核酸適體-汞離子復(fù)合物的解離及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及汞離子的檢測方法。更具體來說，涉及利用核酸適體來檢測汞離子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]汞離子作為一種重金屬離子，具有較強(qiáng)毒性，可在生物體內(nèi)累積，攝入量較大時會對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害。因此，對汞離子污染的研宄受到了廣泛關(guān)注，并發(fā)展了豐富多樣的檢測方法，包括原子吸收光譜法、熒光法、電化學(xué)法、生物傳感檢測法等。其中，生物傳感檢測技術(shù)由于其優(yōu)秀的特異性分子識別能力，在快速檢測小分子方面展現(xiàn)了良好的能力。尤其是核酸適體技術(shù)，經(jīng)過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選出的核酸適體與靶物質(zhì)之間的親合力甚至強(qiáng)于DNA互補(bǔ)堿基對之間的結(jié)合力，因而經(jīng)常被用于基因突變、可卡因、重金屬汞離子、鉛離子等小分子的快速檢測。
[0003]在當(dāng)前的核酸適體檢測汞離子研宄中，核酸適體作為識別探針捕捉汞離子，并結(jié)合熒光基團(tuán)、電化學(xué)等手段實現(xiàn)汞離子的快速定量檢測。然而，目前核酸適體的使用都是一次性的，無法進(jìn)行重復(fù)利用，導(dǎo)致核酸適體的使用效率低下、使用成本較高。因此，研宄核酸適體-汞離子復(fù)合物的解離方法非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用核酸適體來檢測汞離子的方法，其中的核酸適體能夠被重復(fù)使用。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸適體-汞離子復(fù)合物的解離方法，包括:
[0006]用鹽酸調(diào)節(jié)雙蒸水使其pH為4-7并加熱至25°C -55°C以形成解離溶液；以及
[0007]將附著有核酸適體-汞離子復(fù)合物的玻片載體置于解離溶液中并以25-50次/min的頻率震蕩30_100min，從而將未尚子與玻片載體上附著的核酸適體充分解尚。
[0008]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，解離溫度為55°C而解離震蕩頻率為50次/min。因為發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在上述解離過程中，解離溫度在15°C _75°C之間時，與汞離子的解析效率成線性正比例關(guān)系；但如果解離溫度超過55°C，則解離汞離子后的固定化核酸適體的重復(fù)使用次數(shù)會大大減少。另外，解離震蕩頻率在25-100次/min之間時，震蕩頻率越快，汞離子的解析效率越高；但如果震蕩頻率超過50次/min時，解離汞離子后的固定化核酸適體的重復(fù)使用次數(shù)會大大減少。
[0009]在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實施例中，解離時間為60min。因為發(fā)明人發(fā)現(xiàn)(參見圖1)，當(dāng)解離時間在0-60min之間時，解離率隨著時間增加而逐漸升高，而當(dāng)解離時間在60-180min之間時，復(fù)合物的解離達(dá)到飽和，進(jìn)入平臺期，因此60min的解離時間既能保證達(dá)到最高水平的解離程度，又能保證較高的時間效率。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的解離方法，解離汞離子后的固定化核酸適體可至少重復(fù)使用5-10次，并且汞離子的解離效率在90%以上，甚至高達(dá)95 %。另外，每重復(fù)使用I次，玻片載體上固定的核酸適體吸附汞的效率和再次解離汞的效率至多降低2%。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種利用含T堿基的核酸適體來檢測汞離子的方法，其包括:
[0012]提供玻片載體；
[0013]對玻片載體執(zhí)行羥基化處理以獲得表面潔凈的羥基化玻片載體；
[0014]對羥基化玻片載體執(zhí)行硅烷化處理以獲得硅烷化玻片載體；
[0015]將含T堿基的核酸適體固定在硅烷化玻片載體上；
[0016]將固定在玻片載體上的核酸適體與單位體積的待測汞離子溶液反應(yīng)預(yù)定時間以在玻片載體上形成T-Hg復(fù)合物；
[0017]從待測汞離子溶液中取出玻片載體；
[0018]利用權(quán)利要求1的解離方法對所取出的玻片載體執(zhí)行解離；
[0019]利用電化學(xué)檢測方法檢測解離溶液中的汞離子濃度；
[0020]建立待測汞離子初始濃度與解離后濃度相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；以及
[0021]根據(jù)解離后所檢測的汞離子濃度確定待測汞離子初始濃度。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的檢測方法還可以包括:重復(fù)利用(固定在玻片載體上的)解離后的核酸適體來檢測汞離子濃度。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，還包括:從待測汞離子溶液中取出玻片載體之后(用雙蒸水)立即執(zhí)行清洗。在解離之前進(jìn)行清洗可以在電化學(xué)檢測過程中有效消除其它(金屬)陽離子的干擾。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，其中解離溶液的體積小于待測汞離子溶液的單位體積。該實施例尤其適用于微量汞離子存在而用常規(guī)方法無法檢測出的情況，其可以利用本發(fā)明的核酸適體對汞離子(在解離溶液中)進(jìn)行富集，直至可以檢測出的程度。解離溶液的體積優(yōu)選小于待測汞離子溶液(采樣)單位體積的五分之一。
[0025]本發(fā)明對玻片載體執(zhí)行羥基化處理沒有特別要求，在一個優(yōu)選實施例中，對玻片載體執(zhí)行輕基化處理包括:
[0026]將98 %濃硫酸與30 %過氧化氫按體積比3:1混合均勻而形成羥基化處理液；
[0027]將玻片載體置于羥基化處理液中，加熱至微沸條件下保持30min以進(jìn)行羥基化反應(yīng)；以及
[0028]冷卻后用雙蒸水清洗羥基化處理的玻片載體并晾干，從而得到表面潔凈的羥基化玻片。
[0029]在本發(fā)明的一個實施例中，對羥基化玻片載體執(zhí)行硅烷化處理包括:
[0030]將羥基化玻片載體浸入溫度為45°C、濃度為4mmol/L的GOPS溶液并保持30min以進(jìn)行娃燒化反應(yīng)；以及
[0031]用乙醇清洗硅烷化處理的玻片載體并晾干，從而獲得硅烷化玻片載體。
[0032]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，γ -縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GOPS)作為偶聯(lián)劑可以良好地將本發(fā)明的含T堿基的核酸適體固定于玻片載體表面，并便于其進(jìn)行后面與汞離子的結(jié)合和解離過程。
[0033]在本發(fā)明的一個實施例中，將含T堿基的核酸適體固定在硅烷化玻片載體上包括:
[0034]制備固定化緩沖液:含0.lmol/L 1_甲基咪唑，體積比為10%的二甲亞砜，以及pH為10 ；
[0035]將含T堿基的核酸適體溶于固定化緩沖液中以形成濃度為5-25 μ mol/L的核酸適體溶液；以及
[0036]取預(yù)定量的核酸適體溶液涂抹于硅烷化玻片載體上并在25 V -65°C之間反應(yīng)30-120min，從而使核酸適體固定在玻片載體表面上。
[0037]在進(jìn)一步的優(yōu)選實施例中，含T堿基的核酸適體的結(jié)構(gòu)為5’ _ττττττττττττττττττττ_3’。發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)的核酸適體對汞離子的結(jié)合和/或解離，尤其是對汞離子的解離有著驚人的高效。
[0038]在本發(fā)明的一個實施例中，將固定在玻片載體上的核酸適體與待測汞離子形成T-Hg復(fù)合物包括:
[0039]制備MOPS-NaNO3緩沖液:含 10mmol/L 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS)，10mmoI/LNaNO3,以及pH為7.1 ;以及
[0040]將待測汞離子和固定在玻片載體上的核酸適體分別引入MOPS-NaNO3緩沖液并保持10-180min，從而在玻片載體上形成T-Hg復(fù)合物。
[0041]在進(jìn)一步的優(yōu)選實施例中，在檢測T-Hg復(fù)合物之前用MOPS-NaNO3緩沖液再次沖洗T-Hg復(fù)合物。
[0042]在本發(fā)明的檢測方法中，待測汞離子初始濃度與解離后濃