本發(fā)明涉及一種檢測人胰島素的方法，特別涉及一種基于核酸適體快速檢測人胰島素的法；屬于生物納米領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

胰島素是胰臟中胰島細胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，既能促進血液中的葡萄糖進入肝、肌肉和脂肪等組織細胞，在細胞內(nèi)合成糖元或轉(zhuǎn)變成其它營養(yǎng)物質(zhì)貯存起來；又能促進葡萄糖氧化分解釋放能量，供機體利用，是維持血糖在正常水平的主要激素。胰島素分泌不足或缺乏時，會引起高血糖，甚至是糖尿病。同時人胰島素也是作為胰島瘤和創(chuàng)傷的標志物。因此，能否準確測定血液中胰島素的濃度，對高血糖及糖尿病的早期診斷、臨床和基礎(chǔ)研究具有重要的價值。人胰島素檢測方法包括免疫分析法、色譜法、電化學(xué)分析法和熒光分析法，這幾種方法操作繁瑣，耗時，成本高，難以應(yīng)用到現(xiàn)場即時檢測。因此發(fā)明一種能快速檢測人血液中胰島素的含量，且靈敏性高，易于操作，并能特異性識別人胰島素的方法就顯得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種操作簡單、快速、低成本的通過比色法檢測人胰島素的方法。

為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種基于核酸適體的人胰島素檢測方法，該方法包括以下步驟：

1)先通過檸檬酸鈉還原氯金酸制備納米金；

2)再將人胰島素適配體修飾在所述納米金表面，得到探針；

3)將一系列不同濃度的人胰島素標準液先分別與所述探針反應(yīng)，再分別與NaCl溶液反應(yīng)，各所得反應(yīng)液分別通過紫外檢測納米金聚集態(tài)及分散態(tài)的紫外吸收峰值，建立人胰島素濃度值對應(yīng)納米金聚集態(tài)紫外吸收峰值和納米金分散態(tài)紫外吸收峰值比率的標準曲線；

4)將含人胰島素的待測液按3)步驟通過紫外檢測，并依據(jù)標準曲線進行分析，即得待測液中人胰島素的濃度。

本發(fā)明的技術(shù)方案，主要是基于納米金處于分散狀態(tài)時，在518nm左右有其獨特的吸收峰，而當納米金聚集時，其在518nm左右的吸收峰發(fā)生會紅移，且會在685nm左右出現(xiàn)新的吸收峰，其峰的大小代表聚集的程度，同時會發(fā)生變色反應(yīng)(溶液顏色也會隨之由酒紅色變成藍色，可以通過肉眼分辨)。而本發(fā)明的技術(shù)方案，將人胰島素適配體吸附在納米金上構(gòu)成探針，當人胰島素存在時，會與納米金上吸附的人胰島素適體結(jié)合，形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，使得納米金的耐鹽性降低，使納米金聚集，因此可以通過紫外測定待測液中納米金聚集態(tài)685nm左右吸收峰值與納米金518nm左右吸收峰值的比值，可以實時表征標志物的濃度。

優(yōu)選的方案，納米金尺寸為13nm～15nm。

較優(yōu)選的方案，所述的納米金的制備過程為：所述納米金的制備過程為：將濃度為0.005～0.015wt％氯金酸溶液加熱至沸騰后，加入濃度為1.5～2.5wt％的檸檬酸鈉溶液進行反應(yīng)，溶液由無色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色，在酒紅色的狀態(tài)下保持沸騰15～20分鐘，在攪拌條件下冷卻至室溫，即得納米金；其中，氯金酸與檸檬酸鈉的質(zhì)量比為1∶3～5。通過優(yōu)選的方案能獲得粒徑均一的納米金。

優(yōu)選的方案，將人胰島素適體與納米金在室溫下反應(yīng)，得到探針。較優(yōu)選為：將人胰島素適體與納米金按50～80nM∶2～5nM的比例，在25℃～40℃溫度下反應(yīng)10～15分鐘，得到探針。優(yōu)選的技術(shù)方案中，探針表面的人胰島素適體修飾量易于調(diào)控。可以通過簡單調(diào)節(jié)孵育過程中人胰島素適配體濃度，以及適體與納米金的反應(yīng)比例，來實現(xiàn)適體在納米金表面的結(jié)合量，易于使適體在納米金表面的結(jié)合量達到最大化。

優(yōu)選的方案，將濃度為50pM、250pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM、150nM和200nM的人胰島素標準液分別與探針反應(yīng)15～20min，再分別與50～100mM的NaCl溶液反應(yīng)10～15min后，分別采用紫外檢測人胰島素標準溶液中納米金聚集態(tài)及分散態(tài)的紫外吸收峰值，并建立人胰島素濃度值對應(yīng)納米金聚集態(tài)紫外吸收峰值和納米金分散態(tài)紫外吸收峰值比率的標準曲線。

優(yōu)選的方案，人胰島素適配體為血液中人胰島素特異性結(jié)合的適配體。

本發(fā)明的方法采用人胰島素適配體來作用于相應(yīng)的人胰島素，具有更高的特異性和識別力，檢測的靈敏度更高。

本發(fā)明方案中采用的人胰島素適配體可以通過現(xiàn)有的常規(guī)方法篩選方法獲得，或者直接通過購買得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。

本發(fā)明方案中采用的人胰島素適配體無任何修飾，主要通過靜電力吸附結(jié)合于制備的納米金表面。

相對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益技術(shù)效果：

1)本發(fā)明的技術(shù)方案根據(jù)顏色的變化，可以直接通過肉眼來大致判斷人胰島素含量的多少，可以采用比色法精確測定人胰島素濃度，達到快速檢測人胰島素的目的。

2)本發(fā)明的技術(shù)方案構(gòu)建的探針采用的是血液中人胰島素對應(yīng)的適配體，沒有干擾物質(zhì)，檢測限低，具有特異性識別，檢測靈敏度更高。

3)本發(fā)明的技術(shù)方案探針的制備及用于人胰島素檢測過程簡單、重復(fù)性好，操作簡單。探針僅采用一種核酸分子鏈，且無修飾成分，相對于使用具有巰基，信號分子等修飾的適體而言，成本很低。

4)本發(fā)明的構(gòu)建的探針為納米金與適配體的復(fù)合物，適體直接捕捉目標物，因此可直接用來檢測標志物。

5)本發(fā)明的技術(shù)方案以人胰島素適配體(aptamer)來作用于人胰島素，同時根據(jù)溶液的紫外曲線來分析血液中人胰島素的含量，具有靈敏度高、檢出限低、特異性強的特點。

6)本發(fā)明技術(shù)方案采用的適體序列可變，適體更換序列后可以推廣到檢測相對應(yīng)的其他標志物，如多肽，DNA，RNA，使得傳感器能得到更廣泛的應(yīng)用，具有一定的普遍性。

附圖說明

【圖1】為本發(fā)明檢測人胰島素的原理示意圖；

【圖2】為檢測不同濃度標志物的紫外圖；

【圖3】為通過紫外檢測人胰島素標準液建立人胰島素濃度值對應(yīng)納米金聚集態(tài)紫外吸收峰值和納米金分散態(tài)紫外吸收峰值比率(A₆₈₅/A₅₁₈)的標準曲線。

具體實施方式

以下實施例旨在進一步說明本發(fā)明內(nèi)容，而不是限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍。

實施例1

(1)納米金制備，及其納米金與適體結(jié)合制備探針，步驟如下：

首先將100mL 0.01％氯金酸在攪拌下，加熱至沸騰，然后迅速往沸騰的溶液中加入2mL 2％檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌使之混合均勻，此時攪拌不宜過于劇烈，以免混合不均勻，同時保持繼續(xù)沸騰狀態(tài)，當顏色由無色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色時，開始計時，繼續(xù)加熱15min，然后把溶液從油浴鍋中拿出，放置磁力攪拌器上攪拌冷卻至室溫，然后利用紫外分光光度計以及粒徑分析儀進行納米金溶液粒子尺寸和分散程度的表征。

(2)建立標準曲線：分別配制不同濃度(0.05，0.25，0.5，1，10，50，100，150，200nM)的人胰島素，分別依次加入到以上構(gòu)建的納米金與適體構(gòu)成的探針溶液中，由于探針溶液中的適配體是對應(yīng)的人胰島素的aptamer，它能夠和人胰島素形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，會將納米金上吸附的人胰島素適體競爭下來。由于加入人胰島素的量不同，形成的G-四聯(lián)體的量也不同，將納米金上吸附的人胰島素適體競爭下來的量也不同，當加入70mM NaCl時，會使納米金有一定的聚沉，從而整個溶液會呈現(xiàn)不同的顏色，可以通過肉眼快速判斷人胰島素的大致含量，再測紫外吸收曲線，685nm的吸收峰強度與518nm處吸收峰強度的比值也會不一樣，從而可以準確定量分析人胰島素。

(3)對人胰島素的定量分析步驟如下：當用于檢測實際樣品時，可通過用實際樣品代替標準溶液，進行上述的相同操作步驟，計算紫外吸收峰比率，根據(jù)線性標準曲線即可得出樣品對應(yīng)的濃度。

從圖2可以看出隨著加入的人胰島素的量增加，685nm處吸收峰值與518nm處吸收峰值的比值逐漸增大。也可以看出Au-aptamer-insulin在50～100mM NaCl下的狀態(tài)，對應(yīng)紫外可見吸收光譜中吸收峰的大小。

從圖3可以看出在一定的濃度范圍內(nèi)人胰島素濃度越大，其A₆₈₅與A₅₁₈的比值越來越大，達到某一濃度后會趨于平衡，從插圖中可以看出：在低濃度范圍內(nèi)有很好的其線性關(guān)系。