本發(fā)明涉及一種從魚(yú)類的精液分離多脫氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide；pdrn)的方法、根據(jù)所述方法而獲得的pdrn及其用途。

背景技術(shù)：

pdrn作為存在于生物體內(nèi)的組織再生活性物質(zhì)，由50個(gè)至2000個(gè)之間的堿基對(duì)結(jié)合成鏈狀的脫氧核苷酸聚合物(deoxyribonucleotidespolymers)的混合物構(gòu)成。所述pdrn在歐洲等地被許可為醫(yī)藥品，用于傷口治愈及美容。具體而言，當(dāng)將所述pdrn應(yīng)用于臨床時(shí)，表現(xiàn)出傷口治療時(shí)間縮短和正常組織化作用以及糖尿病性足部潰瘍的迅速傷口閉合作用，已知對(duì)痤瘡及褥瘡、傷口治愈、疤痕疾病、細(xì)絲紋、皮膚老化、日曬老化、改善皮膚彈力、整形手術(shù)后快速治愈、脫發(fā)、改善血液循環(huán)等有效。另外，所述pdrn具有親水性特性，不引起過(guò)敏反應(yīng)或體內(nèi)排異反應(yīng)，由于抗熱性，不因高溫滅菌而破壞，保持活性，因而非常容易應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中使用的醫(yī)藥品領(lǐng)域及化妝品領(lǐng)域等多樣的產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域。

作為利用所述pdrn的以往技術(shù)，專利文獻(xiàn)1(韓國(guó)公開(kāi)專利公報(bào)第10-2014-0030605號(hào))對(duì)將pdrn與牙齒一同構(gòu)成從而提高牙槽骨再生速度的牙槽骨再生用試劑盒(kit)進(jìn)行了記載，專利文獻(xiàn)2(韓國(guó)公開(kāi)專利公報(bào)第10-2015-0068647號(hào))對(duì)含有微?；痯drn的滴眼劑組合物進(jìn)行了記載，專利文獻(xiàn)3(韓國(guó)注冊(cè)專利公報(bào)第10-1590498號(hào))對(duì)包含蘆薈提取物及pdrn的化妝品組合物進(jìn)行了記載。

以往，pdrn主要是通過(guò)降低從鮭魚(yú)或鱒魚(yú)的精巢或精液分離的dna的分子量的過(guò)程而制造的，這種用于獲得pdrn的dna分離法是基于曾應(yīng)用于哺乳類等其它物種的技術(shù)發(fā)展而來(lái)的。具體而言，以往作為從魚(yú)類的組織分離dna的方法，一般使用包含使用苯酚和三氯甲烷的過(guò)程的dna分離方法。

例如，在非專利文獻(xiàn)1(taggart,j.b,.etal.,j.fishbiol.1992,40,963-65.)中，記載了使用苯酚/三氯甲烷/異戊醇(phenol/chloroform/isoamylalcohol)從鮭魚(yú)科魚(yú)類的骨骼肌、肝臟、鰭組織提取dna的方法。但是，所述方法存在如下問(wèn)題：即，為了回收dna，不僅需要過(guò)多的步驟和時(shí)間，而且存在使用有害于人體的苯酚和三氯甲烷。另外，所述方法需要使用昂貴的化學(xué)物質(zhì)或器具，因而在大量生產(chǎn)體制下，在費(fèi)用方面存在不夠有效的問(wèn)題。

作為解決這種問(wèn)題的以往方法，專利文獻(xiàn)4(韓國(guó)公開(kāi)專利公報(bào)第10-2009-0079413號(hào))記載有，在通過(guò)酶分解、滅菌及分子量降低工序而制造特定分子量范圍的dna聚合物片斷方面，在中性的ph下執(zhí)行酶分解工序，從而以更環(huán)保、安全的方法獲得dna聚合物片斷復(fù)合體。但是，即便是專利文獻(xiàn)4，其在分子量降低工序時(shí)，為了匹配ph而使用鹽酸和醋酸，因而不能說(shuō)是100％安全、環(huán)保的方法，另外，在獲得令人滿意的高純度dna聚合物片斷復(fù)合體方面也存在局限。

【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】

【專利文獻(xiàn)】

(專利文獻(xiàn)1)kr1020140030605a

(專利文獻(xiàn)2)kr1020150068647a

(專利文獻(xiàn)3)kr101590498b

(專利文獻(xiàn)4)kr1020090079413a

【非專利文獻(xiàn)】

(非專利文獻(xiàn)1)taggartj.b.etal.,j.fishbiol.1992,40,963-965.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明要提供一種從魚(yú)類的精液分離pdrn的方法，本發(fā)明使用蛋白質(zhì)分解酶及飽和氯化鈉代替諸如苯酚或三氯甲烷的有機(jī)溶劑來(lái)分離dna，作為所述dna的破碎方法，利用諸如超聲波分解法等的物理方法，從而以高效、低費(fèi)用且無(wú)毒性的安全的方法，從魚(yú)類的精液分離pdrn。

另外，本發(fā)明想要提供一種根據(jù)所述方法而獲得的高純度的pdrn及利用其制造的醫(yī)藥品及化妝品。

解決問(wèn)題的方案

為了解決如上所述的課題，本發(fā)明提供一種從魚(yú)類的精液分離pdrn的方法，包括：(1)將魚(yú)類的精液進(jìn)行第1次離心分離，獲取包含精液細(xì)胞的沉淀物的步驟；(2)將所述沉淀物添加于細(xì)胞溶解緩沖液，制造細(xì)胞溶解物后，使所述細(xì)胞溶解物消化的步驟；(3)將經(jīng)過(guò)所述(2)步驟的細(xì)胞溶解物進(jìn)行第2次離心分離，獲取上清液的步驟；(4)在根據(jù)所述(3)步驟而獲取的上清液中投入飽和氯化鈉水溶液并混合后，進(jìn)行第3次離心分離，獲取包含dna的上清液的步驟；(5)在根據(jù)所述(4)步驟而獲取的上清液中投入乙醇并使dna沉淀后，收集所述沉淀的dna并進(jìn)行干燥的步驟；及(6)將根據(jù)所述(5)步驟而獲得的dna用物理方法破碎，獲取多脫氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide；pdrn)的步驟。

所述魚(yú)類可以為鮭魚(yú)科魚(yú)類，優(yōu)選地可以為虹鱒魚(yú)。

在所述(2)步驟中，所述細(xì)胞溶解緩沖液可以包括選自由tris-hcl(三(羥甲基)氨基甲烷，tris-(hydroxymethyl)-aminomethane-hcl)、nacl及na2edta(乙二胺四乙酸二鈉，ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt)組成的組中的某一種或兩種以上。而且，在所述(2)步驟中，所述細(xì)胞溶解物的消化可以使用十二烷基硫酸鈉溶液、na2edta溶液及蛋白水解酶k溶液的混合溶液來(lái)執(zhí)行，可以在30～39℃下執(zhí)行12～20小時(shí)。

在所述(4)步驟中，所述上清液與所述飽和氯化鈉水溶液的投入比率可以為2:1至1:2的重量比。

借助于分光光度計(jì)測(cè)量的根據(jù)所述(5)步驟而獲取的dna的純度(260nm/280nm)可以為1.8～2.2。可以還包括：將根據(jù)所述(5)步驟而獲得的干燥dna溶解于去離子水后，進(jìn)行凍結(jié)干燥的步驟。

在所述(6)步驟中，所述物理方法可以為超聲波分解法。

優(yōu)選地，所述(6)步驟可以包括：(i)將根據(jù)所述(5)步驟而獲得的dna溶解于選自由脫鹽水、食鹽水(0.9％nacl)及磷酸鹽緩沖食鹽水組成的組中的某一種或兩種以上的混合溶液，制造dna溶液的步驟；及(ii)將所述dna溶液進(jìn)行超聲波分解的步驟，此時(shí)的所述dna溶液的濃度可以為2～10mg/ml。

在所述(6)步驟中，優(yōu)選地，根據(jù)所述(i)步驟而制造的dna溶液是在1～5℃下培養(yǎng)2～4小時(shí)后，進(jìn)入所述(ii)步驟；所述超聲波分解在以所述dna溶液的濃度10mg/ml為基準(zhǔn)時(shí)，可以在1～5℃下執(zhí)行5～30分鐘。

另外，本發(fā)明的從魚(yú)類的精液分離pdrn的方法可以還包括：將根據(jù)所述(6)步驟而獲得的pdrn通過(guò)精密過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾的步驟；將通過(guò)所述過(guò)濾膜的pdrn進(jìn)行凍結(jié)干燥的步驟；及將所述凍結(jié)干燥的pdrn溶解于食鹽水的步驟。

另一方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)所述方法從魚(yú)類的精液分離的pdrn及利用所述pdrn而制造的醫(yī)藥品或化妝品。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明，在從魚(yú)類的精液分離dna的過(guò)程中，代替諸如苯酚或三氯甲烷的有機(jī)溶劑，而使用蛋白質(zhì)分解酶及飽和氯化鈉，將獲取的dna用諸如超聲波分解法等物理方法破碎并進(jìn)行低分子量化，從而能夠以高效、低費(fèi)用且無(wú)毒性的100％安全、環(huán)保的方法來(lái)提供pdrn。

另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供高純度的pdrn，所述pdrn能夠用于醫(yī)藥品及化妝品等多樣的用途。

附圖說(shuō)明

圖1比較圖示了根據(jù)實(shí)施例準(zhǔn)備的虹鱒魚(yú)的精液照片(a)及對(duì)所述精液進(jìn)行第1次離心分離后的照片(b)，以及對(duì)第1次離心分離后獲取的沉淀物進(jìn)行凍結(jié)干燥的照片(c)。

圖2比較圖示了根據(jù)實(shí)施例獲得的dna(a)及pdrn(b)的照片。

圖3比較圖示了根據(jù)實(shí)施例(a)及對(duì)比例(b)準(zhǔn)備的dna的電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4比較圖示了根據(jù)實(shí)施例獲得的dna(a)及pdrn(b)的電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖5是顯示根據(jù)實(shí)施例獲得的dna的不同波長(zhǎng)下吸光度的圖表。

圖6是顯示根據(jù)實(shí)施例獲得的pdrn的不同波長(zhǎng)下吸光度的圖表。

圖7是顯示根據(jù)實(shí)施例獲得的pdrn的ft-ir分析結(jié)果的圖表。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及一種從魚(yú)類的精液分離pdrn的方法、根據(jù)所述方法而獲得的pdrn及其用途，所述方法包括：(1)將魚(yú)類的精液進(jìn)行第1次離心分離，獲取包含精液細(xì)胞的沉淀物的步驟；(2)將所述沉淀物添加于細(xì)胞溶解緩沖液，制造細(xì)胞溶解物后，使所述細(xì)胞溶解物消化的步驟；(3)將經(jīng)過(guò)所述(2)步驟的細(xì)胞溶解物進(jìn)行第2次離心分離，獲取上清液的步驟；(4)在根據(jù)所述(3)步驟而獲取的上清液中投入飽和氯化鈉水溶液并混合后，進(jìn)行第3次離心分離，獲取包含dna的上清液的步驟；(5)在根據(jù)所述(4)步驟而獲取的上清液中投入乙醇而使dna沉淀后，收集所述沉淀的dna，并進(jìn)行干燥的步驟；及(6)將根據(jù)所述(5)步驟而獲得的dna用物理方法進(jìn)行破碎，獲取多脫氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide；pdrn)的步驟。

本發(fā)明中使用的魚(yú)類可以為鮭魚(yú)科魚(yú)類。例如，作為所述鮭魚(yú)科魚(yú)類，可以使用鮭魚(yú)、鱒魚(yú)、虹鱒魚(yú)等，更優(yōu)選地，可以使用虹鱒魚(yú)。

所述虹鱒魚(yú)作為屬于鮭魚(yú)目鮭魚(yú)科的淡水魚(yú)，不同于作為回游性魚(yú)種的鮭魚(yú)及鱒魚(yú)，基本上在淡水中度過(guò)一生的河流留滯型魚(yú)，因而具有在國(guó)內(nèi)容易調(diào)配的優(yōu)點(diǎn)。另外，當(dāng)利用虹鱒魚(yú)時(shí)，與現(xiàn)有的從鮭魚(yú)或鱒魚(yú)提取dna的方法相比，僅用少量的化學(xué)物質(zhì)便能夠從精液分離dna，在dna分離過(guò)程中也不使用有機(jī)溶劑，因而是優(yōu)選的。而且，從虹鱒魚(yú)分離的dna可以借助于諸如超聲波分解的物理方法而容易地從pdrn分離，能夠以100％安全、環(huán)保的方法獲得高純度的pdrn。

下面按步驟說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施形態(tài)的從魚(yú)類的精液分離pdrn的方法。

(1)第1次離心分離步驟

該步驟是將魚(yú)類的精液進(jìn)行第1次離心分離，獲取包含精液細(xì)胞的沉淀物的步驟。

具體而言，如果查看獲取包含所述精液細(xì)胞的沉淀物的過(guò)程的一個(gè)示例，該過(guò)程可以包括：(i)從去除了血液及異物的魚(yú)類的成熟的魚(yú)收集精液的步驟；及(ii)將所述精液以3,000～4,000rpm速度在2～6℃下第1次離心分離10～60分鐘，獲取包含精液細(xì)胞的沉淀物的步驟；(ⅲ)將所述沉淀物在-80℃的溫度下冷凍存儲(chǔ)的步驟；然后，可以經(jīng)過(guò)解凍過(guò)程進(jìn)行下述的(2)步驟。

如果查看獲取包含所述精液細(xì)胞的沉淀物的另一示例，先采取并立即冷凍存儲(chǔ)根據(jù)所述(i)而收集的精液，然后解凍后經(jīng)過(guò)如所述(ii)記載的第1次離心分離過(guò)程，可以獲取包含精液細(xì)胞的沉淀物，在該情況下獲取的沉淀物可以直接進(jìn)入下述(2)步驟。

此時(shí)，所述沉淀物或精液的冷凍可以是利用了液態(tài)氮的急速冷凍，優(yōu)選地，它們的解凍在冰上慢慢地進(jìn)行。而且，所述第1次離心分離速度和時(shí)間可以因精液的容量而不同。

另一方面，在圖1中圖示了虹鱒魚(yú)的精液照片(a)及將所述精液進(jìn)行第1次離心分離后的照片(b)，如果查看所述圖1的(b)，第1次離心分離后，在上部確認(rèn)了透明的上清液，在下部觀察到包含精液細(xì)胞的沉淀物。而且，圖1的(c)圖示了將所述沉淀物進(jìn)行凍結(jié)干燥后的照片。

在該步驟中，丟棄所述第1次離心分離后上清液，獲取沉淀物并進(jìn)入下個(gè)步驟。

(2)細(xì)胞溶解物制造及消化步驟

該步驟是將根據(jù)所述(1)步驟而獲得的沉淀物添加于細(xì)胞溶解緩沖液并制造細(xì)胞溶解物后，使所述細(xì)胞溶解物消化的步驟。

所述細(xì)胞溶解緩沖液是用于溶解所述精液細(xì)胞為目的的液體，可以使用選自由tris-hcl、nacl及na2edta(ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt)組成的組中的某一種或兩種以上，優(yōu)選地，可以包括調(diào)節(jié)精液細(xì)胞溶解物的酸性和滲透性的tris-hcl和na2edta。其中，所謂細(xì)胞溶解(celllysis)，是指因細(xì)胞分解而破裂細(xì)胞膜的同時(shí)，露出細(xì)胞內(nèi)容物的現(xiàn)象。

另外，使所述細(xì)胞溶解物消化的過(guò)程，是破壞細(xì)胞和核膜而幫助dna能夠從精液細(xì)胞分離的過(guò)程。所述細(xì)胞溶解物的消化可以使用十二烷基硫酸鈉溶液、na2edta溶液及蛋白水解酶k(proteinasek)溶液的混合溶液來(lái)執(zhí)行。在所述精液細(xì)胞中存在無(wú)數(shù)多被污染的蛋白質(zhì)，作為絲氨酸蛋白質(zhì)分解酶的所述蛋白水解酶k在從所述精液細(xì)胞分離dna的過(guò)程中用于消化所述被污染的蛋白質(zhì)成分而使用。另外，在細(xì)胞內(nèi)存在核酸酶(分解核酸的酶)的可能性，而通過(guò)添加所述蛋白水解酶k，對(duì)這種核酸酶進(jìn)行分解，保護(hù)核酸不受核酸酶的攻擊。而且，蛋白水解酶k在廣泛的ph范圍內(nèi)顯示出穩(wěn)定性。因此，當(dāng)存在使蛋白質(zhì)變性的化學(xué)物質(zhì)時(shí)蛋白水解酶k活躍地進(jìn)行作用，因而可以說(shuō)非常適合本過(guò)程。即，蛋白水解酶k在分離未損傷的dna方面，可以說(shuō)非常有用。

優(yōu)選地，這種細(xì)胞溶解物的消化在30℃～39℃下執(zhí)行12～20小時(shí)，更優(yōu)選地，可以在37℃下執(zhí)行18小時(shí)。在超出所述溫度及時(shí)間范圍的情況下，蛋白水解酶k的活性下降，存在細(xì)胞溶解物消化過(guò)程無(wú)法順利執(zhí)行的憂慮。

(3)第2次離心分離步驟

該步驟是將經(jīng)過(guò)所述(2)步驟的細(xì)胞溶解物進(jìn)行第2次離心分離，獲取上清液的步驟。

所述第2次離心分離速度、溫度及時(shí)間可以根據(jù)所述細(xì)胞溶解物的容量而不同地應(yīng)用，但優(yōu)選地可以以11,000～15,000rpm的速度，在室溫(roomtemperature)下執(zhí)行30分鐘～2小時(shí)。通過(guò)經(jīng)過(guò)這種第2次離心分離過(guò)程，細(xì)胞溶解物內(nèi)的dna包含于上清液中，蛋白質(zhì)下沉到下部的沉淀物。此時(shí)，丟棄所述沉淀物，獲取上清液，進(jìn)入下個(gè)步驟。

(4)第3次離心分離步驟

該步驟是在根據(jù)所述(3)步驟而獲取的上清液中投入飽和氯化鈉水溶液并混合后，進(jìn)行第3次離心分離，獲取包含dna的上清液的步驟。

所述飽和氯化鈉水溶液用于通過(guò)脫水和沉淀而析出所述上清液中包含的細(xì)胞性蛋白質(zhì)，去除所述(2)步驟及(3)步驟中未去除而剩有的蛋白質(zhì)，提高dna的純度。另外，當(dāng)如本過(guò)程所示利用飽和氯化鈉水溶液時(shí)，可以以低廉的費(fèi)用，迅速而安全地謀求蛋白質(zhì)的沉淀作用。所述上清液與飽和氯化鈉水溶液的投入比率可以為2:1至1:2的重量比，優(yōu)選地，可以為1:1的重量比。

所述第3次離心分離的速度、溫度及時(shí)間可以根據(jù)容量而不同地應(yīng)用，但優(yōu)選地，所述第3次離心分離可以以11,000～15,000rpm的速度，在室溫下執(zhí)行30分鐘～2小時(shí)。經(jīng)過(guò)這種第3次離心分離過(guò)程后，獲取含有遺傳基因dna的上清液，進(jìn)入下個(gè)步驟。

(5)dna的沉淀及干燥步驟

該步驟是在根據(jù)所述(4)步驟而獲取的上清液中投入乙醇而使dna沉淀后，收集所述沉淀的dna并進(jìn)行干燥的步驟。所述干燥可以使用空氣干燥方式，借助于所述干燥，從所述dna去除乙醇。

如此獲得的dna的純度(260/280比率)可以為1.8～2.2，更優(yōu)選地，可以為1.8～1.9。從所述“260/280比率”可以掌握獲取的dna的蛋白質(zhì)污染度，當(dāng)包含于所述“260/280比率”范圍時(shí)，蛋白質(zhì)污染度低，可以說(shuō)是高純度的dna。此時(shí)，所述dna的純度為利用分光光度計(jì)測(cè)量的值，表示將在260nm下測(cè)量的吸光度值除以在280nm下測(cè)量的吸光度值的值。

所述干燥的dna在溶解于去離子水后，在50～70℃下溶解2～6小時(shí)，接著，在30～40℃下再溶解3～9小時(shí)后，可以被凍結(jié)干燥。

(6)獲取pdrn的步驟

該步驟是用物理方法破碎根據(jù)所述(5)步驟而獲得的dna，獲取pdrn的步驟。

所述物理方法可以為超聲波分解法，優(yōu)選地，所述獲取pdrn步驟可以包括：(i)將根據(jù)所述(5)步驟而獲得的dna溶解于選自由脫鹽水、食鹽水(0.9％nacl)及磷酸鹽緩沖食鹽水組成的組中的某一種或兩種以上的混合溶液，制造dna溶液的步驟；及(ii)將所述dna溶液進(jìn)行超聲波分解的步驟。

此時(shí)，所述根據(jù)(i)步驟而獲得的dna溶液的濃度可以為2～10mg/ml，如此制造的dna溶液可以在1～5℃下培養(yǎng)2～4小時(shí)后，進(jìn)入所述(ii)步驟。

另外，在所述(ii)步驟中，當(dāng)超聲波分解以所述dna溶液10mg/ml為基準(zhǔn)時(shí)，可以在1～5℃下執(zhí)行5～30分鐘。

另一方面，本發(fā)明的從魚(yú)類的精液分離pdrn的方法可以還包括：將根據(jù)所述(6)步驟而獲得的pdrn通過(guò)精密過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾的步驟；將通過(guò)所述過(guò)濾膜的pdrn進(jìn)行凍結(jié)干燥的步驟；及將所述凍結(jié)干燥的pdrn溶解于食鹽水的步驟。此時(shí)，作為所述精密過(guò)濾膜，可以使用具有0.1～0.5μm大小孔隙的過(guò)濾膜。而且，所述食鹽水中溶解的pdrn可以以該狀態(tài)直接用于醫(yī)藥品或化妝品用途。

另外，本發(fā)明提供根據(jù)所述分離方法從魚(yú)類的精液分離的pdrn。由此提供的pdrn可以用于包括醫(yī)藥品或化妝品等的多樣用途。

下面通過(guò)列舉實(shí)施例更詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并非限定于實(shí)施例。

實(shí)施例

.<精液準(zhǔn)備工序>

首先，為了防止被小便和排泄物污染而準(zhǔn)備擦拭干凈的虹鱒魚(yú)的成熟的魚(yú)，在所述虹鱒魚(yú)的腹部施加輕柔的壓力，采集精液。接著，將采集的所述精液在4℃、3500rpm下進(jìn)行第1次離心分離30分鐘，獲取包含精液細(xì)胞的沉淀物后，將所述沉淀物在-80℃下冷凍保管。在圖1中，圖示了從所述鱒魚(yú)采集的精液(a)及第1次離心分離后的精液(b)照片，如果查看所述(b)，則可以確認(rèn)包含精液細(xì)胞的沉淀物與上清液分離的樣態(tài)。

將所述冷凍保管的沉淀物在冰中解凍2小時(shí)后，進(jìn)入作為下個(gè)步驟的dna分離工序。

<從虹鱒魚(yú)精液分離dna的工序>

將所述解凍的沉淀物100mg(鮮重)投入盛有細(xì)胞溶解緩沖劑(10mmtris-hcl,400nmnacl,2mmna2edta(ph8.2))12ml的50ml容量的離心分離器管，制作了細(xì)胞溶解物。接著，所述細(xì)胞溶解物的消化，在1.5％的十二烷基硫酸鈉與na2edta溶液內(nèi)使用蛋白水解酶k溶液(2mg/2ml)，在37℃下進(jìn)行18小時(shí)。

將完成所述消化過(guò)程的細(xì)胞溶解物以13,000rpm在室溫下進(jìn)行第2次離心分離1小時(shí)，獲取其上清液。

將借助于所述第2次離心分離而獲取的上清液10ml投入另外的離心分離管，在其中添加飽和氯化鈉(6m)10ml，攪拌5分鐘來(lái)進(jìn)行混合。將這樣混合的混合物以13,000rpm速度，在室溫下進(jìn)行第3次離心分離1小時(shí)，獲取其上清液。

將借助于所述第3次離心分離而獲取的上清液10ml投入新的50ml容量的圓錐形離心分離管，在其中添加純乙醇10ml進(jìn)行混合。此時(shí)，所述離心分離管倒置，直到dna從所述上清液沉淀時(shí)為止。用移液器收集作為結(jié)果物而獲得的dna鏈后，為了去除所述收集的dna中剩有的乙醇而進(jìn)行了空氣干燥。如此獲得的干燥dna圖示于圖2的(a)中。

<從虹鱒魚(yú)精液分離的dna的破碎工序>

將干燥的所述dna50mg溶解于食鹽水(0.9％nacl)5ml，制造了dna溶液。此時(shí)，dna溶液在4℃下，按每5分鐘間隔，打漩(vertexing)所述溶液，培養(yǎng)3小時(shí)。

接著，將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)過(guò)程的dna溶液在4℃下，利用超聲波分解儀(q700,qsonicausa)，進(jìn)行超聲波分解10分鐘，破碎所述溶液內(nèi)的dna。然后，將破碎的dna通過(guò)具有0.2μm空隙大小的精密過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾后，進(jìn)行凍結(jié)干燥。于是，獲得了作為獲得物的干燥pdrn。如此獲得的pdrn的照片圖示于圖2的(b)中。

對(duì)比例

通過(guò)購(gòu)買(mǎi)并準(zhǔn)備了鮭魚(yú)dna(deoxyribonucleicacidsodiumsaltfromsalmontestesd1626,sigma-aldrich)。

<評(píng)價(jià)方法>

1.瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

為了確認(rèn)dna及pdrn的大小(分子量)，利用相對(duì)于它們的濃度為1％的瓊脂糖凝膠實(shí)施了電泳實(shí)驗(yàn)。

首先，將根據(jù)所述實(shí)施例及對(duì)比例而準(zhǔn)備的干燥dna分別投入至去離子水中，加熱到60℃，溶解4小時(shí)后，在37℃下再溶解4小時(shí)，制造了dna溶液，利用所述dna溶液進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，將其結(jié)果圖示于圖3中。

如果查看所述圖3，可以確認(rèn)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的從虹鱒魚(yú)分離的dna(a)具有與從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的鮭魚(yú)的dna(b)類似的dna大小(分子量)。

接著，以與上述相同的方法，利用根據(jù)實(shí)施例而制造的干燥dna，制造dna溶液，將根據(jù)實(shí)施例而制造的干燥pdrn溶解于食鹽水(0.9％nacl)，制造了pdrn溶液，利用這些溶液進(jìn)行了電泳實(shí)驗(yàn)，將其結(jié)果圖示于圖4中。

如果查看所述圖4，就pnrn而言，顯示其分子量比dna顯著地低，從而可知借助于超聲波粉碎，dna被破碎而獲得了低分子量化的pdrn。

2.利用分光光度法的dna及pdrn分析

根據(jù)所述評(píng)價(jià)方法1.，將從實(shí)施例的dna及pdrn制造的dna溶液及pdrn溶液盛裝于微量比色皿(cuvette)，利用分光光度計(jì)(optizennanohandler,optizonbiokorea)，測(cè)量了不同波長(zhǎng)下的吸光度，在圖5及6中圖示了顯示其結(jié)果的圖表。

而且，利用通過(guò)所述圖表而獲得的值，計(jì)算了dna及pdrn的純度。所述純度是以根據(jù)下述式(1)計(jì)算的值來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)的，其結(jié)果值記載于圖5及6中。

純度＝260nm下的吸光度/280nm下的吸光度…(1)

如果查看圖5，dna的純度(260/280)計(jì)算為1.86，如果查看圖6，pdrn的純度(260/280)計(jì)算為1.88，可以確認(rèn)兩者均表現(xiàn)出高純度。這證明了實(shí)施例可以提供蛋白質(zhì)污染度低的高純度dna及pdrn。

此外，對(duì)根據(jù)實(shí)施例從虹鱒魚(yú)分離的pdrn實(shí)施紫外線分光(fouriertransforminfraredspectroscopy；ft-ir)分析，在圖7中圖示了顯示其結(jié)果的圖表。

以上本發(fā)明中公開(kāi)的實(shí)施例并非用于限定本發(fā)明的技術(shù)思想而是用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想，本發(fā)明的權(quán)利范圍應(yīng)根據(jù)下面的權(quán)利要求書(shū)進(jìn)行解釋，在與其同等范圍內(nèi)的所有技術(shù)思想應(yīng)解釋為包含于本發(fā)明的權(quán)利范圍。