本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株褐藻膠裂解酶基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)擁有廣闊的海域面積，其中蘊(yùn)含著豐富的海洋生物資源，尤其是海藻資源。褐藻主要包括海帶、裙帶等，其細(xì)胞壁中富含的褐藻膠是一種直鏈酸性多糖，在天然狀態(tài)下，褐藻膠的主要存在狀態(tài)為水溶性的褐藻酸鈉(sodiumalginate)、褐藻酸鉀等褐藻酸鹽類(lèi)和水不溶性的褐藻酸(alginicacid)。目前市場(chǎng)上的褐藻酸鈉(商品名為海藻酸鈉)或其他褐藻酸鹽主要是從褐藻中獲得。研究發(fā)現(xiàn)降解褐藻酸鈉所得到的寡糖具有多種生物活性，比如免疫調(diào)節(jié)、促生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物抗性和提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等，因而可廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加和醫(yī)藥等領(lǐng)域(劉航,天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2012,24:201-204)。褐藻酸鈉可用多種方法降解，包括化學(xué)降解法、物理降解法和酶降解法?；瘜W(xué)降解法以酸降解為主，但該方法降解條件難以控制，操作較復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。物理降解法包括輻射法和超聲法等，一般與其他降解法一起使用，降解產(chǎn)物的極限分子質(zhì)量為50kda左右，不易制得寡糖。而用褐藻膠裂解酶降解褐藻酸鈉具有降解條件溫和，得率高等優(yōu)點(diǎn)，且因?yàn)槊傅牡孜飳?zhuān)一性，能為后續(xù)研究寡糖化學(xué)結(jié)構(gòu)提供信息，故而褐藻膠裂解酶逐步成為優(yōu)先降解褐藻酸鈉的方法。另外，褐藻膠裂解酶還能應(yīng)用于肺囊腫性纖維化癥的治療、海藻飼料加工及海藻遺傳工程等領(lǐng)域的研究(wongtyetal.annualreviewofmicrobiology,2000,54:289-340)。

褐藻酸裂解酶來(lái)源于海洋動(dòng)植物和多種微生物(包括海洋細(xì)菌、土壤細(xì)菌和真菌)。褐藻酸鈉裂解酶按其底物專(zhuān)一性可分為兩大類(lèi)：1,4-d-甘露糖醛酸片段裂解酶(ec4.2.2.3)和1,4-l-古羅糖醛酸片段裂解酶(ec4.2.2.11)。至今，褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)大多依賴(lài)原始產(chǎn)酶動(dòng)植物或微生物來(lái)獲得酶蛋白，此種方法雖然能有效的獲得一定量的酶蛋白，但產(chǎn)量有限，成本較高，較難滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用需求。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，提供了利用基因工程高效生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的技術(shù)方法。dongeunkim等根據(jù)已知的相關(guān)功能基因的相似序列設(shè)計(jì)pcr引物，從streptomycessp.alg-5菌株中克隆到了一個(gè)褐藻膠裂解酶基因，并在escherichiacolibl21(de3)中成功表達(dá)(kimetal.marinebiotechnology.2009.11:10-16)。采用這一策略必須對(duì)相關(guān)基因序列有一定的了解才能設(shè)計(jì)pcr引物，并且找到的是某一類(lèi)結(jié)構(gòu)或功能相似蛋白質(zhì)中的新分子，較難發(fā)現(xiàn)全新的基因。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物基因組序列得以測(cè)定，這使得通過(guò)基因組挖掘技術(shù)來(lái)分析序列信息，對(duì)編碼褐藻膠裂解酶的基因進(jìn)行釣取變得簡(jiǎn)潔快速，badurah等對(duì)來(lái)源于海洋的一株細(xì)菌vibriosplendidus的基因組進(jìn)行序列測(cè)定，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)該菌株中含有4個(gè)編碼褐藻膠裂解酶的基因，對(duì)其進(jìn)行了基因克隆和在大腸桿菌escherichiacolibl21(de3)中的重組表達(dá)(baduretalappl.environ.microbiol.2015.81：1865-1873)；目前獲得褐藻膠裂解酶大多數(shù)是專(zhuān)一性降解均聚甘露糖醛酸的褐藻膠裂解酶，少數(shù)是具有具有降解古洛糖醛酸活性的褐藻膠裂解酶，而具有廣泛底物特異性的褐藻膠裂解酶則非常稀少，只有來(lái)源于pseudoalteromonassp.的褐藻膠裂解酶aly-sj02(李建偉,marinedrugs,2011,21:1374-80)，來(lái)源于白蟻腸道的isoptericolahalotolerans的褐藻膠裂解酶alyih(竇文芳等,carbohydratepolymers,2013,98:1476-82)等具有廣泛底物特異性的酶活力較低，而且穩(wěn)定性差，其中alyih只是獲得了純化的酶，尚未獲得其編碼基因，不能進(jìn)行重組表達(dá)和分子改造；而且大多數(shù)褐藻膠裂解酶活性較低。本發(fā)明涉及的重組褐藻膠裂解酶具有高活性和高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，其降解產(chǎn)物為低聚合度(主要是二糖、三糖和四糖)的褐藻膠寡糖，具有重大的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種新型褐藻膠裂解酶。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供包含上述褐藻膠裂解酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述褐藻膠裂解酶的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種褐藻膠裂解酶基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

一種褐藻膠裂解酶，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

包含上述褐藻膠裂解酶的基因工程菌，該菌株中導(dǎo)入了褐藻膠裂解酶基因，所述的褐藻膠裂解酶基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述產(chǎn)褐藻膠裂解酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將褐藻膠裂解酶基因克隆到質(zhì)粒中，得到重組載體；

(2)將重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌，得到產(chǎn)褐藻膠裂解酶的基因工程菌。

步驟(1)中，所述的質(zhì)粒為pet21a(+)。

步驟(2)中，所述的宿主菌為大腸桿菌dh5α。

上述褐藻膠裂解酶在裂解褐藻酸鹽和褐藻多糖中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

上述褐藻膠裂解酶的基因工程菌在發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

有益效果：

本發(fā)明的algl來(lái)源于海洋細(xì)菌vibriosp.nj-04，通過(guò)設(shè)計(jì)同源引物，獲得編碼褐藻膠裂解酶algl的dna序列，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)1359bp，編碼452個(gè)氨基酸，其中1-21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，理論分子量為50.19kda，屬于多糖裂解酶7家族。大腸桿菌重組表達(dá)獲得的algl，對(duì)于褐藻膠、polym和polyg均具有較高活性，屬于雙功能褐藻膠裂解酶。本發(fā)明的內(nèi)切型褐藻膠裂解酶可廣泛用于化工、農(nóng)業(yè)、食品和飼料添加、醫(yī)藥及海藻遺傳工程等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1：褐藻膠裂解酶algl的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。

圖2：重組褐藻膠裂解酶algl表達(dá)純化的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖(sds-page)。

圖3:溫度、ph對(duì)于褐藻膠裂解酶algl的活性及穩(wěn)定性影響曲線。

圖4：褐藻膠裂解酶降解褐藻膠、polym和polyg所得產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜(esi-ms)分析圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：菌株vibriosp.nj-04的培養(yǎng)及鑒定

所采用的菌株來(lái)源于采集自黃海海域的海藻樣品，經(jīng)分離得到一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株nj-04，使用的選擇性培養(yǎng)基的配方為：

牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉1.0g、nacl5.0g、mgso4·7h2o0.5g、cacl20.2g、kh2po41.0g、feso4·7h2o0.02g，ph值為7.0。固體培養(yǎng)基添加1.5％的瓊脂。

將菌落接入100ml液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，30℃，150rpm培養(yǎng)36h。將獲得的菌液進(jìn)行系列稀釋后涂布到固體選擇培養(yǎng)上取4ml已經(jīng)培養(yǎng)好的菌液，置于2mltube管中，5000g，10min充分離心。棄去上清，用180μl消化液(digestionsolution)將菌體重懸，再加入20μl蛋白酶k，充分混勻后，56℃溫育30min。加入20μlrnasea，充分混勻后，室溫放置10min。加入200μl裂解液(lysissolution)，快速混勻，過(guò)程不要超過(guò)15s。加入400μl50％(v/v)乙醇溶液，充分混勻。將上述溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，靜置1min，離心6000g，1min，棄廢液，將吸附柱轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的2mltube管中。加入500μlwashbufferi，8000g，1min離心，棄廢液。加入500μlwashbufferii，8000g，1min離心，棄廢液。重復(fù)一次。將空吸附柱12000g，3min離心，將柱內(nèi)殘留液體充分甩干。在吸附柱基質(zhì)膜中間位置加入200μl洗脫液(elutionbuffer)靜置1min，8000g，1min離心，即得基因組。

以提取的菌株基因組為模板，以細(xì)菌鑒定通用引物27f和1492r為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到16srdna基因全長(zhǎng)序列。pcr條件為：94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃30s、55℃30s、72℃2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳顯示在1.0kb和2.0kb之間有一條特異性條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下，采用dna凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化后，送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,序列見(jiàn)附錄。

實(shí)施例2：褐藻膠裂解酶algl編碼基因的克隆與鑒定

根據(jù)pl7家族褐藻膠裂解酶的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)如下擴(kuò)增引物：上游引物(5’-ggntcnaaywanaaraayta-3’)和下游引物(5’-ggnagyaaywanaaraayta’)。以提取的菌株基因組為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到褐藻膠裂解酶algl基因部分序列。

pcr條件為：94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃30s、55℃30s、72℃2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳顯示在1.0kb左右一條特異性條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下，采用dna凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

將純化的dna片段連接到克隆載體peasy-bluntzerocloningvector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，在lb固體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)中培養(yǎng)后，挑取白色菌落使用擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr驗(yàn)證。pcr條件為94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃30s、55℃30s、72℃2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。測(cè)序所得基因序列設(shè)計(jì)巢式pcr引物來(lái)按照上述條件來(lái)克隆褐藻膠裂解酶基因的全長(zhǎng)。將出現(xiàn)特異性條帶所對(duì)應(yīng)的重組菌株大量培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明褐藻膠裂解酶基因的全核苷酸序列全長(zhǎng)1359bp，核苷酸序列如seqidno.1所示；編碼452個(gè)氨基酸，氨基酸序列如seqidno.2所示，蛋白理論分子量為50.19kda。用phyre2同源建模服務(wù)器對(duì)褐藻膠裂解酶algl的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。最終得到的algl的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型如圖1所示。

seqidno.1：algl編碼基因開(kāi)放閱讀框(orf)全長(zhǎng)1359bp，編碼褐藻膠裂解酶的成熟酶序列，不含有信號(hào)肽序列。

seqidno.2：褐藻膠裂解酶algl結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)褐藻膠裂解酶家族2(alginatelyase2family)結(jié)構(gòu)域。

實(shí)施例3：褐藻膠裂解酶algl重組表達(dá)載體構(gòu)建。

根據(jù)褐藻膠裂解酶基因全序列設(shè)計(jì)上游引物(5’-gccatatgatgttattgaacaaaattattac-3’)和下游引物(5’-ggcctcgaggtaagaataatttgaatgtt-3’)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到褐藻膠裂解酶algl基因全長(zhǎng)序列。pcr條件為：94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃30s、55℃30s、72℃2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物用ndei和xhoi進(jìn)行酶切后回收；將大腸桿菌表達(dá)載體pet21a(+)同樣用ndei和xhoi進(jìn)行酶切后回收，將其與上述所得目的基因連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α中，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。用質(zhì)粒提取試劑盒抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，使用ndei和xhoi進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得到長(zhǎng)度分別為5.5kb和1.5kb左右兩個(gè)片段，證明褐藻膠裂解酶基因已經(jīng)克隆到表達(dá)載體pet21a(+)上，將此重組質(zhì)粒命名為pet21a-algl。

實(shí)施例4：褐藻膠裂解酶algl基因在大腸桿菌中的重組表達(dá)與純化制備。

將重組表達(dá)質(zhì)粒pet21a-algl轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株bl21(de3)(購(gòu)自美國(guó)novagen公司)，然后按照該公司提供的操作步驟進(jìn)行褐藻膠裂解酶algl誘導(dǎo)表達(dá)及純化。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)褐藻膠裂解酶algl的純化情況，結(jié)果如圖2所示，純化后的algl在電泳膠上呈現(xiàn)單一條帶，且位置與預(yù)測(cè)的分子量相吻合。

實(shí)施例5：褐藻膠裂解酶algl的酶學(xué)性質(zhì)分析。

1、ph和溫度對(duì)酶活性的影響

將質(zhì)量濃度為1％褐藻酸鈉底物、純化的algl酶液以及不同ph值的20mmtris-hcl、磷酸鹽、醋酸鹽緩沖液(ph范圍為2.0-11.0)按9:1:10(體積比)的比例混合后，在30℃反應(yīng)10分鐘，紫外吸收法測(cè)酶活力。結(jié)果顯示algl在ph8.0時(shí)達(dá)到最大活力，表明algl的最適反應(yīng)ph為4.0。在最適ph下，將質(zhì)量濃度為1％褐藻酸鈉底物、純化的algl酶液以及20mmtris-hcl緩沖液(ph7.0)按9:1:10(體積比)的比例混合，分別在不同溫度(20℃-70℃)反應(yīng)10分鐘，按紫外吸收法測(cè)酶活力。結(jié)果顯示algl在30℃時(shí)達(dá)到最大活力，表明algl的最適反應(yīng)溫度為30℃(如圖3-a,c)。

2、ph和溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將在不同溫度(20℃-80℃)下熱處理30min后的algl酶液與質(zhì)量濃度為1％褐藻酸鈉底物溶液按1:9(體積比)的比例混合，然后在最適溫度和最適ph下測(cè)定剩余酶活，以不經(jīng)過(guò)熱處理的酶液酶活定義為100％相對(duì)活力(relativieactivity)，結(jié)果表明algl在低于40℃的溫度下具有較好的熱穩(wěn)定性；將在30℃，不同的ph(ph4-10)預(yù)孵育24h后的algl酶液與質(zhì)量濃度為1％褐藻酸鈉底物溶液按1:9(體積比)的比例混合，然后在最適溫度和最適ph下測(cè)定剩余酶活，以不經(jīng)過(guò)ph處理的酶液酶活定義為100％相對(duì)活力(relativieactivity)，結(jié)果顯示在ph6～10的范圍內(nèi)，algl酶活仍保持70％以上，表明algl對(duì)ph值耐受范圍較廣(如圖3-b,d)。

3、algl的酶活性及動(dòng)力學(xué)

將純化的algl分別與質(zhì)量濃度為0.1％的褐藻酸鈉、聚甘露糖醛酸片段(polym)和聚古洛糖醛酸片段(polyg)三種不同底物按1:9(體積比)的比例混合，然后在30℃,ph7.0條件下反應(yīng)。取不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)物測(cè)其235nm紫外吸收值，發(fā)現(xiàn)隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，235nm吸收值逐漸增加，根據(jù)紫外法測(cè)褐藻膠裂解酶的原理(qing-daanetal.processbiochemistry,2008,43:842–847)，證實(shí)algl是裂解酶。另外，如圖4所示，algl對(duì)聚古洛糖醛酸片段、褐藻酸鈉和聚甘露糖醛酸片段的降解均具有較好的降解活性，表明algl是一個(gè)雙功能褐藻膠裂解酶。同時(shí)，該酶對(duì)于三種不同底物均具有較好的底物親和力。

表1.褐藻膠裂解酶algl的底物特異性及酶動(dòng)力學(xué)

實(shí)施例6：金屬離子對(duì)algl活性的影響

將質(zhì)量濃度為1％褐藻酸鈉底物、純化的algl酶液以及50mmtris-hcl緩沖液(ph7.0)按8:2:10(體積比)的比例混合，接著向反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子，添加的離子終濃度為1mm和5mm，然后在30℃反應(yīng)10分鐘，按前述的紫外吸收法測(cè)酶活力。對(duì)照組為不加任何金屬離子時(shí)algl的活性(設(shè)定為100％)，結(jié)果如下表所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mg²⁺、co²⁺能增加algl活性，cu²⁺、zn²⁺等其他離子對(duì)酶活呈現(xiàn)抑制作用。

表2.金屬離子對(duì)于algl酶活性的影響

實(shí)施例7：褐藻膠裂解酶algl對(duì)三種底物的降解產(chǎn)物的esi-ms分析。

將質(zhì)量濃度為0.1％底物(褐藻酸鈉、polym和polyg)、純化的algl酶液以及50mmtris-hcl緩沖液按9:1:10(體積比)的比例混合后，在ph7.0，30℃條件下反應(yīng)，對(duì)酶解72小時(shí)后的產(chǎn)物進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析。電噴霧質(zhì)譜條件為采用正離子模式，離子源電壓：4.5kv；鞘氣流速：30arb；毛細(xì)管溫度：275～300℃；管鏡電壓：250v；掃描范圍：150-2000。如圖4所示。

序列表

<110>五洲豐農(nóng)業(yè)科技有限公司

<120>一種褐藻膠裂解酶及其應(yīng)用

<130>sg20160919001

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>903

<212>dna

<213>弧菌（vibriosp.nj-04）褐藻膠裂解酶algl核苷酸序列

<400>1

1atgttattgaacaaaattattactacatctgccatcgccatttttagttcattttcaatggccgatacactgccgatcctagaagcaacggattggggga

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