本發(fā)明屬于適體領(lǐng)域，具體涉及特異結(jié)合ANXA2的核酸適體，還涉及該適體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2, ANXA2）是由339個(gè)氨基酸組成的分子量為36 kDa的蛋白質(zhì), 是一種Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，在細(xì)胞中可以單體(p36)、異源二聚體(p36/p11)和異源四聚體(p362/p112)三種形式存在。它在結(jié)構(gòu)上高度保守并且在幾乎所有真核生物中表達(dá)，主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中，一小部分存在于細(xì)胞核中。ANXA2 主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞；在腦癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌以及血液腫瘤中表達(dá)上調(diào)。ANXA2在腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。ANXA2在高侵襲、高轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤中的異常表達(dá)，提示ANXA2有望成為判斷腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移能力及腫瘤病人預(yù)后的標(biāo)志物，可作為腫瘤治療潛在的靶分子，該核酸適體可用于腫瘤早期檢測及治療。

目前，ANXA2的檢測方法主要有免疫組化法，酶聯(lián)免疫法等免疫學(xué)檢測法。依賴抗體的免疫學(xué)檢測法操作簡單，靈敏度高，無需大型昂貴儀器設(shè)備，適用于大量樣品的檢測，但是這種方法檢測的假陽性率比較高，定量也不夠準(zhǔn)確。并且抗體試劑穩(wěn)定性差，儲存條件較DNA核酸適體嚴(yán)格。核酸適體能與各種有機(jī)物或無機(jī)物靶標(biāo)分子高特異性、高親和力結(jié)合，同時(shí)具有分子量小，免疫原性低，穩(wěn)定性好，制備和標(biāo)記方便等優(yōu)點(diǎn)。核酸適體作為抗體分子的替代分子，在疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用。但迄今尚無針對ANXA2的DNA核酸適體報(bào)道或公開，因此有必要開發(fā)一種可特異結(jié)合ANXA2的核酸適體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供特異結(jié)合并作用ANXA2的核酸適體。

本發(fā)明人通過采用消減篩選的策略，利用GST-ANXA2融合蛋白作為篩選靶標(biāo)，獲得與融合蛋白結(jié)合的DNA序列，進(jìn)一步通過將GST蛋白作為負(fù)性篩選，將與GST蛋白結(jié)合的DNA序列去掉，獲得與ANXA2蛋白特異結(jié)合的核酸適體，通過篩選獲得了一條特異結(jié)合ANXA2的核酸適體（命名為wh6）。所述核酸適體的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明提供所述特異結(jié)合ANXA2的核酸適體在制備檢測ANXA2試劑中的應(yīng)用。通過將ANXA2蛋白與酶標(biāo)板結(jié)合，然后利用生物素標(biāo)記的wh6核酸適體孵育結(jié)合；PBS洗板后，加入過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素孵育，加入過氧化物酶的底物顯色，通過酶標(biāo)儀檢測并計(jì)算ANXA2的濃度。

本發(fā)明提供所述特異結(jié)合ANXA2的核酸適體在純化和濃縮ANXA2中的應(yīng)用。ANXA2蛋白與生物素標(biāo)記的wh6核酸適體結(jié)合，然后加入鏈霉親和素磁珠孵育，通過磁珠可將ANXA2純化和濃縮。

本發(fā)明提供特異結(jié)合ANXA2的核酸適體在制備靶向ANXA2藥物中的應(yīng)用。細(xì)胞膜表面的ANXA2蛋白能與多種蛋白結(jié)合發(fā)揮其生理作用，wh6能與ANXA2蛋白結(jié)合，可能阻斷ANXA2蛋白與其它蛋白的相互作用，其功能表現(xiàn)為wh6阻斷ANXA2蛋白促進(jìn)MM.1S和RMPI-8226細(xì)胞的生長，wh6能抑制MM1.S和RPMI-8226細(xì)胞對ANXA2蛋白的粘附作用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明公開了特異結(jié)合ANXA2的核酸適體，該核酸適體能夠與ANXA2特異性結(jié)合，為ANXA2純化和濃縮，靶向ANXA2的藥物以及定量或定性檢測ANXA2提供了靶分子，同時(shí)為檢測血清中ANXA2的水平，反映機(jī)體腫瘤負(fù)荷狀態(tài)提供了工具，也為臨床選擇最佳的治療方案提供了策略，為觀察治療效果和判斷預(yù)后提供幫助。

附圖說明

圖1. wh6核酸適體的二級結(jié)構(gòu)；

圖2.采用Western blot方法檢測不同多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株ANXA2蛋白的表達(dá)情況；

圖3.采用流式細(xì)胞儀檢測低表達(dá)ANXA2和高表達(dá)ANXA2多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株與wh6的結(jié)合；

圖4.Western blot檢測shRNA敲低ANBL-6細(xì)胞中ANXA2的表達(dá)；

圖5.流式細(xì)胞儀檢測敲低ANXA2后ANBL-6細(xì)胞與wh6的結(jié)合；

圖6.Aptamer-pull down實(shí)驗(yàn)檢測wh6與ANXA2蛋白結(jié)合；

圖7. wh6抑制ANXA2刺激MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞的生長；

圖8. wh6抑制HS-5細(xì)胞刺激MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞的生長；

圖9. wh6抑制MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞與ANXA2蛋白的粘附；

圖10. 體內(nèi)觀測荷瘤小鼠尾靜脈注射Cy5-wh6和Cy5-DNA-lib文庫的活體成像圖；

圖11. 荷瘤小鼠尾靜脈注射Cy5-wh6和Cy5-DNA-lib文庫的器官熒光成像圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

合成長度為80 nt的核苷酸文庫序列（上海生工生物工程（上海）股份有限公司），具體序列如下：5'-ACCGAC CGT GCT GGA CTC A (N)42 A CTA TGA GCGAGC CTG GCG-3'，兩端為固定序列，本文庫中間42N代表42個(gè)隨機(jī)堿基，可保證其庫容量大約為10¹⁴，足夠大庫容量可形成不同的三維空間結(jié)構(gòu)，從而保證具有與靶標(biāo)結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)的序列存在，并在后面的篩選過程中篩選出來，庫的序列為P80 ss庫。然后將隨機(jī)寡聚ssDNA文庫用如下引物進(jìn)行擴(kuò)增：

P80-SF：5'-FAM-ACC GACCGT GCT GGA CTC A-3' （SEQ ID NO.1）

P80-AP: 5'-biotin-CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3' （SEQ ID NO.2）

隨機(jī)ssDNA文庫（首輪篩選量為5000 pmol，相當(dāng)于4個(gè)OD隨機(jī)庫）用1mL 1×選擇緩沖液溶解于EP管中（1%BSA包被，4℃封閉過夜），95℃變性10 min，變性后立即置于0℃放置10 min?；靹虬涣薌ST蛋白的磁珠溶液，取100 μL置于BSA包被的EP管中，用150 μL結(jié)合緩沖液洗滌3次。ssDNA文庫與包被了GST蛋白的磁珠混勻，室溫反應(yīng)1 h，然后取上清，去除與GST蛋白結(jié)合的ssDNA序列。混勻包被了ANXA2的磁珠溶液，取100 μL置于BSA包被的EP管中，用150 μL結(jié)合緩沖液洗滌3次。將上清ssDNA文庫與包被了膜聯(lián)蛋白的磁珠混勻，同時(shí)加入酵母tRNA競爭結(jié)合，室溫反應(yīng)1 h。置磁力架2-3 min，棄上清，用1×洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的ssDNA,如此重復(fù)3次。置磁力架3-4 min，棄上清，管中加入200 μL去離子水，95℃加熱5 min，置磁力架2 min，取上清為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

配置PCR體系：模板2μL，引物P80-SF（10uM）1μL,引物P80-AP（10uM）1μL，dNTP（各2.5mM）4μL，10×buffer 5μL，Taq DNA聚合酶 0.25μL，ddH₂O 36.75μL(總體積為50μL)。按如下條件，在PCR儀上擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，72℃總延伸5 min。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移置一個(gè)1.5 mL的離心管中。將200μL 1×磁珠結(jié)合洗滌緩沖液重懸鏈霉親和素瓊脂糖珠，使鏈霉親和素瓊脂糖珠的終濃度為5μg/μL,加入1 mlPCR產(chǎn)物，室溫?fù)u床結(jié)合1 h， 1000 rpm，離心2 min，棄上清。用1×磁珠結(jié)合洗滌緩沖液洗滌2-3次，加入400μL的200 mM NaOH孵育5 min，使dsDNA解鏈，1000 rpm，離心2 min，含生物素的一條ssDNA仍留在鏈霉親和素瓊脂糖珠上，而另一條不帶生物素的ssDNA存在于上清中，分離上清中ssDNA即為下一輪篩選的富集庫，如此重復(fù)進(jìn)行9個(gè)循環(huán)。

克隆測序及序列分析

將第9輪篩選得到的寡核苷酸適體富集庫用無修飾的引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行高通量測序，測序成功后獲得了兩條與ANXA2結(jié)合的核酸適體，其中一條序列如SEQ ID NO.3所示，命名為wh6（另一條命名為wh3，另案予以申請）。具體序列如下：

5'-ACCGACCGTGCTGGACTCAGTCCGATCTCTCCACAGAGACAAACTTAGGACCCCTAGTCCCACTATGAGCGAGCCTGGCG -3’(SEQ ID NO.3)

然后通過mfold軟件行對wh6核酸適體序列二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

實(shí)施例2

使用RIPA蛋白裂解液（P0013B，Beyotime生物技術(shù)研究所）提取多發(fā)性骨髓瘤ANBL-6和NCI-H929細(xì)胞的總蛋白，用BCA試劑盒（購自promega公司）測定蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，分別與ANXA2抗體（sc86235，Santa Cruz生物公司,稀釋比為1：1000）和GAPDH抗體（稀釋比為1：5000）孵育，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，孵育2 h，PBST洗膜，通過ECL反應(yīng)液顯影。檢測不同多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株ANXA2蛋白的表達(dá)情況。

結(jié)果見圖2，發(fā)現(xiàn)ANXA2在多發(fā)性骨髓瘤ANBL-6細(xì)胞中表達(dá)較高，而在NCI-H929細(xì)胞中表達(dá)較低。

實(shí)施例3

多發(fā)性骨髓瘤ANBL-6細(xì)胞和NCI-H929細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，計(jì)數(shù)將細(xì)胞調(diào)至1×10⁶個(gè)/mL；各取0.3 mL細(xì)胞，用Wash Buffer洗兩次；將FITC熒光基團(tuán)修飾的wh6和DNA-lib，用Binding Buffer稀釋到250 nM；與細(xì)胞在冰水混合物中孵育50 min，用Binding Buffer洗兩次,每次2 min；用PBS將細(xì)胞重懸至400 μL，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測并分析結(jié)果。

結(jié)果見圖3顯示wh6核酸適體與多發(fā)性骨髓瘤ANBL-6細(xì)胞有顯著結(jié)合，而與多發(fā)性骨髓瘤NCI-H929細(xì)胞無明顯結(jié)合。

實(shí)施例4

ANXA2-shRNA干擾序列（TRCN0000296322, TRCN0000056147）通過293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，并用NIH3T3細(xì)胞檢測病毒滴度。ANBL-6細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期。經(jīng)計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞調(diào)至1×10⁶個(gè)/mL；用30×10⁶病毒感染1×10⁶個(gè)細(xì)胞。感染病毒48小時(shí)后，收集細(xì)胞，取其中一半用流式細(xì)胞儀檢測ANBL-6細(xì)胞與wh6核酸適體的結(jié)合；另一半細(xì)胞提取其總蛋白，采用Western blot檢測細(xì)胞ANXA2的表達(dá)。

結(jié)果見圖4，發(fā)現(xiàn)干擾序列能敲低ANBL-6細(xì)胞中ANXA2的蛋白表達(dá)；附圖5結(jié)果顯示，在ANBL-6細(xì)胞中敲低ANXA2后與wh6核酸適體的結(jié)合明顯下降。

實(shí)施例5

1×10⁷個(gè)ANBL-6細(xì)胞用Western blot及IP細(xì)胞裂解液(碧云天，P0013)冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白,取20μL蛋白液作為input。平均分到三個(gè)EP管中，分別加入50 pmol的5’端生物素修飾的wh6核酸適體和DNA-Lib,并設(shè)鏈霉親和素瓊脂糖珠的陰性對照組，4℃搖床孵育1 h。然后加入20μL的鏈霉親和素瓊脂糖珠，4℃搖床孵育1 h。然后1000 rpm，離心2 min，棄上清，加入1 mL的DPBS洗5 min，1000 rpm，離心2 min，棄上清。重復(fù)用DPBS洗三次，加入40μL的Western blot上樣緩沖液到EP管中，95℃加熱5 min。然后1000 rpm，離心2 min，取上清。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉后用小鼠單克隆ANXA2抗體4℃孵育過夜，TPBS洗三次，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠的IgG，通過ECL反應(yīng)液顯影，檢測wh6和DNA-Lib與ANXA2蛋白的結(jié)合情況。

結(jié)果顯示（參見圖6），DNAl-lib及鏈霉親和素瓊脂糖珠不與ANXA2蛋白結(jié)合，wh6能與ANXA2蛋白結(jié)合。

實(shí)施例6

將對數(shù)生長期的MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞2×10⁵個(gè)/mL鋪至24孔板中。生長過夜后，第二天加入1μg/mL的ANXA2蛋白；同時(shí)分別加入4μM的DNA-lib和wh6核酸適體。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察ANXA2對細(xì)胞生長的刺激作用和wh6核酸適體對細(xì)胞生長的阻斷情況。

結(jié)果顯示（參見圖7）：ANXA2蛋白能明顯促進(jìn)MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞的生長，DNA-lib對ANXA2蛋白能促進(jìn)MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞的生長無影響，而wh6能阻斷ANXA2蛋白促進(jìn)MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞的生長。

實(shí)施例7

將HS-5細(xì)胞以1×10⁵個(gè)/ml鋪至24孔板中。生長過夜后，第二天加入加入1×10⁶個(gè)MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞；并分別加入4 μM的DNA-lib和wh6核酸適體，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后將上層培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，吸到96孔板中，用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。

結(jié)果顯示（參見圖8）：ANXA2核酸適體能阻斷HS-5細(xì)胞能促進(jìn)MM.1S和RPMI-8226細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例8

ANXA2重組蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋到1μg/mL，取200μL加入到96孔板中。4℃孵育過夜，用DPBS洗四次，每次3 min。用1%BSA 37℃封閉2 h，DPBS洗三次，每次3 min。將MM.1S細(xì)胞和RPMI-8226細(xì)胞用DiI（碧云天，C1036）染色20 min。取100μL加入已經(jīng)包被ANXA2蛋白的96孔板的孔中，同時(shí)分別加入4 μM的DNA-lib和wh6核酸適體，與細(xì)胞共同孵育2 h。用DPBS洗3次，每次2 min。通過全波長酶標(biāo)儀測熒光（激發(fā)光549 nm，發(fā)射光635 nm）。

結(jié)果顯示（參見圖9），ANXA2核酸適體抑制MM.1S.和RPMI-8226細(xì)胞對ANXA2蛋白的粘附作用。

實(shí)施例9

NCG小鼠購自南京大學(xué)動(dòng)物模式研究所，雄性，4-6周大小。在小鼠的左側(cè)背部皮下注射1×10⁷個(gè)ARP-1細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞生長約15-20天左右（直到腫瘤直徑大小為0.5-1.5cm）。皮下成瘤的NCG小鼠通過尾靜脈注射cy5-熒光標(biāo)記wh6核酸適體和DNA-lib序列，在固定的時(shí)間點(diǎn)通過IVIS Lumina II小動(dòng)物成像系統(tǒng)采集熒光信號。對于離體熒光實(shí)驗(yàn)，荷瘤小鼠靜脈內(nèi)注射用Cy5標(biāo)記wh6或DNA-lib序列。在注射后1小時(shí)用乙醚麻醉，頸椎脫位處死。通過解剖取其脾、肺、心臟和腫瘤組織等組織，用IVIS Lumina II小動(dòng)物成像系統(tǒng)采集熒光信號。

結(jié)果顯示（參見圖10）：通過尾靜脈注射Cy5標(biāo)記wh6后，腫瘤處的熒光信號在注射后30min最強(qiáng)，注射60 min時(shí)熒光信號有所下降，并在注射2 h后幾乎消失。而尾靜脈注射Cy5標(biāo)記DNA-lib的荷瘤小鼠，在腫瘤組織處無明顯的熒光信號。

結(jié)果顯示（參見圖11）：通過尾靜脈注射Cy5標(biāo)記wh6和DNA-lib序列1 h后，觀察熒光信號的組織聚集分布結(jié)果顯示，wh6主要在腫瘤組織處聚集，在肺組織，脾組織和心臟組織無熒光信號聚集。而注射DNA-lib的小鼠腫瘤組織，肺組織、脾組織和心臟組織無熒光信號的聚集。

<110> 中南大學(xué)，湖南大學(xué)

<120> 特異結(jié)合膜聯(lián)蛋白A2的核酸適體wh6及其應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<400> 1

ACCGACCGTGCTGGACTCA 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<400> 2

CGCCAG GCTCGCTCATAGT 19

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<400> 3

ACCGACCGTGCTGGACTCAGTCCGATCTCTCCACAGAGACAAACTTAGGACCCCTAGTCCCACTATGAGCGAGCCTGGCG 80