本發(fā)明屬于蛋白檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和力的胰島素核酸適體及其制備方法。
背景技術(shù)：
胰島素是由胰臟內(nèi)的胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。
胰島素的生物合成速度受血漿葡萄糖濃度的影響，當(dāng)血糖濃度升高時(shí)，β細(xì)胞中胰島素原含量增加，胰島素合成加速。胰島素在胰島β細(xì)胞中合成。胰島素的分子量5700，由兩條氨基酸肽鏈組成。a鏈有21個(gè)氨基酸，b鏈有30個(gè)氨基酸。a-b鏈之間有兩處二硫鍵相連。胰島素是與c肽以相等分子分泌進(jìn)入血液的。臨床上使用胰島素治療的病人，血清中存在胰島素抗體，影響放射免疫方法測(cè)定血胰島素水平，在這種情況下可通過測(cè)定血漿c肽水平，來了解內(nèi)源性胰島素分泌狀態(tài)。
目前胰島素的檢測(cè)方法有三大類：色譜法、免疫學(xué)法、循環(huán)酶法。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標(biāo)準(zhǔn)化；而且hplc設(shè)備價(jià)格昂貴、技術(shù)條件要求高，需專門的維護(hù)人員，使其推廣困難。免疫學(xué)法需要還原游離ins形式，抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測(cè)游離型同型半胱胺酸，只能檢測(cè)血漿總同型半胱胺酸，用還原劑在37℃半小時(shí)卵育對(duì)血樣進(jìn)行還原處理。免疫學(xué)法需一小時(shí)以上才能出結(jié)果，操作步驟繁瑣，因?yàn)樾枰M(jìn)行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環(huán)酶法過程繁瑣，且檢測(cè)限低、產(chǎn)生誤差較大，價(jià)格昂貴，故得不到推廣。
核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識(shí)別分子，近年來受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對(duì)重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報(bào)道；核酸適配體藥物“macugen”也已于2005年被fda正式批準(zhǔn)上市。selex技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子,國內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識(shí)體或核酸適配體等。selex技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列組成)文庫,通過施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程),并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù),經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集,獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子,可以是rna也可以是dna,長(zhǎng)度一般為25~60個(gè)核苷酸。
由上可知，核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性,使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景,盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少,但應(yīng)用適體檢測(cè)類胰島素的研究卻不斷增多,基于適體的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。但是目前基于核酸適體的針對(duì)于胰島素的高效特異性識(shí)別研究還很缺乏，且針對(duì)于胰島素的核酸適體及其篩選制備方法尚未見有報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的胰島素檢測(cè)技術(shù)的不足，填補(bǔ)還未見胰島素的核酸適體及其篩選制備方法空白，提供一種胰島素核酸適體及其制備方法，本發(fā)明所提供的核酸適體命名ins4。
本發(fā)明的方案是通過這樣實(shí)現(xiàn)的：一種胰島素核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列其序列為：gtagggatgctcgaacggtaagtctctgatctccgtgaataactcgtcccccatctgg。
以上所述胰島素核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種：
（1）將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基a、t、c或g置換成稀有堿基甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；
（2）權(quán)利要求1中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；
（3）權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的肽核酸；
（4）權(quán)利要求1中所述核酸適體改造成的鎖核酸。
一種以上所述胰島素核酸適體或其衍生物在識(shí)別、檢測(cè)胰島素，或者制備檢測(cè)胰島素的試劑盒方面的應(yīng)用。
為了使本發(fā)明公開充分，本發(fā)明胰島素核酸適體的制備方法步驟如下：
胰島素核酸適體的制備方法包括以下步驟：
1）合成單鏈dna隨機(jī)序列寡核苷酸庫：所述單鏈dna隨機(jī)寡核苷酸庫的兩端為固定序列，作為pcr擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)，中間為60個(gè)堿基的隨機(jī)序列，庫容量1015以上。所述pcr引物為：
引物1：5’-ataccagcttattcaatt-3’
引物2：5’-biotin-agattgcacttactatct-3’
所述pcr引物2帶有5’端生物素標(biāo)記。
2）制備連接胰島素的固相基質(zhì)：以微磁珠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法把胰島素通過其羧基共價(jià)連接到微磁珠上。
3）初次篩選目的寡核苷酸序列：將dna隨機(jī)寡核苷酸庫與胰島素混合，篩選除去dna隨機(jī)寡核苷酸庫中不結(jié)合和非特異結(jié)合胰島素的寡核苷酸序列，回收特異結(jié)合胰島素的核酸序列。
4）制備次級(jí)單鏈dna寡核苷酸庫：將步驟3中所得與胰島素特異結(jié)合的寡核苷酸序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈霉親和素微磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，經(jīng)過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級(jí)dna寡核苷酸庫，用于下一輪篩選。
5）篩選并鑒定胰島素核酸適體：將步驟4所得的次級(jí)單鏈dna寡核苷酸庫進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過15輪篩選后獲得目標(biāo)寡核酸序列。克隆并測(cè)序所述目標(biāo)寡核酸序列，通過酶聯(lián)核酸適體吸附測(cè)定法鑒定其與胰島素結(jié)合的特異性和親和力。
6）所述胰島素核酸適體可作為檢測(cè)試劑用于檢測(cè)胰島素。
本發(fā)明的有益效果如下：（1）所篩選到的核酸適體分子量小，無毒性，有利于分子探針的設(shè)計(jì)，易于合成與標(biāo)記；（2）核酸適體只特異的識(shí)別胰島素，不結(jié)合非胰島素和其它類胰島素分子，結(jié)合胰島素的能力是結(jié)合非胰島素hb的能力的20~80倍，可以成為鑒別胰島素的試劑，提高檢測(cè)方法的特異性和靈敏度，簡(jiǎn)化檢測(cè)方法，降低成本。
附圖說明
圖1為本發(fā)明核酸適體與胰島素的結(jié)合能力，圖1中橫坐標(biāo)為核酸適體dna濃度，縱坐標(biāo)為解離常數(shù)(kd)相對(duì)值，圖中ins曲線表示核酸適體ins4與胰島素的結(jié)合曲線，in曲線表示核酸適體ins4與非胰島素（類胰島素in）的結(jié)合曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施1胰島素特異結(jié)合的核酸適體ins4的制備
構(gòu)建隨機(jī)序列寡核苷酸庫：人工合成單鏈dna序列，構(gòu)建庫容量為1×105的單鏈dna隨機(jī)序列寡核苷酸庫，單鏈dna隨機(jī)寡核苷酸庫包括的dna序列為：
5’-ggatccaccagcgtcatcagca-n25~40-agatagtaagtgcaatctggc-3’
所述單鏈dna隨機(jī)寡核苷酸庫的dna序列包括中間隨機(jī)序列n25~60和兩端固定序列，所述中間隨機(jī)序列n25~40為30~40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，所述兩端固定序列為：5’-ggatccaccagcgtcatcagca，3’-cggtctaacgtgaatgataga，所述兩端固定序列為pcr擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)。
1）將0.5ml(1x109微粒)invitrogen公司的帶有活化氨基的微磁珠與1mol/l胰島素在偶聯(lián)緩沖液（20mm磷酸鉀鹽緩沖液，0.15mnacl,1mmdtt,ph5.5）中混合，加入200ul偶聯(lián)劑溶液[57%1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(edc)]，將上述反應(yīng)置于25oc條件下輕混24小時(shí)。將藕連胰島素的磁珠用磁珠分離裝置和清洗液（pbs，1mmdtt，批h7.3）清洗后，重新懸浮于0.5mlpbs中。
2）將5nmol單鏈dna文庫溶于結(jié)合緩沖液（100mmnacl,20mmtris-hclph7.6,2mmmgcl2,5mmkcl,1mmcacl2,0.02%tween20,1mmdtt），進(jìn)行加熱處理：90oc加熱10min，置于冰上10min，然后溫度放置5min。
3）將處理好的單鏈dna文庫與結(jié)合有類胰島素的微磁珠孵育后，收集不結(jié)合磁珠的液體。
4）將步驟3）收集的液體與25ul步驟1）得到的胰島素-磁珠一起在結(jié)合緩沖液中37oc溫育30min。
5）用結(jié)合緩沖液洗滌溫育后的磁珠，然后加入200ul洗脫緩沖液（20mmtris-hclph7.6,200mmnacl,10mmedta），92oc孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液，進(jìn)行pcr反應(yīng)。
6）pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4oc預(yù)變性5min;94oc30s，47oc1min，72oc1min,擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)；最終延伸反應(yīng)為72oc10min。
7）pcr產(chǎn)物為5’端帶有生物素標(biāo)記的雙鏈dna，將產(chǎn)物與鏈霉親和素磁珠混合，25oc孵育30min后，用0.15mol/lnaoh使雙鏈dna變性為單鏈dna，通過脫鹽柱純化即得到下一輪篩選的單鏈dna文庫。
8）使用200pmol步驟7）得到的新單鏈dna文庫，重復(fù)進(jìn)行步驟2）至步驟8）的篩選程序，共進(jìn)行15輪篩選。最后克隆并測(cè)序第15輪單鏈dna文庫，得到ins4核酸序列：gtagggatgctcgaacggtaagtctctgatctccgtgaataactcgtcccccatctgg。
實(shí)施例2以流式分析法檢測(cè)核酸適體ins4與胰島素的結(jié)合能力
1）合成5’端帶熒光基團(tuán)fam標(biāo)記的胰島素核酸適體。
2）使用0nml/l,5nml/l,10nml/l,20nml/l,50nml/l,100nml/l,200nml/l濃度梯度的fam標(biāo)記的核酸適體連接胰島素(ins)的微磁珠來測(cè)定胰島素核酸適體的解離常數(shù)（kd）。用200μl結(jié)合緩沖液稀釋的上述各種濃度核酸適體，加入150nmol/l連接胰島素的微磁珠,37oc溫育30min。用結(jié)合緩沖液洗滌磁珠后，重新懸浮在250μl結(jié)合緩沖液中。設(shè)置隨機(jī)序列的寡核苷酸片段和連接類胰島素(in)的微磁珠作為對(duì)照。類胰島素為人工合成的胰島素類似物（地特胰島素）。
3）使用bd公司的流式細(xì)胞儀對(duì)微珠進(jìn)行熒光測(cè)定，然后用sigmaplot軟件作圖，計(jì)算出所篩選到的核酸適體與胰島素相互作用的解離常數(shù)（kd）相對(duì)值，結(jié)果如圖1所示。
序列表
<110>柳州立潔科技有限公司
<120>一種高親和力胰島素核酸適體ins4及其制備方法
<130>2016
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>58
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gtagggatgctcgaacggtaagtctctgatctccgtgaataactcgtcccccatctgg58