)領(lǐng)域具有極其重大的應(yīng)用推廣價(jià)值。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。atcc：https://www.atcc.org/。大腸桿菌k12mg1655：atcc編號(hào)為700926。pacyc184質(zhì)粒：neb公司，產(chǎn)品目錄號(hào)e4152s。pgfpuv載體：clontechlaboratories,inc.，catalogno.632312。pkov質(zhì)粒：addgene公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為25769。大腸桿菌ec135：記載于如下文獻(xiàn)：zhangetal,plosgenetics，2012,8(9):e1002987。實(shí)施例1、衰減子突變體調(diào)控gfp基因的表達(dá)一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc1、合成序列表的序列1所示的雙鏈dna分子(啟動(dòng)子pthr-trc)。2、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy1947和wy1948組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。wy1947：ctagtctagagcttttcattctgactgcaac；wy1948：cccaagcttacattatacgagccggatgattaattgtcaactgtctgtgcgctatgcct。3、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶xbai和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。4、取pacyc184質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶xbai和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約4.1kb)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc。二、構(gòu)建各個(gè)重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的重組菌1、構(gòu)建重組菌gfp3227(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3227和wy3254組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2；將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2混合后作為模板，采用wy3227和wy1859組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3。wy3227：cccaagcttaagatgcaagaaaagacaaaatgacag；wy3254：agttcttctcctttactcatagaaccagaaccagaacctgagaaacagaattttgtgct；wy3105：ggttctggttctggttctatgagtaaaggagaagaacttttca；wy1859：引物中，下劃線標(biāo)注的為酶切識(shí)別序列，方框標(biāo)注的為終止子序列。(2)取步驟(1)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，然后化轉(zhuǎn)至大腸桿菌ec135，并從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3227。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3227進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pacyc184的xbai和sphi酶切位點(diǎn)之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列1所示的啟動(dòng)子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識(shí)別序列，ilvl基因的rbs序列“aagatgcaagaaaagacaaa”，序列表的序列2第1至215位核苷酸(包含完整的ilv衰減子序列和ilvx基因開放閱讀框中編碼前10個(gè)氨基酸殘基的核苷酸序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。含有重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3227的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3227。2、構(gòu)建重組菌gfp3228(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3228和wy3254組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2；將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2混合后作為模板，采用wy3228和wy1859組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3。wy3228：cccaagcttaggtccgggggttttttttgac。(2)取步驟(1)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，然后化轉(zhuǎn)至大腸桿菌ec135，并從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3228。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3228進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pacyc184的xbai和sphi酶切位點(diǎn)之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列1所示的啟動(dòng)子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識(shí)別序列，序列表的序列2第137至215位核苷酸(包含進(jìn)行截短改造后的ilv衰減子序列和ilvx基因開放閱讀框中編碼前10個(gè)氨基酸殘基的核苷酸序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。含有重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3228的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3228。3、構(gòu)建重組菌gfp3229(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3229和wy3254組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2；將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2混合后作為模板，采用wy3229和wy1859組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3。wy3229：cccaagcttacataaccgaggagcagaca。(2)取步驟(1)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，然后化轉(zhuǎn)至大腸桿菌ec135，并從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3229。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3229進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pacyc184的xbai和sphi酶切位點(diǎn)之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列1所示的啟動(dòng)子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識(shí)別序列，序列表的序列2第166至215位核苷酸(完全刪除ilv衰減子，包含ilvx基因開放閱讀框中編碼前10個(gè)氨基酸殘基的核苷酸序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。含有重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3229的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3229。4、構(gòu)建gfp對(duì)照將重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc導(dǎo)入大腸桿菌ec135，得到的重組菌命名為gfp對(duì)照。三、gfp熒光強(qiáng)度分析試驗(yàn)菌株為：重組菌gfp3227、重組菌gfp3228或重組菌gfp3229。設(shè)置gfp對(duì)照作為對(duì)照菌株。1、將試驗(yàn)菌株或?qū)φ站杲臃N至含34mg/l氯霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。2、取步驟1得到的菌液，按照1％接種量接種于含34mg/l氯霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。3、取150μl步驟2得到的菌液，加入黑邊透底的96孔板中，使用高通量多功能酶標(biāo)儀(infinite200pro型，瑞士tecan)同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞密度和gfp熒光信號(hào)。檢測(cè)細(xì)胞密度的相關(guān)參數(shù)設(shè)置見表1。檢測(cè)gfp熒光信號(hào)的相關(guān)參數(shù)設(shè)置見表2。表1吸光度(absorbance)波長(zhǎng)(wavelength)600nm帶寬(bandwidth)9nm閃光次數(shù)(numberofflashes)25建立時(shí)間(settletime)0ms表2熒光頂讀(fluorescencetopreading)激發(fā)波長(zhǎng)(excitationwavelength)400nm發(fā)射波長(zhǎng)(emissionwavelength)510nm激發(fā)帶寬(excitationbandwidth)9nm發(fā)射帶寬(emissionbandwidth)20nm收集(gain)100(manual，手動(dòng))閃光次數(shù)(numberofflashes)15積分時(shí)間(integrationtime)20μs滯后時(shí)間(lagtime)0μs建立時(shí)間(settletime)0msz位置(z-position)20000μm(manual，手動(dòng))各個(gè)試驗(yàn)菌株的熒光強(qiáng)度值＝實(shí)測(cè)熒光值÷細(xì)胞密度-對(duì)照菌株的實(shí)測(cè)熒光值÷對(duì)照菌株的細(xì)胞密度。設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，相應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見表3。與重組菌gfp3227(攜帶完整ilv衰減子)相比，重組菌gfp3228(攜帶ilv衰減子截短體)的熒光強(qiáng)度值提高了149.0％。與重組菌gfp3229(不攜帶ilv衰減子)相比，重組菌gfp3228的熒光強(qiáng)度值提高了34.1％。結(jié)果表明，位于啟動(dòng)子和目的基因之間的ilv衰減子截短體可以作為調(diào)控元件，促進(jìn)目的基因的表達(dá)。ilv衰減子突變體如序列表的序列2第n1至n2位核苷酸所示；n1為129以上148以下的自然數(shù)(n1優(yōu)選為137)，n2為155以上215以下的自然數(shù)(n2具體可為155以上185以下的自然數(shù)或186以上215以下的自然數(shù)，更具體可為155、185或215)。ilv衰減子突變體包括ilv衰減子截短體和ilv衰減子變體(全稱為在ilv衰減子截短體下游連接其他核苷酸的變體)。ilv衰減子截短體如序列表的序列2第n1至155位核苷酸所示。ilv衰減子變體如序列表的序列2第n1至n3位核苷酸所示，n3為156以上215以下的自然數(shù)(n3具體可為156以上185以下的自然數(shù)或185以上215以下的自然數(shù)，更具體可為185或215)。表3熒光強(qiáng)度重組菌gfp32271465.4±165.5重組菌gfp32283649.3±413.2重組菌gfp32292721.1±138.4實(shí)施例2、制備纈氨酸一、e.colik-12mg1655△ilva的構(gòu)建1、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy577和wy578組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到dna片段-甲(ilva基因上游區(qū)域)。wy577：cgcggatccgaaagtgtacgaaagccagg；wy578：gcgctatcaggcatttttcctattaaccccccagtttcga。2、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy579和wy580組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到dna片段-乙(ilva基因下游區(qū)域)。wy579：tcgaaactggggggttaataggaaaaatgcctgatagcgc；wy580：attgcggccgcgtgaagcggatctggcgatt。3、將dna片段-甲和dna片段-乙混合后作為模板，采用wy577和wy580組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到dna片段-丙。4、取pkov質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和noti進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。5、取dna片段-丙，用限制性內(nèi)切酶bamhi和noti進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。6、將步驟4得到的載體骨架和步驟5得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)?！鱥lva。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒△ilva進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pkov質(zhì)粒的bamhi和noti酶切位點(diǎn)之間插入了如下特異dna分子：自上游至下游依次由序列表的序列4第140-637位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列4第2183-2712位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。ilva基因如序列表的序列4所示，第638-2182位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列5所示的ilva蛋白)。7、將重組質(zhì)?！鱥lva導(dǎo)入大腸桿菌k12mg1655，得到ilva基因敲除的重組菌，命名為e.colik-12mg1655△ilva。ilva基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用wy587和wy588組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，如果得到1344bp擴(kuò)增產(chǎn)物，初步判斷為候選的目標(biāo)菌；進(jìn)一步通過測(cè)序驗(yàn)證菌株染色體上的ilva基因的開放閱讀框被敲除。wy587：atggctgtatccgctcgctg；wy588：acaccatcgatcagcaagggc。二、構(gòu)建重組質(zhì)粒pacyc184-pjj1、合成序列表的序列6所示的雙鏈dna分子(啟動(dòng)子pjj)。2、以步驟1制備的雙鏈dna分子為模板，采用wy843和wy842組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。wy843：tgctctagacaattccgacgtctaagaaa；wy842：cgcggatccggtcagtgcgtcctgctgat。3、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶xbai和bamhi進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。4、取pacyc184質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶xbai和bamhi進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約4.1kb)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj。三、重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvlxgmed構(gòu)建wy4047:cgcggatccaagatgcaagaaaagacaaaatgacag；wy4048:cgcggatccaggtccgggggttttttttgac；wy4049:cgcggatccacataaccgaggagcagaca；wy4044：tgacctgatgttgcatcatgataatttctcca；wy4045：tggagaaattatcatgatgcaacatcaggtca；wy4046：1、以大腸桿菌bl21(de3)的基因組dna為模板，采用wy4047和wy4044組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b1。2、以大腸桿菌bl21(de3)的基因組dna為模板，采用wy4048和wy4044組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b2。3、以大腸桿菌bl21(de3)的基因組dna為模板，采用wy4049和wy4044組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b3。4、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4045和wy4046組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b4。5、將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b4混合后作為模板，采用wy4047和wy4046組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物c1。6、將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b2和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b4混合后作為模板，采用wy4048和wy4046組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物c2。7、將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b3和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b4混合后作為模板，采用wy4049和wy4046組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物c3。8、取質(zhì)粒pacyc184-pjj，用限制性內(nèi)切酶bamhi和eagi雙酶切，回收載體骨架。9、取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物c1，用限制性內(nèi)切酶bamhi和eagi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。10、將步驟8的載體骨架和步驟9的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4047xgmed。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4047xgmed進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pacyc184的xbai和eagi酶切位點(diǎn)之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列6所示的啟動(dòng)子pjj，限制性內(nèi)切酶bamhi的酶切識(shí)別序列，ilvl基因的rbs序列“aagatgcaagaaaagacaaa”，序列表的序列2所示的雙鏈dna分子。11、取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物c2，用限制性內(nèi)切酶bamhi和eagi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。12、將步驟8的載體骨架和步驟11的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4048xgmed。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4048xgmed進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pacyc184的xbai和eagi酶切位點(diǎn)之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列6所示的啟動(dòng)子pjj，限制性內(nèi)切酶bamhi的酶切識(shí)別序列，序列表的序列2第137至5057位核苷酸所示的雙鏈dna分子。13、取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物c3，用限制性內(nèi)切酶bamhi和eagi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。14、將步驟8的載體骨架和步驟13的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4049xgmed。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4049xgmed進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pacyc184的xbai和eagi酶切位點(diǎn)之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列6所示的啟動(dòng)子pjj，限制性內(nèi)切酶bamhi的酶切識(shí)別序列，序列表的序列2第166至5057位核苷酸所示的雙鏈dna分子。四、構(gòu)建工程菌將重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4047xgmed導(dǎo)入e.colik-12mg1655△ilva中，得到重組菌，將其命名為工程菌ilvl4047。將重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4048xgmed導(dǎo)入e.colik-12mg1655△ilva中，得到重組菌，將其命名為工程菌ilvl4048。將重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-ilvl4049xgmed導(dǎo)入e.colik-12mg1655△ilva中，得到重組菌，將其命名為工程菌ilvl4049。五、纈氨酸工程菌的搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)試驗(yàn)菌株為：工程菌ilvl4047、工程菌ilvl4048或工程菌ilvl4049。1、取試驗(yàn)菌株，劃線接種于含34mg/l氯霉素的固體lb培養(yǎng)基平板，37℃靜置培養(yǎng)12小時(shí)。2、完成步驟1后，挑取平板上的菌苔，接種至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液(od600nm值＝5.0)。3、完成步驟2后，將種子液按照3％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/l、硫酸銨15.0g/l、磷酸二氫鉀2.0g/l、七水硫酸鎂2.0g/l、酵母粉2.0g/l、異亮氨酸0.6g/l、碳酸鈣15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量為水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量為水。培養(yǎng)過程中，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph值使其維持在6.8-7.0。培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，使用生物傳感分析儀sba-40d檢測(cè)葡萄糖含量，當(dāng)體系中的葡萄糖含量低于5g/l時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達(dá)到10g/l。培養(yǎng)36h后取樣，12000g離心2分鐘，取上清液(發(fā)酵上清)，檢測(cè)l-纈氨酸濃度。結(jié)果見表4(三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。工程菌ilvl4048生產(chǎn)l-纈氨酸的能力最高，發(fā)酵上清中的l-纈氨酸濃度為2.58±0.55。表4發(fā)酵上清中的l-纈氨酸含量(g/l)工程菌ilvl40471.02±0.15工程菌ilvl40482.58±0.55工程菌ilvl40491.82±0.22發(fā)酵上清中l(wèi)-纈氨酸濃度的檢測(cè)方法：高效液相法，在參考文獻(xiàn)(氨基酸和生物資源，2000，22，59-60)中氨基酸檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，具體方法如下(2,4-二硝基氟苯(fdbn)柱前衍生高效液相法)：取10μl上清液于2ml離心管中，加入200μl0.5mnahco3水溶液和100μl1％(體積比)fdbn-乙腈溶液，于60℃水浴中暗處恒溫加熱60min，然后冷卻至室溫，然后加入700μl0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/lkoh水溶液調(diào)整ph)并搖勻，靜置15min，然后過濾并收集濾液。濾液用于上樣，進(jìn)樣量為15μl。色譜柱為c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm,agilent,usa)；柱溫：40℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；流動(dòng)相a為0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/100mlkoh水溶液調(diào)整ph)，流動(dòng)相b為55％(體積比)乙腈水溶液，流動(dòng)相總流量為1ml/min。洗脫過程：洗脫起始時(shí)刻(0min)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為86％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為14％；洗脫過程分為4個(gè)階段，每個(gè)階段中流動(dòng)相a和流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)均為線性變化；第1階段(從起始時(shí)刻開始共進(jìn)行2min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為88％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為12％，第2階段(從第1階段結(jié)束時(shí)刻開始共進(jìn)行2min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為86％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為14％，第3階段(從第2階段結(jié)束時(shí)刻開始共進(jìn)行6min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為70％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為30％，第4階段(從第3階段結(jié)束時(shí)刻開始共進(jìn)行10min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為30％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為70％。以市售l-纈氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的纈氨酸濃度。最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。sequencelisting<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>ilv衰減子的突變體、相關(guān)工程菌及其在生產(chǎn)纈氨酸中的應(yīng)用<130>gncyx171070<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>192<212>dna<213>大腸桿菌<400>1gcttttcattctgactgcaacgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaaagagtgtct60gatagcagcttctgaactggttacctgccgtgagtaaattaaaattttattgacttaggt120cactaaatactttaaccaatataggcatagcgcacagacagttgacaattaatcatccgg180ctcgtataatgt192<210>2<211>5057<212>dna<213>人工序列<400>2atgacagcccttctacgagtgattagcctggtcgtgattagcgtggtggtgattattatc60ccaccgtgcggggctgcacttggacgaggaaaggcttagagatcaagccttaacgaacta120agacccccgcaccgaaaggtccgggggttttttttgaccttaaaaacataaccgaggagc180agacaatgaataacagcacaaaattctgtttctcaagattcaggacggggaactaactat240gaatggcgcacagtgggtggtacatgcgttgcgggcacagggtgtgaacaccgttttcgg300ttatccgggtggcgcaattatgccggtttacgatgcattgtatgacggcggcgtggagca360cttgctatgccgacatgagcagggtgcggcaatggcggctatcggttatgctcgtgctac420cggcaaaactggcgtatgtatcgccacgtctggtccgggcgcaaccaacctgataaccgg480gcttgcggacgcactgttagattccatccctgttgttgccatcaccggtcaagtgtccgc540accgtttatcggcactgacgcatttcaggaagtggatgtcctgggattgtcgttagcctg600taccaagcacagctttctggtgcagtcgctggaagagttgccgcgcatcatggctgaagc660attcgacgttgcctgctcaggtcgtcctggtccggttctggtcgatatcccaaaagatat720ccagttagccagcggtgacctggaaccgtggttcaccaccgttgaaaacgaagtgacttt780cccacatgccgaagttgagcaagcgcgccagatgctggcaaaagcgcaaaaaccgatgct840gtacgttggcggtggcgtgggtatggcgcaggcagttccggctttgcgtgaatttctcgc900tgccacaaaaatgcctgccacctgtacgctgaaagggctgggcgcagtagaagcagatta960tccgtactatctgggcatgctgggaatgcatggcaccaaagcggcgaacttcgcggtgca1020ggagtgcgacttgctgatcgccgtgggtgcacgttttgatgaccgggtgaccggcaaact1080gaacaccttcgcaccacacgccagtgttatccatatggatatcgacccggcagaaatgaa1140caagctgcgtcaggcacatgtggcattacaaggtgatttaaatgctctgttaccagcatt1200acagcagccgttaaatatcaatgactggcagctacactgcgcgcagctgcgtgatgaaca1260tgcctggcgttacgaccatcccggtgacgctatctacgcgccgttgttgttaaaacaact1320gtcagatcgtaaacctgcggattgcgtcgtgaccacagatgtggggcagcaccagatgtg1380ggctgcgcagcacatcgcccacactcgcccggaaaatttcatcacctccagcggcttagg1440caccatgggttttggtttaccggcggcggttggcgcgcaagtcgcgcgaccaaacgatac1500cgtcgtctgtatctccggtgacggctctttcatgatgaatgtgcaagagctgggcaccgt1560aaaacgcaagcagttaccgttgaaaatcgtcttactcgataaccaacggttagggatggt1620tcgacaatggcagcaactgtttttccaggaacgatatagcgaaaccacccttaccgataa1680ccccgatttcctcatgttagccagcgccttcggcatccctggccaacacatcacccgtaa1740agaccaggttgaagcggcactcgacaccatgctgaacagtgatgggccatacctgcttca1800tgtctcaatcgacgaacttgagaacgtctggccgctggtgccgcctggtgccagtaattc1860agaaatgttggagaaattatcatgatgcaacatcaggtcaatgtatcggctcgcttcaat1920ccagaaaccttagaacgtgttttacgcgtggtgcgtcatcgtggtttccacgtctgctca1980atgaatatggccgccgccagcgatgcacaaaatataaatatcgaattgaccgttgccagc2040ccacggtcggtcgacttactgtttagtcagttaaataaactggtggacgtcgcacacgtt2100gccatctgccagagcacaaccacatcacaacaaatccgcgcctgagcgcaaaaggaatat2160aaaaatgaccacgaagaaagctgattacatttggttcaatggggagatggttcgctggga2220agacgcgaaggtgcatgtgatgtcgcacgcgctgcactatggcacttcggtttttgaagg2280catccgttgctacgactcgcacaaaggaccggttgtattccgccatcgtgagcatatgca2340gcgtctgcatgactccgccaaaatctatcgcttcccggtttcgcagagcattgatgagct2400gatggaagcttgtcgtgacgtgatccgcaaaaacaatctcaccagcgcctatatccgtcc2460gctgatcttcgtcggtgatgttggcatgggagtaaacccgccagcgggatactcaaccga2520cgtgattatcgctgctttcccgtggggagcgtatctgggcgcagaagcgctggagcaggg2580gatcgatgcgatggtttcctcctggaaccgcgcagcaccaaacaccatcccgacggcggc2640aaaagccggtggtaactacctctcttccctgctggtgggtagcgaagcgcgccgccacgg2700ttatcaggaaggtatcgcgctggatgtgaacggttatatctctgaaggcgcaggcgaaaa2760cctgtttgaagtgaaagatggtgtgctgttcaccccaccgttcacctcctccgcgctgcc2820gggtattacccgtgatgccatcatcaaactggcgaaagagctgggaattgaagtacgtga2880gcaggtgctgtcgcgcgaatccctgtacctggcggatgaagtgtttatgtccggtacggc2940ggcagaaatcacgccagtgcgcagcgtagacggtattcaggttggcgaaggccgttgtgg3000cccggttaccaaacgcattcagcaagccttcttcggcctcttcactggcgaaaccgaaga3060taaatggggctggttagatcaagttaatcaataaatacaaaaaatgggacggcacgcacc3120gtcccatttacgagacagacactgggagtaaataaagtatgcctaagtaccgttccgcca3180ccaccactcatggtcgtaatatggcgggtgctcgtgcgctgtggcgcgccaccggaatga3240ccgacgccgatttcggtaagccgattatcgcggttgtgaactcgttcacccaatttgtac3300cgggtcacgtccatctgcgcgatctcggtaaactggtcgccgaacaaattgaagcggctg3360gcggcgttgccaaagagttcaacaccattgcggtggatgatgggattgccatgggccacg3420gggggatgctttattcactgccatctcgcgaactgatcgctgattccgttgagtatatgg3480tcaacgcccactgcgccgacgccatggtctgcatctctaactgcgacaaaatcaccccgg3540ggatgctgatggcttccctgcgcctgaatattccggtgatctttgtttccggcggcccga3600tggaggccgggaaaaccaaactttccgatcagatcatcaagctcgatctggttgatgcga3660tgatccagggcgcagacccgaaagtatctgactcccagagcgatcaggttgaacgttccg3720cgtgtccgacctgcggttcctgctccgggatgtttaccgctaactcaatgaactgcctga3780ccgaagcgctgggcctgtcgcagccgggcaacggctcgctgctggcaacccacgccgacc3840gtaagcagctgttccttaatgctggtaaacgcattgttgaattgaccaaacgttattacg3900agcaaaacgacgaaagtgcactgccgcgtaatatcgccagtaaggcggcgtttgaaaacg3960ccatgacgctggatatcgcgatgggtggatcgactaacaccgtacttcacctgctggcgg4020cggcgcaggaagcggaaatcgacttcaccatgagtgatatcgataagctttcccgcaagg4080ttccacagctgtgtaaagttgcgccgagcacccagaaataccatatggaagatgttcacc4140gtgctggtggtgttatcggtattctcggcgaactggatcgcgcggggttactgaaccgtg4200atgtgaaaaacgtacttggcctgacgttgccgcaaacgctggaacaatacgacgttatgc4260tgacccaggatgacgcggtaaaaaatatgttccgcgcaggtcctgcaggcattcgtacca4320cacaggcattctcgcaagattgccgttgggatacgctggacgacgatcgcgccaatggct4380gtatccgctcgctggaacacgcctacagcaaagacggcggcctggcggtgctctacggta4440actttgcggaaaacggctgcatcgtgaaaacggcaggcgtcgatgacagcatcctcaaat4500tcaccggcccggcgaaagtgtacgaaagccaggacgatgcggtagaagcgattctcggcg4560gtaaagttgtcgccggagatgtggtagtaattcgctatgaaggcccgaaaggcggtccgg4620ggatgcaggaaatgctctacccaaccagcttcctgaaatcaatgggtctcggcaaagcct4680gtgcgctgatcaccgacggtcgtttctctggtggcacctctggtctttccatcggccacg4740tctcaccggaagcggcaagcggcggcagcattggcctgattgaagatggtgacctgatcg4800ctatcgacatcccgaaccgtggcattcagttacaggtaagcgatgccgaactggcggcgc4860gtcgtgaagcgcaggacgctcgaggtgacaaagcctggacgccgaaaaatcgtgaacgtc4920aggtctcctttgccctgcgtgcttatgccagcctggcaaccagcgccgacaaaggcgcgg4980tgcgcgataaatcgaaactggggggttaactagcataaccccttggggcctctaaacggg5040tcttgaggggttttttg5057<210>3<211>717<212>dna<213>人工序列<400>3atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggt60gatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacgga120aaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacactt180gtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcatatgaaacgg240catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctttc300aaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgtt360aatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaa420ctcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcacggcagacaaacaaaagaatgga480atcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcagac540cattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattac600ctgtcgacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtcctt660cttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgagctctacaaataa717<210>4<211>2889<212>dna<213>大腸桿菌<400>4atggctgtatccgctcgctggaacacgcctacagcaaagacggcggcctggcggtgctct60acggtaactttgcggaaaacggctgcatcgtgaaaacggcaggcgtcgatgacagcatcc120tcaaattcaccggcccggcgaaagtgtacgaaagccaggacgatgcggtagaagcgattc180tcggcggtaaagttgtcgccggagatgtggtagtaattcgctatgaaggcccgaaaggcg240gtccggggatgcaggaaatgctctacccaaccagcttcctgaaatcaatgggtctcggca300aagcctgtgcgctgatcaccgacggtcgtttctctggtggcacctctggtctttccatcg360gccacgtctcaccggaagcggcaagcggcggcagcattggcctgattgaagatggtgacc420tgatcgctatcgacatcccgaaccgtggcattcagttacaggtaagcgatgccgaactgg480cggcgcgtcgtgaagcgcaggacgctcgaggtgacaaagcctggacgccgaaaaatcgtg540aacgtcaggtctcctttgccctgcgtgcttatgccagcctggcaaccagcgccgacaaag600gcgcggtgcgcgataaatcgaaactggggggttaataatggctgactcgcaacccctgtc660cggtgctccggaaggtgccgaatatttaagagcagtgctgcgcgcgccggtttacgaggc720ggcgcaggttacgccgctacaaaaaatggaaaaactgtcgtcgcgtcttgataacgtcat780tctggtgaagcgcgaagatcgccagccagtgcacagctttaagctgcgcggcgcatacgc840catgatggcgggcctgacggaagaacagaaagcgcacggcgtgatcactgcttctgcggg900taaccacgcgcagggcgtcgcgttttcttctgcgcggttaggcgtgaaggccctgatcgt960tatgccaaccgccaccgccgacatcaaagtcgacgcggtgcgcggcttcggcggcgaagt1020gctgctccacggcgcgaactttgatgaagcgaaagccaaagcgatcgaactgtcacagca1080gcaggggttcacctgggtgccgccgttcgaccatccgatggtgattgccgggcaaggcac1140gctggcgctggaactgctccagcaggacgcccatctcgaccgcgtatttgtgccagtcgg1200cggcggcggtctggctgctggcgtggcggtgctgatcaaacaactgatgccgcaaatcaa1260agtgatcgccgtagaagcggaagactccgcctgcctgaaagcagcgctggatgcgggtca1320tccggttgatctgccgcgcgtagggctatttgctgaaggcgtagcggtaaaacgcatcgg1380tgacgaaaccttccgtttatgccaggagtatctcgacgacatcatcaccgtcgatagcga1440tgcgatctgtgcggcgatgaaggatttattcgaagatgtgcgcgcggtggcggaaccctc1500tggcgcgctggcgctggcgggaatgaaaaaatatatcgccctgcacaacattcgcggcga1560acggctggcgcatattctttccggtgccaacgtgaacttccacggcctgcgctacgtctc1620agaacgctgcgaactgggcgaacagcgtgaagcgttgttggcggtgaccattccggaaga1680aaaaggcagcttcctcaaattctgccaactgcttggcgggcgttcggtcaccgagttcaa1740ctaccgttttgccgatgccaaaaacgcctgcatctttgtcggtgtgcgcctgagccgcgg1800cctcgaagagcgcaaagaaattttgcagatgctcaacgacggcggctacagcgtggttga1860tctctccgacgacgaaatggcgaagctacacgtgcgctatatggtcggcggacgtccatc1920gcatccgttgcaggaacgcctctacagcttcgaattcccggaatcaccgggcgcgctgct1980gcgcttcctcaacacgctgggtacgtactggaacatttctttgttccactatcgcagcca2040tggcaccgactacgggcgcgtactggcggcgttcgaacttggcgaccatgaaccggattt2100cgaaacccggctgaatgagctgggctacgattgccacgacgaaaccaataacccggcgtt2160caggttctttttggcgggttagggaaaaatgcctgatagcgcttcgcttatcaggcctac2220ccgcgcgacaacgtcatttgtggttcggcaaaatcttccagaatgcctcaattagcggct2280catgtagccgctttttctgcgcacacacgcccagctcaaacggcgttttctcatcgctgc2340gctctaaaatcatcacgcggttacgcaccggttcggggctgttttccagcaccacttccg2400gcaacaatgccacgccacagccgagtgccaccatcgataccatcgcttcatgcccgccaa2460ccgtggcgtaaatcatcgggttactgattttattgcgtcgaaaccacagttcaatgcggc2520ggcgtaccggcccctgatcggccataataaacggcaccgttgaccagtccggcttctcta2580ccgacacctgattacgcaccgggcagggcagcgcgggggcaatcagcactactgccagat2640tctccagcatcgaaaacgccactgcgccgggcaaggtttccggtttacccgcaatcgcca2700gatccgcttcaccagtgaccaccttttccatcgcatctgccgcatcaccagtagtaagtt2760taatctccaccgacgggtgttccgcgcggaagcgatccagaatcggcggcagatggctgt2820aggcagcggtcaccgagcagaagatatgtaattcgccagagagcgacggcccttgctgat2880cgatggtgt2889<210>5<211>514<212>prt<213>大腸桿菌<400>5metalaaspserglnproleuserglyalaprogluglyalaglutyr151015leuargalavalleuargalaprovaltyrglualaalaglnvalthr202530proleuglnlysmetglulysleuserserargleuaspasnvalile354045leuvallysarggluaspargglnprovalhisserphelysleuarg505560glyalatyralametmetalaglyleuthrglugluglnlysalahis65707580glyvalilethralaseralaglyasnhisalaglnglyvalalaphe859095serseralaargleuglyvallysalaleuilevalmetprothrala100105110thralaaspilelysvalaspalavalargglypheglyglygluval115120125leuleuhisglyalaasnpheaspglualalysalalysalaileglu130135140leuserglnglnglnglyphethrtrpvalpropropheasphispro145150155160metvalilealaglyglnglythrleualaleugluleuleuglngln165170175aspalahisleuaspargvalphevalprovalglyglyglyglyleu180185190alaalaglyvalalavalleuilelysglnleumetproglnilelys195200205valilealavalglualagluaspseralacysleulysalaalaleu210215220aspalaglyhisprovalaspleuproargvalglyleuphealaglu225230235240glyvalalavallysargileglyaspgluthrpheargleucysgln245250255glutyrleuaspaspileilethrvalaspseraspalailecysala260265270alametlysaspleuphegluaspvalargalavalalagluproser275280285glyalaleualaleualaglymetlyslystyrilealaleuhisasn290295300ileargglygluargleualahisileleuserglyalaasnvalasn305310315320phehisglyleuargtyrvalsergluargcysgluleuglyglugln325330335argglualaleuleualavalthrileprogluglulysglyserphe340345350leulysphecysglnleuleuglyglyargservalthrglupheasn355360365tyrargphealaaspalalysasnalacysilephevalglyvalarg370375380leuserargglyleuglugluarglysgluileleuglnmetleuasn385390395400aspglyglytyrservalvalaspleuseraspaspglumetalalys405410415leuhisvalargtyrmetvalglyglyargproserhisproleugln420425430gluargleutyrserpheglupheprogluserproglyalaleuleu435440445argpheleuasnthrleuglythrtyrtrpasnileserleuphehis450455460tyrargserhisglythrasptyrglyargvalleualaalapheglu465470475480leuglyasphisgluproaspphegluthrargleuasngluleugly485490495tyraspcyshisaspgluthrasnasnproalapheargphepheleu500505510alagly<210>6<211>162<212>dna<213>人工序列<400>6caattccgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtat60cacgaggccctttcgtcttcacctcgagtccctatcagtgatagagattgacctccctat120cagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc162<210>7<211>16<212>prt<213>大腸桿菌<400>7metasnasnserthrlysphecyspheserargpheargthrglyasn151015<210>8<211>548<212>prt<213>大腸桿菌<400>8metasnglyalaglntrpvalvalhisalaleuargalaglnglyval151015asnthrvalpheglytyrproglyglyalailemetprovaltyrasp202530alaleutyraspglyglyvalgluhisleuleucysarghisglugln354045glyalaalametalaalaileglytyralaargalathrglylysthr505560glyvalcysilealathrserglyproglyalathrasnleuilethr65707580glyleualaaspalaleuleuaspserileprovalvalalailethr859095glyglnvalseralapropheileglythraspalapheglngluval100105110aspvalleuglyleuserleualacysthrlyshisserpheleuval115120125glnserleuglugluleuproargilemetalaglualapheaspval130135140alacysserglyargproglyprovalleuvalaspileprolysasp145150155160ileglnleualaserglyaspleugluprotrpphethrthrvalglu165170175asngluvalthrpheprohisalagluvalgluglnalaargglnmet180185190leualalysalaglnlysprometleutyrvalglyglyglyvalgly195200205metalaglnalavalproalaleuargglupheleualaalathrlys210215220metproalathrcysthrleulysglyleuglyalavalglualaasp225230235240tyrprotyrtyrleuglymetleuglymethisglythrlysalaala245250255asnphealavalglnglucysaspleuleuilealavalglyalaarg260265270pheaspaspargvalthrglylysleuasnthrphealaprohisala275280285servalilehismetaspileaspproalaglumetasnlysleuarg290295300glnalahisvalalaleuglnglyaspleuasnalaleuleuproala305310315320leuglnglnproleuasnileasnasptrpglnleuhiscysalagln325330335leuargaspgluhisalatrpargtyrasphisproglyaspalaile340345350tyralaproleuleuleulysglnleuserasparglysproalaasp355360365cysvalvalthrthraspvalglyglnhisglnmettrpalaalagln370375380hisilealahisthrargprogluasnpheilethrserserglyleu385390395400glythrmetglypheglyleuproalaalavalglyalaglnvalala405410415argproasnaspthrvalvalcysileserglyaspglyserphemet420425430metasnvalglngluleuglythrvallysarglysglnleuproleu435440445lysilevalleuleuaspasnglnargleuglymetvalargglntrp450455460glnglnleuphepheglngluargtyrsergluthrthrleuthrasp465470475480asnproasppheleumetleualaseralapheglyileproglygln485490495hisilethrarglysaspglnvalglualaalaleuaspthrmetleu500505510asnseraspglyprotyrleuleuhisvalserileaspgluleuglu515520525asnvaltrpproleuvalproproglyalaserasnserglumetleu530535540glulysleuser545<210>9<211>87<212>prt<213>大腸桿菌<400>9metmetglnhisglnvalasnvalseralaargpheasnprogluthr151015leugluargvalleuargvalvalarghisargglyphehisvalcys202530sermetasnmetalaalaalaseraspalaglnasnileasnileglu354045leuthrvalalaserproargservalaspleuleupheserglnleu505560asnlysleuvalaspvalalahisvalalailecysglnserthrthr65707580thrserglnglnileargala85<210>10<211>309<212>prt<213>大腸桿菌<400>10metthrthrlyslysalaasptyriletrppheasnglyglumetval151015argtrpgluaspalalysvalhisvalmetserhisalaleuhistyr202530glythrservalphegluglyileargcystyraspserhislysgly354045provalvalphearghisarggluhismetglnargleuhisaspser505560alalysiletyrargpheprovalserglnserileaspgluleumet65707580glualacysargaspvalilearglysasnasnleuthrseralatyr859095ileargproleuilephevalglyaspvalglymetglyvalasnpro100105110proalaglytyrserthraspvalileilealaalapheprotrpgly115120125alatyrleuglyalaglualaleugluglnglyileaspalametval130135140sersertrpasnargalaalaproasnthrileprothralaalalys145150155160alaglyglyasntyrleuserserleuleuvalglyserglualaarg165170175arghisglytyrglngluglyilealaleuaspvalasnglytyrile180185190sergluglyalaglygluasnleuphegluvallysaspglyvalleu195200205phethrproprophethrserseralaleuproglyilethrargasp210215220alaileilelysleualalysgluleuglyilegluvalargglugln225230235240valleuserarggluserleutyrleualaaspgluvalphemetser245250255glythralaalagluilethrprovalargservalaspglyilegln260265270valglygluglyargcysglyprovalthrlysargileglnglnala275280285phepheglyleuphethrglygluthrgluasplystrpglytrpleu290295300aspglnvalasngln305<210>11<211>616<212>prt<213>大腸桿菌<400>11metprolystyrargseralathrthrthrhisglyargasnmetala151015glyalaargalaleutrpargalathrglymetthraspalaaspphe202530glylysproileilealavalvalasnserphethrglnphevalpro354045glyhisvalhisleuargaspleuglylysleuvalalagluglnile505560glualaalaglyglyvalalalysglupheasnthrilealavalasp65707580aspglyilealametglyhisglyglymetleutyrserleuproser859095arggluleuilealaaspservalglutyrmetvalasnalahiscys100105110alaaspalametvalcysileserasncysasplysilethrprogly115120125metleumetalaserleuargleuasnileprovalilephevalser130135140glyglyprometglualaglylysthrlysleuseraspglnileile145150155160lysleuaspleuvalaspalametileglnglyalaaspprolysval165170175seraspserglnseraspglnvalgluargseralacysprothrcys180185190glysercysserglymetphethralaasnsermetasncysleuthr195200205glualaleuglyleuserglnproglyasnglyserleuleualathr210215220hisalaasparglysglnleupheleuasnalaglylysargileval225230235240gluleuthrlysargtyrtyrgluglnasnaspgluseralaleupro245250255argasnilealaserlysalaalaphegluasnalametthrleuasp260265270ilealametglyglyserthrasnthrvalleuhisleuleualaala275280285alaglnglualagluileaspphethrmetseraspileasplysleu290295300serarglysvalproglnleucyslysvalalaproserthrglnlys305310315320tyrhismetgluaspvalhisargalaglyglyvalileglyileleu325330335glygluleuaspargalaglyleuleuasnargaspvallysasnval340345350leuglyleuthrleuproglnthrleugluglntyraspvalmetleu355360365thrglnaspaspalavallysasnmetpheargalaglyproalagly370375380ileargthrthrglnalapheserglnaspcysargtrpaspthrleu385390395400aspaspaspargalaasnglycysileargserleugluhisalatyr405410415serlysaspglyglyleualavalleutyrglyasnphealagluasn420425430glycysilevallysthralaglyvalaspaspserileleulysphe435440445thrglyproalalysvaltyrgluserglnaspaspalavalgluala450455460ileleuglyglylysvalvalalaglyaspvalvalvalileargtyr465470475480gluglyprolysglyglyproglymetglnglumetleutyrprothr485490495serpheleulyssermetglyleuglylysalacysalaleuilethr500505510aspglyargpheserglyglythrserglyleuserileglyhisval515520525serproglualaalaserglyglyserileglyleuilegluaspgly530535540aspleuilealaileaspileproasnargglyileglnleuglnval545550555560seraspalagluleualaalaargargglualaglnaspalaarggly565570575asplysalatrpthrprolysasnarggluargglnvalserpheala580585590leuargalatyralaserleualathrseralaasplysglyalaval595600605argasplysserlysleuglygly610615當(dāng)前第1頁(yè)12