本發(fā)明涉及一種海洋紅酵母，尤其涉及一種斯魯菲亞紅酵母固定化膠球及其制備方法，屬于固定化微生物技術(shù)。

背景技術(shù)：

20世紀(jì)末，污水處理行業(yè)興起了一項(xiàng)新技術(shù)-固定化微生物技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)通過采用吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法等方法固定有益菌或藻類，使其定位在某一個(gè)空間范圍內(nèi)，并保留其原有的活性，以達(dá)到有效處理廢水中n、p等物質(zhì)的效果。且此技術(shù)還具有強(qiáng)可控性、強(qiáng)重復(fù)性、長作用時(shí)間、利用率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用生產(chǎn)生活，尤其是造紙業(yè)、化工業(yè)以及生活污水處理等方面。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用效果也不同反響。

當(dāng)前，固定化微生物技術(shù)的固定化材質(zhì)一般采用海藻酸鈉(sa)、瓊脂、明膠、聚乙烯醇(pva)和聚丙烯酰胺凝膠等。但是，瓊脂強(qiáng)度較差，聚丙烯酰胺凝膠對(duì)生物有毒性，明膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)密實(shí)，傳質(zhì)性能差。sa和pva相對(duì)于其他載體，凝膠機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)性能均較好，對(duì)生物無毒，且耐生物分解性良好，較為合適應(yīng)用為固定化細(xì)胞的載體。但單一的sa作為固定化細(xì)胞的載體，膠球機(jī)械強(qiáng)度較弱，不易成型，膠球容易破裂，穩(wěn)定性較差；單一的pva作為固定化細(xì)胞載體時(shí)，操作困難，成球性不高，且膠球太致密，傳質(zhì)性低于海藻酸鈉。因而，應(yīng)用pva和sa的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，使得pva和sa混合利用成為了固定化細(xì)胞載體的主要研究方向。而有研究表明在膠液中加入sio2可提高固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度及生物活性，可見應(yīng)用sio2優(yōu)化膠球制作工藝存在可行性。

斯魯菲亞紅酵母屬于海洋紅酵母，菌落在平板上顯粉紅色圓形，表面光滑、隆起、濕潤、不透明、邊緣整齊，易挑起，直徑3～5mm。酵母細(xì)胞呈橢圓形，直徑5μm左右，出芽生殖。富含氨基酸、不飽和脂肪酸以及類胡蘿卜素，且生物培養(yǎng)周期短，發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，應(yīng)用于輪蟲投喂中，可顯著提高輪蟲的必需氨基酸含量。另有研究表明，海洋紅酵母具有凈化中國對(duì)蝦育苗水環(huán)境作用?？梢?，斯魯菲亞紅酵母極有潛力作為微生物蛋白原或微生物制劑，但其通過固定化膠球發(fā)揮作用仍未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提出了一種制備方法簡(jiǎn)單、材料簡(jiǎn)單易得、膠球成型效率高的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法。

本發(fā)明的目的可通過下列技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法，所述制備方法主要包括以下步驟：

斯魯菲亞紅酵母菌懸液的制作：將斯魯菲亞紅酵母菌體與生理鹽水混合制成斯魯菲亞紅酵母菌懸液；和

固定化膠球膠液的制作：將聚乙烯醇、海藻酸鈉、二氧化硅、海水混合形成固定化膠球膠液；和

交聯(lián)劑的制作：將硼酸、氯化鈣混合形成交聯(lián)劑；

然后將上述斯魯菲亞紅酵母菌懸液與固定化膠球膠液混合得到混合液，混合液加入交聯(lián)劑中交聯(lián)得到斯魯菲亞紅酵母固定化膠球。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述混合液中斯魯菲亞紅酵母菌懸液與固定化膠球膠液的體積比為(10-40)：100。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述混合液與交聯(lián)劑的體積比為1：(5-10)。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述交聯(lián)的溫度為0-4℃，時(shí)間為12-24h。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述斯魯菲亞紅酵母菌懸液中斯魯菲亞紅酵母菌體的濃度為(4-9)×10⁸cfu/ml。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述斯魯菲亞紅酵母菌懸液的制作的過程中，生理鹽水經(jīng)滅菌處理。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述固定化膠球膠液中聚乙烯醇的濃度為7-10wt％，海藻酸鈉的濃度為1-2.5wt％，sio2的濃度為0.5-2wt％。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述交聯(lián)劑中硼酸的濃度為4-5wt％、氯化鈣的濃度為0.5-2wt％。

在上述的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法中，所述交聯(lián)劑的ph為6-7。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供上述斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制備方法制成的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球，所述斯魯菲亞紅酵母固定化膠球以聚乙烯醇-海藻酸鈉-二氧化硅為包埋固定化材料，包埋有斯魯菲亞紅酵母菌體。

本發(fā)明斯魯菲亞紅酵母固定化膠球以斯魯菲亞紅酵母為菌體，以聚乙烯醇-海藻酸鈉-二氧化硅為包埋固定化材料，通過添加二氧化硅提高膠球的機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)性，并且首次進(jìn)行了斯魯菲亞紅酵母膠球的制作，具有工藝簡(jiǎn)單、原料新穎的特點(diǎn)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明首次將斯魯菲亞紅酵母進(jìn)行固定化膠球制作，拓展了現(xiàn)有固定化藻菌選用的菌種，也為探究此種酵母固定化膠球應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

2.本發(fā)明將sio2應(yīng)用于固定化膠球的制作，有利的增強(qiáng)了膠球的傳質(zhì)性和使用壽命，并且比當(dāng)前改性原料-活性炭價(jià)格低廉，使用方便。

3.本發(fā)明制作方法簡(jiǎn)單，材料簡(jiǎn)單易得，膠球制作成型效率高，制得的膠球穩(wěn)定性好，使用壽命長，且生物活性較好，對(duì)氨氮和亞硝酸鹽氮的降解率可達(dá)90％以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3制成的固定化膠球的數(shù)碼照片；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3制成的固定化膠球橫截面電鏡圖。

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖說明對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

表1：斯魯菲亞紅酵母固定化膠球制作配方

實(shí)施例1：

斯魯菲亞紅酵母菌懸液的制作：從菌種斜面保存培養(yǎng)基上取2環(huán)斯魯菲亞紅酵母菌種接種到裝液量為80ml/500ml的三角錐形瓶中，30℃，160r/min培養(yǎng)24h形成種子培養(yǎng)基。再將種子培養(yǎng)基以6％的接種量接種到裝液80ml/500ml錐形瓶中，其它培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)48h，40000r/min離心獲得菌體，并用生理鹽水清洗、離心3遍，獲得菌體，并添加滅菌后的生理鹽水200ml，混勻制成斯魯菲亞紅酵母菌體的濃度為9×10⁸cfu/ml的菌懸液，備用。

固定化膠球膠液的制作：選取聚乙烯醇、海藻酸鈉作為基礎(chǔ)配方，另添加二氧化硅作為包埋材料，與過濾、滅菌后的自然海水混合成100ml膠液，置于100℃烘箱溶解過夜，混勻冷卻后制成濃度如表1中實(shí)施例1所示的固定化膠球膠液，待用。

交聯(lián)劑的制作：將硼酸溶液進(jìn)行高溫滅菌，待冷卻到室溫后，無菌添加入氯化鈣混合得到交聯(lián)劑，交聯(lián)劑中硼酸的濃度為4.5wt％、氯化鈣的濃度為1wt％。交聯(lián)劑使用前用碳酸鈉調(diào)節(jié)ph至6.7。

斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制作：按表1中實(shí)施例1所示，取斯魯菲亞海洋紅酵母菌懸液10ml與冷卻后的固定化膠球膠液100ml混合均勻得到混合液。采用24v小型蠕動(dòng)泵(蠕動(dòng)泵上裝有直徑3mm的硅膠管，硅膠管一段接有3mm的y型3通接頭勻速形成液滴)將混合液滴入600ml的交聯(lián)劑中，4℃交聯(lián)15h，得到斯魯菲亞紅酵母固定化膠球，用生理鹽水沖洗3遍，得到成品。

實(shí)施例2：

斯魯菲亞紅酵母菌懸液的制作：從菌種斜面保存培養(yǎng)基上取2環(huán)斯魯菲亞紅酵母菌種接種到裝液量為80ml/500ml的三角錐形瓶中，30℃，160r/min培養(yǎng)24h形成種子培養(yǎng)基。再將種子培養(yǎng)基以6％的接種量接種到裝液80ml/500ml錐形瓶中，其它培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)48h，40000r/min離心獲得菌體，并用生理鹽水清洗、離心3遍，獲得菌體，并添加滅菌后的生理鹽水200ml，混勻制成斯魯菲亞紅酵母菌體的濃度為9×10⁸cfu/ml的菌懸液，備用。

固定化膠球膠液的制作：選取聚乙烯醇、海藻酸鈉作為基礎(chǔ)配方，另添加二氧化硅作為包埋材料，與過濾、滅菌后的自然海水混合成100ml膠液，置于100℃烘箱溶解過夜，混勻冷卻后制成濃度如表1中實(shí)施例2所示的固定化膠球膠液，待用。

交聯(lián)劑的制作：將硼酸溶液進(jìn)行高溫滅菌，待冷卻到室溫后，無菌添加入氯化鈣混合得到交聯(lián)劑，交聯(lián)劑中硼酸的濃度為4.5wt％、氯化鈣的濃度為1wt％。交聯(lián)劑使用前用碳酸鈉調(diào)節(jié)ph至6.7。

斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制作：按表1中實(shí)施例2所示，取斯魯菲亞海洋紅酵母菌懸液10ml與冷卻后的固定化膠球膠液100ml混合均勻得到混合液。采用24v小型蠕動(dòng)泵(蠕動(dòng)泵上裝有直徑3mm的硅膠管，硅膠管一段接有3mm的y型3通接頭勻速形成液滴)將混合液滴入600ml的交聯(lián)劑中，4℃交聯(lián)15h，得到斯魯菲亞紅酵母固定化膠球，用生理鹽水沖洗3遍，得到成品。

實(shí)施例3：

斯魯菲亞紅酵母菌懸液的制作：從菌種斜面保存培養(yǎng)基上取2環(huán)斯魯菲亞紅酵母菌種接種到裝液量為80ml/500ml的三角錐形瓶中，30℃，160r/min培養(yǎng)24h形成種子培養(yǎng)基。再將種子培養(yǎng)基以6％的接種量接種到裝液80ml/500ml錐形瓶中，其它培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)48h，40000r/min離心獲得菌體，并用生理鹽水清洗、離心3遍，獲得菌體，并添加滅菌后的生理鹽水200ml，混勻制成斯魯菲亞紅酵母菌體的濃度為9×10⁸cfu/ml的菌懸液，備用。

固定化膠球膠液的制作：選取聚乙烯醇、海藻酸鈉作為基礎(chǔ)配方，另添加二氧化硅作為包埋材料，與過濾、滅菌后的自然海水混合成100ml膠液，置于100℃烘箱溶解過夜，混勻冷卻后制成濃度如表1中實(shí)施例3所示的固定化膠球膠液，待用。

交聯(lián)劑的制作：將硼酸溶液進(jìn)行高溫滅菌，待冷卻到室溫后，無菌添加入氯化鈣混合得到交聯(lián)劑，交聯(lián)劑中硼酸的濃度為4.5wt％、氯化鈣的濃度為1wt％。交聯(lián)劑使用前用碳酸鈉調(diào)節(jié)ph至6.7。

斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制作：按表1中實(shí)施例3所示，取斯魯菲亞海洋紅酵母菌懸液10ml與冷卻后的固定化膠球膠液100ml混合均勻得到混合液。采用24v小型蠕動(dòng)泵(蠕動(dòng)泵上裝有直徑3mm的硅膠管，硅膠管一段接有3mm的y型3通接頭勻速形成液滴)將混合液滴入600ml的交聯(lián)劑中，4℃交聯(lián)15h，得到斯魯菲亞紅酵母固定化膠球，用生理鹽水沖洗3遍，得到成品。

圖1為本實(shí)施例制成的固定化膠球的數(shù)碼照片，從圖1可知，本實(shí)施例制備得到的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球呈球形、無拖尾、形態(tài)良好、個(gè)體均勻。

圖2為本實(shí)施例制成的固定化膠球橫截面電鏡圖，從圖2可知，在2000倍電鏡下，本實(shí)施例制備得到的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球球體內(nèi)部有斯魯菲亞紅酵母存在，且存在孔道，可為斯魯菲亞紅酵母生長提供空間。

實(shí)施例4：

斯魯菲亞紅酵母菌懸液的制作：從菌種斜面保存培養(yǎng)基上取2環(huán)斯魯菲亞紅酵母菌種接種到裝液量為80ml/500ml的三角錐形瓶中，30℃，160r/min培養(yǎng)24h形成種子培養(yǎng)基。再將種子培養(yǎng)基以6％的接種量接種到裝液80ml/500ml錐形瓶中，其它培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)48h，40000r/min離心獲得菌體，并用生理鹽水清洗、離心3遍，獲得菌體，并添加滅菌后的生理鹽水200ml，混勻制成斯魯菲亞紅酵母菌體的濃度為9×10⁸cfu/ml的菌懸液，備用。

固定化膠球膠液的制作：選取聚乙烯醇、海藻酸鈉作為基礎(chǔ)配方，另添加二氧化硅作為包埋材料，與過濾、滅菌后的自然海水混合成100ml膠液，置于100℃烘箱溶解過夜，混勻冷卻后制成濃度如表1中實(shí)施例4所示的固定化膠球膠液，待用。

交聯(lián)劑的制作：將硼酸溶液進(jìn)行高溫滅菌，待冷卻到室溫后，無菌添加入氯化鈣混合得到交聯(lián)劑，交聯(lián)劑中硼酸的濃度為4.5wt％、氯化鈣的濃度為1wt％。交聯(lián)劑使用前用碳酸鈉調(diào)節(jié)ph至6.7。

斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制作：按表1中實(shí)施例4所示，取斯魯菲亞海洋紅酵母菌懸液10ml與冷卻后的固定化膠球膠液100ml混合均勻得到混合液。采用24v小型蠕動(dòng)泵(蠕動(dòng)泵上裝有直徑3mm的硅膠管，硅膠管一段接有3mm的y型3通接頭勻速形成液滴)將混合液滴入600ml的交聯(lián)劑中，4℃交聯(lián)15h，得到斯魯菲亞紅酵母固定化膠球，用生理鹽水沖洗3遍，得到成品。

實(shí)施例5：

斯魯菲亞紅酵母菌懸液的制作：從菌種斜面保存培養(yǎng)基上取2環(huán)斯魯菲亞紅酵母菌種接種到裝液量為80ml/500ml的三角錐形瓶中，30℃，160r/min培養(yǎng)24h形成種子培養(yǎng)基。再將種子培養(yǎng)基以6％的接種量接種到裝液80ml/500ml錐形瓶中，其它培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)48h，40000r/min離心獲得菌體，并用生理鹽水清洗、離心3遍，獲得菌體，并添加滅菌后的生理鹽水200ml，混勻制成斯魯菲亞紅酵母菌體的濃度為9×10⁸cfu/ml的菌懸液，備用。

固定化膠球膠液的制作：選取聚乙烯醇、海藻酸鈉作為基礎(chǔ)配方，另添加二氧化硅作為包埋材料，與過濾、滅菌后的自然海水混合成100ml膠液，置于100℃烘箱溶解過夜，混勻冷卻后制成濃度如表1中實(shí)施例5所示的固定化膠球膠液，待用。

交聯(lián)劑的制作：將硼酸溶液進(jìn)行高溫滅菌，待冷卻到室溫后，無菌添加入氯化鈣混合得到交聯(lián)劑，交聯(lián)劑中硼酸的濃度為4.5wt％、氯化鈣的濃度為1wt％。交聯(lián)劑使用前用碳酸鈉調(diào)節(jié)ph至6.7。

斯魯菲亞紅酵母固定化膠球的制作：按表1中實(shí)施例5所示，取斯魯菲亞海洋紅酵母菌懸液10ml與冷卻后的固定化膠球膠液100ml混合均勻得到混合液。采用24v小型蠕動(dòng)泵(蠕動(dòng)泵上裝有直徑3mm的硅膠管，硅膠管一段接有3mm的y型3通接頭勻速形成液滴)將混合液滴入600ml的交聯(lián)劑中，4℃交聯(lián)15h，得到斯魯菲亞紅酵母固定化膠球，用生理鹽水沖洗4遍，得到成品。

將本發(fā)明實(shí)施例1-5制成的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球進(jìn)行基本性狀測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如表2所示。

表2：基本性狀測(cè)試結(jié)果

對(duì)比例1：

對(duì)比例1與實(shí)施例3的區(qū)別僅在于，對(duì)比例1中固定化膠球膠液中的pva由等量sa代替。

對(duì)比例2：

對(duì)比例2與實(shí)施例3的區(qū)別僅在于，對(duì)比例2中固定化膠球膠液中的sa由等量pva代替。

對(duì)比例3：

對(duì)比例3與實(shí)施例3的區(qū)別僅在于，對(duì)比例3中固定化膠球膠液中的sio2由等量活性炭代替。

對(duì)比例4：

對(duì)比例4與實(shí)施例3的區(qū)別僅在于，對(duì)比例4中固定化膠球膠液中的sio2的濃度為0。

將本發(fā)明實(shí)施例1-5與對(duì)比例1-4制成的斯魯菲亞紅酵母固定化膠球進(jìn)行性能測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如表3所示。

表3：性能測(cè)試結(jié)果

在上述實(shí)施例及其替換方案中，交聯(lián)劑的體積還可以為550ml、650ml、700ml、750ml、800ml、850ml、900ml、950ml、1000ml、1100ml以及550-1100ml中的任意體積；交聯(lián)的溫度還可以為0℃、1℃、2℃、3℃以及0-4℃中的任意溫度；交聯(lián)的時(shí)間還可以為12h、13h、14h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h以及12-24h中的任意時(shí)間；交聯(lián)劑的ph還可以為6、6.3、6.5、6.8、7以及6-7中的任意ph值；交聯(lián)劑中硼酸的濃度還可以為4wt％、4.2wt％、4.8wt％、5wt％以及4-5wt％中的任意濃度值；交聯(lián)劑中的氯化鈣的濃度還可以為0.5wt％、0.8wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.8wt％、2wt％以及0.5-2wt％中的任意濃度值；斯魯菲亞紅酵母菌懸液中斯魯菲亞紅酵母菌體的濃度還可以為4×10⁸cfu/ml、5×10⁸cfu/ml、6×10⁸cfu/ml、7×10⁸cfu/ml、8×10⁸cfu/ml以及(4-9)×10⁸cfu/ml中的任意濃度。

鑒于本發(fā)明方案實(shí)施例眾多，各實(shí)施例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大眾多，不適合于此處逐一列舉說明，但是各實(shí)施例所需要驗(yàn)證的內(nèi)容和得到的最終結(jié)論均接近。故而此處不對(duì)各個(gè)實(shí)施例的驗(yàn)證內(nèi)容進(jìn)行逐一說明，僅以實(shí)施例1-5作為代表說明本發(fā)明申請(qǐng)優(yōu)異之處。

本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。

盡管對(duì)本發(fā)明已作出了詳細(xì)的說明并引證了一些具體實(shí)施例，但是對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。