在本申請(qǐng)中參考了某些專利和出版物,后者還注明作者,雜志出處和出版日期。這些專利和出版物所披露的內(nèi)容被全文納入本申請(qǐng)作為參考以便更加全面地描述與本發(fā)明有關(guān)的技術(shù)的目前動(dòng)態(tài)。

本發(fā)明涉及用于治療過度增殖(hyperprolific)病癥和纖維變性病,以及減少因傷口愈合引起的瘢痕的新穎反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,asos)。

背景技術(shù)：

反義技術(shù)正在顯露出作為一種有效降低特定基因產(chǎn)物的表達(dá)的手段,因此,在若干調(diào)整結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor,ctgf)的表達(dá)方面的治療,診斷和研究應(yīng)用上可能證明是異常有用的。(見頒發(fā)給gaarde等人的美國專利u.s.patentno.6,965,025b2)

反義化合物是一種寡聚化合物,能與靶核酸(例如,一種靶標(biāo)mrna分子)發(fā)生雜交(hybridization)。

反義化合物,組合物以及調(diào)整ctgf的表達(dá)和治療與ctgf表達(dá)有關(guān)的疾病的方法被披露在上述的美國專利u.s.patentno.6,965,025b2中,在此被納入作為參考。但是,還是需要另外的此類化合物，其能增強(qiáng)對(duì)ctgf表達(dá)的抑制,提供功能和其他有助的性能。

在一實(shí)施例中，本發(fā)明特別地提供了優(yōu)選的用于抑制ctgf表達(dá)的修飾的反義寡核苷酸。業(yè)已證實(shí)這些修飾的寡核苷酸比先前描述的靶向ctgf的asos更具顯著的、出乎意料的潛力。

結(jié)締組織生長因子(ctgf；也稱之為ctgrofact,可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分泌蛋白(fibroblastinduciblesecretedprotein),fisp-12,nov2,類似胰島素生長因子-結(jié)合蛋白有關(guān)的蛋白質(zhì)2,igfbp-rp2,igfbp-8,hbgf-0.8,hcs24,和ecogenin)是模塊蛋白質(zhì)ccn(ctgf/cyr61/nov)家族的一員,被提名為經(jīng)識(shí)別的第一家族成員,結(jié)締細(xì)胞生長因子,富半胱氨酸(cysteine-rich,cyr61),超量表達(dá)的腎母細(xì)胞瘤(nephroblastomaoverexpressed,nov),但是,該家族還包括蛋白質(zhì)elm-1(在低轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞中表達(dá)),wisp-3(wnt-1-誘導(dǎo)的分泌蛋白),和cop-1(wisp-2)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)ccn蛋白質(zhì)為分泌的,與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)的蛋白質(zhì),它調(diào)控細(xì)胞的過程,像粘附,移動(dòng),有絲分裂發(fā)生,分化,存活,血管生成,動(dòng)脈粥樣壞死,軟骨形成,傷口愈合,腫瘤發(fā)生,以及血管和纖維變性的疾病,像硬皮病(scleroderma)(lauandlam,exp.cellres.,1999,248,44-57)。結(jié)締組織生長因子蛋白顯示出激發(fā)dna的合成和促進(jìn)成纖維細(xì)胞的趨化性(bradhametal.,j.cellbiol.,1991,114,1285-1294)。

大多數(shù)情況下,在表達(dá)的研究中已報(bào)導(dǎo)了一種單2.4-千堿基ctgf的轉(zhuǎn)錄物,盡管報(bào)導(dǎo)了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中3.5-和7-千堿基的轉(zhuǎn)錄物。在正常的分化過程中,結(jié)締組織生長因子在成纖維細(xì)胞中表達(dá),分化過程涉及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ecm)的生成和重建,像植入后的胚胎發(fā)生和子宮蛻膜。結(jié)締組織生長因子頻繁地在纖維變性的皮膚病中超量表達(dá),像全身硬化,局部皮膚硬化,瘢痕疙瘩,瘢痕組織,嗜酸性筋膜炎(eosinophilicfasciitis),結(jié)節(jié)性筋膜炎(nodularfasciitis),和掌攣縮病(dupuytren'scontracture)。結(jié)締組織生長因子mrna或者蛋白水平在包括肝,腎,肺,心血管系統(tǒng),胰,腸,眼和牙齦的主要器官和組織的纖維變性損害中會(huì)升高。在乳房,胰腺和纖維組織細(xì)胞的腫瘤中,特征明顯地累及結(jié)締組織,結(jié)締組織生長因子在基質(zhì)區(qū)室中超量表達(dá)。在許多情況下,結(jié)締組織生長因子的表達(dá)空間地和時(shí)間地與致纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-beta)聯(lián)系在一起(moussadandbrigstock,mol.genet.metab.,2000,71,276-292)。

結(jié)締組織生長因子已經(jīng)被定位到人類染色體區(qū)域6q23.1,鄰近c(diǎn)-myb基因,涉及該區(qū)域的染色體異常已經(jīng)與人類的腫瘤有關(guān),像腎母細(xì)胞瘤(wilms'tumor)(martinerieetal.,oncogene,1992,7,2529-2534)。

帶有顯著纖維變性和血管成分的腫瘤呈現(xiàn)出ctgf表達(dá)升高,ctgf可能涉及到兒科成肌纖維母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制。在考察過的12個(gè)兒科腫瘤中,在腫瘤細(xì)胞和/或相關(guān)脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中都顯示出中等至強(qiáng)烈的ctgf表達(dá)(kasaragodetal.,pediatr.dev.pathol.,2001,4,37-45)。

結(jié)締組織生長因子mrna在兒童急性淋巴母細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,all)的惡性人類白血病淋巴母細(xì)胞中也特別地被調(diào)高(vorwerketal.,br.j.cancer,2000,83,756-760),在hs578t人類乳腺癌細(xì)胞中mrna和蛋白質(zhì)水平都以一種劑量依賴性的方式被tgf-β調(diào)高,它表明ctgf是一個(gè)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子以及tgf-β是一個(gè)關(guān)鍵性的下游效應(yīng)子(yangetal.,j.clin.endocrinol.metab.,1998,83,2593-2596)。

在一個(gè)鼠的肺纖維化模型中,結(jié)締組織生長因子mrna表達(dá)的升高也是被爭光霉素(bleomycin),一個(gè)已知的肺纖維發(fā)生劑所誘導(dǎo)(laskyetal.,am.j.physiol.,1998,275,l365-371；與健康的不吸煙對(duì)照試驗(yàn)人群相比較,在先天性肺纖維化和肺肉狀瘤病(pulmonarysarcoidosis)患者的支氣管肺泡灌洗細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了同樣的mrna表達(dá)的升高,它表明結(jié)締組織生長因子被涉及到針對(duì)損傷的纖維增生應(yīng)答反應(yīng)中(allenetal.,am.j.respir.cellmoll.biol.,1999,21,693-700)。同樣,在一個(gè)增生的腎小球腎炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?結(jié)締組織生長因子mrna的表達(dá)在毛細(xì)管外和腎小球膜增生損害以及腎小球外周纖維化(periglomerularfibrosis)區(qū)域中強(qiáng)烈地升高。早期腎小球結(jié)締組織生長因子的超量表達(dá)與tgf-β蛋白質(zhì)的明顯向上調(diào)控一致,以及結(jié)締組織生長因子的動(dòng)力學(xué)有力地暗示了在該短暫的腎損傷模型中tgf-β在腎小球的修復(fù),有可能在下游的修復(fù)中的角色(itoetal.,j.am.soc.nephrol.,2001,12,472-484)。

美國專利u.s.pat.no.5,876,730所披露和要求權(quán)利的是一種實(shí)質(zhì)上純的或者分離的多肽,它具有與結(jié)締組織生長因子(ctgf)蛋白的羧基末端氨基酸相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列這樣的特征,其特征在于該多肽具有一氨基酸序列，其由結(jié)締組織生長因子的n端的氨基酸殘基247或248開始,一分離的多聚核苷酸序列編碼結(jié)締組織生長因子多肽,一重組表達(dá)載體含有所述的多肽,一宿主細(xì)胞含有所述的表達(dá)載體,一種藥用組合物,其在藥用可接受的載體中包含有效治療量的結(jié)締組織生長因子多肽。反義寡核苷酸被一般地披露了(brigstockandharding,1999)。

美國專利u.s.pat.no.5,783,187；5,585,270；6,232,064；6,150,101；6,069,006和pct出版物wo00/35936所披露和要求權(quán)利的是一種分離的多聚核苷酸其編碼結(jié)締組織生長因子多肽,表達(dá)載體,宿主細(xì)胞其被所述載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染；分離的多聚核苷酸包含從結(jié)締組織生長因子的上游分離出來的5’未翻譯的調(diào)控核苷酸序列,其特征在于,所述的未翻譯的調(diào)控核苷酸序列包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)域,其特征還在于,所述序列是一tgf-β應(yīng)答成分；分離的核酸結(jié)構(gòu)包含從結(jié)締組織生長因子(ctgf)基因的上游分離出來的非編碼調(diào)控序列,其特征在于,所述非編碼調(diào)控序列與表達(dá)所關(guān)心的蛋白質(zhì)或者反義rna的核酸序列可操作地結(jié)合,其特征在于,所述核酸相對(duì)于所述非編碼序列是異源的；以及具有誘導(dǎo)ecm合成,膠原合成和/或成肌纖維細(xì)胞分化能力的結(jié)締組織生長因子(ctgf)的多肽片段,包含由所述多肽的至少外顯子2或外顯子3編碼的氨基酸序列。進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種識(shí)別組合物的方法,該組合物影響tgf-β誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長因子的表達(dá),一種診斷選自由纖維變性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化癥小組的懷疑有病理學(xué)的受試者的病理狀況的方法,該方法包含獲取懷疑含有結(jié)締組織生長因子的樣本,通過檢測受試者樣本中結(jié)締組織生長因子的水平與正常的標(biāo)準(zhǔn)樣本中結(jié)締組織生長因子水平的差異診斷受試者的病理學(xué)特征為與結(jié)締組織生長因子細(xì)胞相關(guān)的增生病癥。進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種改善與結(jié)締組織生長因子有關(guān)的細(xì)胞增生病癥的方法,它包含在病癥部位對(duì)患有所述病癥的受試者給予一種組合物,該組合物包含藥用有效量的抗體或片段，與結(jié)締組織生長因子結(jié)合,其特征在于組合物中的抗體或片段不與pdgf結(jié)合。反義寡核苷酸被一般地披露了(grotendorst,2000；grotendorstandbradham,2001；grotendorstandbradham,2000；grotendorstandbradham,1996；grotendorstandbradham,1998；grotendorstandbradham,2000)。

pct出版物wo00/27868所披露和要求權(quán)利的是一種實(shí)質(zhì)上純的結(jié)締組織生長因子多肽或者其中的功能片段,一種編碼所述多肽的分離的多聚核苷酸序列,所述多聚核苷酸序列中的t也可以是u,一種與所述多聚核苷酸序列互補(bǔ)的核酸序列,以及所述序列的片段,它們的長度至少為15個(gè)堿基,會(huì)與對(duì)編碼結(jié)締組織生長因子蛋白的氨基酸序列的dna在適度的直至非常嚴(yán)格的條件下雜交。進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種包括所述多聚核苷酸的表達(dá)載體,一種與所述載體一起穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,一種與所述多肽結(jié)合的抗體,以及一種制備所述多肽的方法。還進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種抑制結(jié)締組織生長因子在細(xì)胞中表達(dá)的方法,它包含使該細(xì)胞與結(jié)合了該細(xì)胞中的靶核酸的多聚核苷酸接觸,其特征在于,該多聚核苷酸抑制了結(jié)締組織生長因子在細(xì)胞中的表達(dá),并且,該多聚核苷酸是一種反義寡核苷酸,以及檢測結(jié)締組織生長因子表達(dá)的測試盒,該測試盒包含分成多個(gè)格子的置物架子來承放一個(gè)或多個(gè)容器,至少一個(gè)容器中含有至少一種與結(jié)締組織生長因子結(jié)合的反義寡核苷酸(schmidtetal.,2000)。

pct出版物wo00/13706所披露和要求權(quán)利的是一種治療或防止纖維變性的方法,該方法包含對(duì)需要的受試者給予有效量的一種試劑,它調(diào)整,調(diào)控或者抑制結(jié)締組織生長因子或其片段的表達(dá)或活性,其特征在于該試劑是一種抗體,一種反義寡核苷酸,或者是一種小分子。該方法直接用于腎纖維化和相關(guān)的腎病的治療,特別是與糖尿病和高血壓有關(guān)的并發(fā)癥的治療(riseranddenichili,2000)。

pct出版物wo01/29217所披露和要求權(quán)利的是一種分離的核酸分子,它包含對(duì)編碼一多肽的核酸分子,該多肽包含一個(gè)氨基酸序列,其選自包括nov1，nov2(結(jié)締組織生長因子),和nov3這樣一組的氨基酸序列,選自所述組的氨基酸序列的成熟形態(tài)或變異體,以及一種核酸分子,它包含編碼一多肽的核酸序列,該多肽包含一個(gè)氨基酸序列,它選自所述的一組,和所述多肽的成熟和變異體形態(tài)或片段,和所述核酸分子的補(bǔ)體。反義寡核苷酸被一般地披露過(prayagaetal.,2001)。

肥大性瘢痕的形成,尤其是在臨床上消散嚴(yán)重?zé)齻莻€(gè)重點(diǎn)難題,它能引起高度增生的瘢痕,造成永久性的功能喪失和外貌損傷的標(biāo)志特征。每年在美國有超過一百萬的人需要治療燒傷。燒傷后肥大性瘢痕的發(fā)病率是個(gè)普通的后果,它產(chǎn)生了非常大的問題。因此,像反義寡核苷酸(aos)那樣的ctgf抑制劑應(yīng)該在防止燒傷后嚴(yán)重的肥大性瘢痕上非常有效。通過局部施涂按預(yù)先規(guī)定的方法制備的aso,并且監(jiān)測燒傷發(fā)生后瘢痕發(fā)展的嚴(yán)重程度可以來評(píng)價(jià)它的功效。

有若干理由或許讓ctgf成為調(diào)控肥大性瘢痕成為有吸引力的目標(biāo)。作為tgf-β1或tgd-β2的輔因子和下游介質(zhì)(downstreammediator),對(duì)于針對(duì)瘢痕的基因定向分子療法而言,ctgf可能比tgf-β1或tgd-β2代表更加特效的目標(biāo),尤其是因?yàn)閠gf-β1或tgd-β2具有與瘢痕形成無關(guān)的多能的效果的緣故。另外,ctgf可能具有與tgf-β1或tgd-β2無關(guān)的保持纖維變性表型的功能,而tgf-β1或tgd-β2的策略可能會(huì)忽視纖維變性表型。盡管對(duì)ctgf在多重器官系統(tǒng)中和在像硬皮病那樣的慢性皮膚病中擴(kuò)大纖維化的作用的了解在深入,但是,ctgf在急性瘢痕和傷口愈合中的作用仍然待大量觀察的。

目前還沒有已知的有效抑制結(jié)締組織生長因子合成的治療劑,至今針對(duì)調(diào)控結(jié)締組織生長因子功能的研究策略已經(jīng)涉及到采用丁酸鈉(sodiumbutyrate,nab),功能阻滯抗體和反義寡核苷酸。

飲食因素被認(rèn)為在人類癌癥,包括乳腺癌的發(fā)展和防止上起了重要作用。飲食的微量營養(yǎng)素nab是飲食淀粉和纖維消化的主要最終產(chǎn)物,它是一種強(qiáng)有力的增長抑制劑，它啟動(dòng)許多類型細(xì)胞在體外的細(xì)胞分化。nab,部分地,作為乳腺上皮細(xì)胞中的組蛋白脫乙酰酶的抑制劑發(fā)揮著它的生物學(xué)作用,誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞在hs578t雌激素-無應(yīng)答的人類乳腺癌細(xì)胞中的死亡,它能根據(jù)不同的細(xì)胞類型激活在細(xì)胞周期阻滯(cellcyclearrest)中涉及到的不同基因。nab以劑量依賴的方式特別地上調(diào)結(jié)締組織生長因子的表達(dá),在癌性和非癌性的乳房細(xì)胞中促進(jìn)mrna和蛋白水平的升高(tsubakietal.,j.endocrinol.,2001,169,97-110)。

tgf-β具有獨(dú)特的能力來刺激正常的成纖維細(xì)胞在軟瓊脂中的生長,是轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞的一種性質(zhì)。結(jié)締組織生長因子不能誘導(dǎo)這些錨地非依賴的(anchorage-independent)增長的正常鼠腎(normalratkidney,nrk)的成纖維細(xì)胞,但是,結(jié)締組織生長因子的合成和作用對(duì)于tgf-β誘導(dǎo)的錨地非依賴的性是必不可少的。結(jié)締組織生長因子的抗體特定地阻斷tgf-β誘導(dǎo)的錨地非依賴的增長,通過在反義取向中一種表達(dá)結(jié)締組織生長因子基因的結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)化的nrk成纖維細(xì)胞不應(yīng)答在錨地非依賴的增長試驗(yàn)中的tgf-β(替換為：被構(gòu)建的表達(dá)結(jié)締組織生長因子基因通過反義定向轉(zhuǎn)化過的nrk成纖維細(xì)胞在錨地非依賴的的生長分析中不響應(yīng)tgf-β)(kothapallietal.,cellgrowth.differ.,1997,8,61-68)。這些ctgf-反義表達(dá)nrk細(xì)胞也被用于顯示tgf-β-刺激的膠原合成是通過結(jié)締組織生長因子介導(dǎo)的,這表明結(jié)締組織生長因子可能是抗纖維化療法有用的靶(duncanetal.,fasebj.,1999,13,1774-1786)。

人類結(jié)締組織生長因子cdna的3’-未翻譯的區(qū)域(untranslatedregion,utr)為調(diào)控要素承載了若干個(gè)共有序列。當(dāng)3’-utr在一個(gè)報(bào)道基因下游被融合時(shí),發(fā)現(xiàn)它作為一個(gè)有力的順式作用阻遏要素在發(fā)揮作用,反義3’-utr具有相同的,但更強(qiáng)有力的效果(kubotaetal.,febslett.,1999,450,84-88)。對(duì)人類和鼠的結(jié)締組織生長因子3’-utr的比較揭示出保留了一個(gè)長91個(gè)堿基的小片段。該區(qū)域被來自nih3t3鼠成纖維細(xì)胞的rt-pcr放大,并被用于形成一個(gè)嵌合的融合結(jié)構(gòu)以分析它的阻遏效果。,鼠結(jié)締組織生長因子3’-utr無論是在正向還是反義定向中都有強(qiáng)力的報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄阻遏效果,這表明該調(diào)控要素是非定向依賴性的(kondoetal.,biochem.biophys.res.commun.,2000,278,119-124)。

長度為16個(gè)核苷酸,靶向翻譯啟動(dòng)的起始位點(diǎn)的一種硫代磷酸酯(phosphorothioate)反義寡核苷酸被用于抑制結(jié)締組織生長因子的表達(dá),以及抑制牛主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)的增生和移動(dòng)(shimoetal.,j.biochem.(tokyo),1998,124,130-140)。該反義寡核苷酸也被用于顯示結(jié)締組織生長因子誘導(dǎo)在mcf-7人類乳腺癌細(xì)胞中的凋亡,tgf-β-誘導(dǎo)的凋亡部分地是由結(jié)締組織生長因子介導(dǎo)的(hishikawaetal.,j.biol.chem.,1999,274,37461-37466)。還發(fā)現(xiàn)同樣的反義寡核苷酸抑制tgf-β-介導(dǎo)的凋亡蛋白酶3(caspase3)的激活,因而抑制在人類主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(humanaorticsmoothmusclecells,hasc)中tgf-β-介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)(hishikawaetal.,eur.j.pharmacol.,1999,385,287-290)。該反義寡核苷酸還被用于阻斷結(jié)締組織生長因子的表達(dá),并且證實(shí)了高血壓上調(diào)結(jié)締組織生長因子在腎小球系膜細(xì)胞(mesangialcells)中的表達(dá),這就轉(zhuǎn)而增強(qiáng)了ecm蛋白的產(chǎn)生并誘導(dǎo)凋亡,有助于腎小球膜的重塑和最終的腎小球硬化(hishikawaetal.,j.biol.chem.,2001,276,16797-16803)。

因此,感到還有長期的需要有另外的能有效抑制結(jié)締組織生長因子功能的試劑。

發(fā)明綜述

本發(fā)明提供了包含修飾的寡核苷酸的化合物,該寡核苷酸包含12–30個(gè)連接的核苷,優(yōu)選包含20個(gè)或者至少12個(gè)連接的核苷,更為理想的是包含至少14個(gè)核苷,化合物能抑制結(jié)締組織因子的表達(dá)。還提供了包含本發(fā)明的反義化合物的藥用組合物和其他組合物。

進(jìn)一步提供了治療患有與ctgf有關(guān)疾病或癥狀的動(dòng)物.特別是人類的方法,該方法是通過給予一定量的這樣的化合物來有效地抑制ctgf的表達(dá),其特征在于,該疾病或癥狀是一種過度增殖病癥,像癌癥和纖維變性的疾病。進(jìn)一步還提供了減少傷口愈合所造成的瘢痕的方法,該方法是通過給予一定量的這樣的化合物來有效地抑制ctgf的表達(dá)。

附圖的簡要說明

圖1顯示ctgf基因組序列上的靶片段或區(qū)域,主要是外顯子靶片段,以其為對(duì)照制備靶向ctgf的反義寡核苷酸

圖2顯示ctgfmrna序列上的靶片段或區(qū)域,以其為對(duì)照制備靶向ctgf的反義寡核苷酸。

圖3提供了試驗(yàn)在ctgfmrna序列上的反義寡核苷酸靶向外顯子序列用以抑制ctgf表達(dá)的圖解表示。

圖4顯示ctgf基因組序列上的靶片段或區(qū)域,主要是內(nèi)含子靶片段,以其為對(duì)照制備靶向ctgf的反義寡核苷酸。

圖5顯示ctgfmrna序列上的靶片段或區(qū)域,以其為對(duì)照制備靶向ctgf的反義寡核苷酸。

圖6提供了在ctgfmrna序列上的反義寡核苷酸靶向內(nèi)含子序列用以抑制ctgf表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果的圖解表示。

圖7顯示抑制ctgf的高度靈敏的反義寡核苷酸,以及它們與兩種以前設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸(isis124238和isis124212)活性的比較,披露于美國專利u.s.patentno.6,965,025b2中。圖7a識(shí)別了8種外顯子靶向反義寡核苷酸,圖7b提供了反義寡核苷酸的優(yōu)選序列。

圖8提供了由9種高度活性的新穎的人類ctgf的反義寡核苷酸先導(dǎo)序列用以在培養(yǎng)的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中抑制ctgf所獲得的劑量應(yīng)答的圖解表示。序列141923為陰性對(duì)照,序列124238和124212為兩種以前設(shè)計(jì)的序列。

圖9提供了鼠在接受了四星期的25mg/kg或50mg/kg劑量的反義寡核苷酸isis412294(seqidno:39),isis412295(seqidno:40)或isis418899(seqidno:166)后的血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotranferease,alt)(圖9a)和血漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase,ast)(圖9b)水平的圖解表示。結(jié)果表明鼠在接受了25mg/kg或50mg/kg劑量的反義寡核苷酸isis412294(seqidno:39),isis412295(seqidno:40)或25mg/kg劑量的isis418899(seqidno:166)后的alt和ast水平與鹽水(載體)對(duì)照組中的水平相似；鼠在接受了50mg/kg劑量的isis418899(seqidno:166)后的alt和ast水平明顯升高,高于對(duì)照組的觀測值。

圖10提供了接受四星期的反義寡核苷酸治療后,顯示50mg/kg劑量的isis412295治療組的體重增加明顯低于對(duì)照組體重增加的圖解表示

圖11顯示鼠的皮膚傷口真皮內(nèi)用3.0,1.0,0.3或0.1mg的ctgf反義寡核苷酸治療結(jié)果,對(duì)所有的劑量,ctgf和co11a2mrna的表達(dá)都有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的明顯降低。這些結(jié)果清楚地證實(shí)了利用2’moe修飾的反義寡核苷酸來抑制ctgf的表達(dá)會(huì)減少膠原在皮膚上的沉積。

圖12提供的圖解表示說明兔在接受了50mg/ml(總劑量5mg)的真皮內(nèi)給藥至少達(dá)14天后存在的ctgf反義寡核苷酸顯著的水平。

發(fā)明的詳細(xì)說明

在一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明提供了一種化合物,它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾的寡核苷酸,在選自seqidno:9的核苷酸718-751,1388-1423,1457-1689,2040-2069,2120-2147,2728-2797,2267-2301,553-611,1394-1423,1469-1508,1559-1605,1659-1689，2100-2129及1399-1423的區(qū)域內(nèi)至少存在它的一個(gè)12個(gè)核堿基序列的部分。

在另一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明提供了一種化合物,它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾寡核苷酸,在選自seqidno:10的核苷酸2540-2559,2568-2587，2623-2647和2623-2642的區(qū)域內(nèi)至少存在它的一個(gè)12個(gè)核堿基序列的部分。

在一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明提供了一種化合物,它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾寡核苷酸,在seqidno:28,30,39,40,43,44,45,50,51,52,56,78,125和166中提出的核堿基序列中至少存在它的一個(gè)12個(gè)核堿基序列的部分。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,該化合物包含20個(gè)或者至少12個(gè)連接的核苷,更優(yōu)選地,包含至少14個(gè)連接的核苷,它存在于seqidno:28,30,39,40,43,44,45,50,51,52,56,78,125和166中提出的核堿基序列中。

這些序列的選擇是通過篩選在圖1至圖7中呈現(xiàn)出的結(jié)果以及在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)中劑量應(yīng)答研究的結(jié)果所決定的。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)見下面的實(shí)施例部分中的實(shí)施例8。

在圖1-6中呈現(xiàn)的靶序列包括內(nèi)含子和外顯子靶向序列。靶區(qū)域是核酸結(jié)構(gòu)上定義的一個(gè)區(qū)域。例如,一個(gè)靶區(qū)域可以包含一個(gè)3’utr,一個(gè)5’utr,一個(gè)外顯子,一個(gè)內(nèi)含子,一個(gè)編碼區(qū)域,一個(gè)翻譯起始區(qū)域,一個(gè)翻譯終止區(qū)域,或者其他的被定義的核酸區(qū)域。靶標(biāo)包括確定至少一個(gè)與反義化合物雜交的靶片段,這樣能產(chǎn)生合乎理想的效果。在該實(shí)施例中，該合乎理想的效果是減低mrna靶核酸的水平。

在外顯子和內(nèi)含子序列中都識(shí)別出多個(gè)序列的活性明顯高于以前設(shè)計(jì)的序列,像seqidno:15(isis124238)。若干個(gè)新的內(nèi)含子(seqno:125)和外顯子(seqnos.28,30,40,45,52,50和78)寡核苷酸表現(xiàn)出的活性顯著高于其他序列。

在最初的aso活性篩選中seqidnos.39和40顯示出是高度有效的ctgf表達(dá)抑制劑(在此有數(shù)據(jù)顯示)。為了進(jìn)一步考察在ctgfmrna上的這片區(qū)域是否代表一個(gè)以asos為目標(biāo)的“熱點(diǎn)”,又設(shè)計(jì)了另一個(gè)aso序列(seqidno166),它被設(shè)計(jì)成與被seqnos39和40作為目標(biāo)的那些序列的上游序列雜交。也發(fā)現(xiàn)該aso(seqidno166)是一個(gè)對(duì)ctgfmrna表達(dá)的十分有效的抑制劑，表明ctgfmrna的這一段對(duì)于以aso抑制劑為目標(biāo)是個(gè)有吸引力的區(qū)域。

在某個(gè)實(shí)施例中,反義化合物與一部分的ctgf區(qū)域互補(bǔ),該區(qū)域?yàn)閷形稽c(diǎn)從1396伸展至1424的活性寡核苷酸的靶標(biāo)。這是一個(gè)作為isis418899,412295，和412294(分別為seqidnos:166,40和39)的靶標(biāo)的序列空間。

本發(fā)明還提供了一種化合物,它包含一種修飾的寡核苷酸,該寡核苷酸包含至少12個(gè),優(yōu)選至少14個(gè)連接的核苷,它的核堿基序列是提出在seqidno:28,30,39,40,43,44,45,50,51,52,56,78,125和166之一種中的一部分。

在此描述的反義化合物可以包含一個(gè)具有12至30,12至20，優(yōu)選14至20個(gè)連接的核苷的寡核苷酸。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該修飾的寡核苷酸是單鏈或雙鏈的寡核苷酸。

本發(fā)明采用寡聚化合物,特別是反義寡核苷酸,用以調(diào)節(jié)核酸分子編碼結(jié)締組織生長因子的功能,最終調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子產(chǎn)生的數(shù)量。這是通過提供專一地與一個(gè)或多個(gè)編碼結(jié)締組織生長因子的核酸雜交的反義化合物來實(shí)現(xiàn)的。在此所使用的術(shù)語“靶核酸”和“編碼結(jié)締組織生長因子的核酸”包含編碼結(jié)締組織生長因子的dna,由這樣的dna轉(zhuǎn)錄的rna(包括pre-mrna和mrna),以及從這樣的rna中衍生出來的cdna。一種寡聚化合物與其靶核酸特定的雜交干擾了該核酸的正常功能。這種通過化合物專一地與靶核酸雜交來調(diào)節(jié)靶核酸功能的方法通常稱之為“反義”。被干擾的dna功能包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的rna功能包括所有維持生命所必需的功能,像,例如,rna移位到蛋白質(zhì)翻譯的位點(diǎn)上,由rna翻譯蛋白質(zhì),剪接rna以生成一個(gè)或多個(gè)mrna種類，以及可能是rna參與的或促進(jìn)的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總效果是調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子的表達(dá)。在本發(fā)明的內(nèi)容中,“調(diào)節(jié)”意味著基因表達(dá)的升高(促進(jìn))或者降低(抑制)。在本發(fā)明的內(nèi)容中,抑制是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的優(yōu)選方式,mrna是優(yōu)選的靶標(biāo)。

靶核酸,靶區(qū)域和核苷酸序列

優(yōu)選將特定的核酸作為反義的目標(biāo)。在本發(fā)明的內(nèi)容中,將反義化合物“靶向”到一種特定的核酸上是一個(gè)具有多步的過程。

可以理解的是,包含在實(shí)施例中的每個(gè)seqidno中提出出來的序列與對(duì)糖組成部分,核苷間的連接,或者核堿基的任何修飾無關(guān)。同樣地,由一個(gè)seqidno確定的反義化合物可以獨(dú)立地包含一處或多處對(duì)糖組成部分,核苷間的連接,或者核堿基的修飾。由isis號(hào)碼(isisno)描述的反義化合物表示了核堿基和模體(motif)的一種結(jié)合。

在一個(gè)實(shí)施例中,靶區(qū)域是核酸結(jié)構(gòu)上定義出來的。例如,一個(gè)靶區(qū)域可以包含一個(gè)3’utr,一個(gè)5’utr,一個(gè)外顯子,一個(gè)內(nèi)含子,一個(gè)編碼區(qū)域,一個(gè)翻譯起始區(qū)域,一個(gè)翻譯終止區(qū)域,或者其他的被定義的核酸區(qū)域。核酸結(jié)構(gòu)上定義出的區(qū)域通過由序列數(shù)據(jù)庫如ncbi給出的登錄編號(hào)獲得，那些信息在此被引為參考納入。在一個(gè)實(shí)施例中，靶區(qū)域可包含這樣的序列，該序列從靶區(qū)域內(nèi)的一個(gè)靶片段的5’靶點(diǎn)至靶區(qū)域內(nèi)的另一個(gè)靶片段的3’靶點(diǎn)。

靶標(biāo)包括確定至少一個(gè)與反應(yīng)化合物雜交的靶片段，這樣能產(chǎn)生合乎理想的效果。在特定的實(shí)施例中，該合乎理想的效果是減低mrna靶核酸的水平。在其他的實(shí)施例中，該合乎理想的效果是由靶核酸編碼的蛋白質(zhì)的水平或者是與靶核酸相關(guān)聯(lián)的表型變化。

靶區(qū)域可包含一個(gè)或者多個(gè)靶片段。靶區(qū)域內(nèi)的多個(gè)靶片段可以是重疊的?；蛘?它們也可以是不重疊的。在一個(gè)實(shí)施例中,在一個(gè)靶區(qū)域中的靶片段被不超過約300個(gè)核苷隔開。在另外的實(shí)施例中,在一個(gè)靶區(qū)域中的靶片段被靶核酸上的不多于約250，200,150,100,90,80,70,60,50,40,30,20或10個(gè)核苷隔開。在另一個(gè)實(shí)施例中,在一個(gè)靶區(qū)域中的靶片段被靶核酸上的不多于約5個(gè)核苷隔開。在別的實(shí)施硫中,靶片段是鄰接的。

合適的靶片段可以在一個(gè)5’utr,一個(gè)編碼區(qū),一個(gè)3’utr,一個(gè)內(nèi)含子,或者一個(gè)外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)。包含一個(gè)開始密碼子或者一個(gè)終止密碼子的靶片段也是合適的靶片段。合適的靶片段可以特異地排除某些結(jié)構(gòu)上定義的區(qū)域,像開始密碼子或者終止密碼子。

合適靶片段的確定可以包括將靶核酸的序列在整個(gè)基因組中與其他序列相比較。例如,blast算法可以用于識(shí)別在不同核酸中具有相似性的區(qū)域。這種比較能防止選擇的反義化合物序列會(huì)以非特異的方式與一個(gè)不是選出來的靶核酸(即,非靶序列或偏離的靶序列)雜交。

在一個(gè)活性的靶區(qū)域內(nèi),反義化合物的活性(例如被定義為靶核酸水平降低的百分?jǐn)?shù))可以是有變化的。在一個(gè)實(shí)施例中,ctgfmrna水平的下降表現(xiàn)出對(duì)ctgf表達(dá)的抑制。ctgf蛋白水平的下降也表現(xiàn)出對(duì)靶mrna表達(dá)的抑制。還有,表型變化是抑制ctgf表達(dá)的征兆。例如,ctgf測量值的增加是抑制ctgf表達(dá)的征兆。

詳細(xì)地說,靶標(biāo)過程通常從識(shí)別一個(gè)其功能要被調(diào)節(jié)的核酸序列開始。例如,這可以是一個(gè)細(xì)胞基因(或者從該基因轉(zhuǎn)錄的mrna),它的表達(dá)與一種特殊的失調(diào)或病癥相聯(lián)系,或者可以是來自傳染試劑(infectiousagent)的一個(gè)核酸分子。在本發(fā)明中,靶是一種編碼結(jié)締組織生長因子的核酸。靶標(biāo)過程還包括確定該基因內(nèi)發(fā)生反義相互作用的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn),這樣來得到理想的結(jié)果,例如,蛋白質(zhì)表達(dá)的識(shí)別和調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的內(nèi)容之中,優(yōu)選的基因內(nèi)的位點(diǎn)是包含該基因的開放閱讀框架(openreadingframe,orf)的翻譯起始密碼子或翻譯終止密碼子的區(qū)域。如業(yè)內(nèi)所知曉的那樣,因?yàn)榈湫偷姆g起始密碼子是5’-aug(在轉(zhuǎn)錄的mrna分子中；5’-atg在相應(yīng)的dna分子中),所以,翻譯起始密碼子也稱之為“aug密碼子”,“開始密碼子”或者“aug開始密碼子”。少數(shù)的基因的翻譯起始密碼子具有rna序列5‘-gug,5’-uug或5’-cug,而且5’-aua,5’-acg,和5’-cug，已顯示出在體內(nèi)起作用。因而,術(shù)語“翻譯起始密碼子”和“開始密碼子”可包含許多的密碼子序列,盡管在每種情況下的啟動(dòng)氨基酸典型地是蛋氨酸(在真核生物中)或者甲酰蛋氨酸(formylmethionine)(在原核生物中)。業(yè)內(nèi)也熟知真核生物和原核生物的基因可以具有兩種或更多的可選的開始密碼子,它們的任何一種可以優(yōu)先用于在特定細(xì)胞類型或組織中,或者在一組特定的條件下的翻譯起始。在本發(fā)明的內(nèi)容中,“開始密碼子”和“翻譯起始密碼子”指的是用在體內(nèi)的,啟動(dòng)由編碼結(jié)締組織生長因子基因轉(zhuǎn)錄的mrna分子的翻譯,而不論這些密碼子的序列。

業(yè)內(nèi)也知曉基因的翻譯終止密碼子(或“終止密碼子”)可以具有三種序列之中的一種,即5’-uaa,5’-uag和5’-uga(相應(yīng)的dna序列分別為5’-taa,5’-tag和5’-tga)。術(shù)語“開始密碼子區(qū)域”和“翻譯起始密碼子區(qū)域”指的是這樣的mrna或基因的一個(gè)部分,它包含從一個(gè)翻譯起始密碼子算起往任一方向(即,5’或3’)大約25個(gè)至大約50個(gè)連續(xù)的(contiguous)核苷酸。同樣,術(shù)語“終止密碼子區(qū)域”和“翻譯終止密碼子區(qū)域”指的是這樣的mrna或基因的一個(gè)部分,它包含從一個(gè)翻譯終止密碼子算起往任一方向(即,5’或3’)大約25個(gè)至大約50個(gè)連續(xù)的核苷酸。

業(yè)內(nèi)已知曉開放閱讀框架(orf)或者“編碼區(qū)域”指的是翻譯起始密碼子與翻譯終止密碼子之間的區(qū)域,它也是個(gè)可以被有效定向的區(qū)域。其他的靶區(qū)域包括5’未翻譯的區(qū)域(5’-utr),業(yè)內(nèi)指的是從翻譯起始密碼子算起的mrna沿著5’方向上的一個(gè)部分,因而,它包括一個(gè)mrna或者基因上相應(yīng)核苷酸的5’-加帽位點(diǎn)(5'capsite)與翻譯起始密碼子之間的部分；以及3’未翻譯的區(qū)域(3’-utr),業(yè)內(nèi)指的是從翻譯終止密碼子算起的mrna沿著3’方向上的一個(gè)部分,因而,它包括一個(gè)mrna或者基因上相應(yīng)核苷酸的翻譯終止密碼子與3’末端之間的部分。mrna的5’帽結(jié)構(gòu)包含一個(gè)n7-甲基化的鳥嘌呤核苷殘基,它通過一個(gè)5’-5’的三磷酸鹽(triphosphate)連接與mrna的5’-most殘基結(jié)合在一起。mrna的5’帽區(qū)域被認(rèn)為是包括5’帽結(jié)構(gòu)本身以及緊接著該帽的最初50個(gè)核苷酸。5’帽區(qū)域可能也是個(gè)優(yōu)選的靶區(qū)域。

雖然某些真核生物的mrna轉(zhuǎn)錄物直接被翻譯,許多含有一個(gè)或多個(gè)稱之為“內(nèi)含子”的區(qū)域,它們在轉(zhuǎn)錄物被翻譯之前被切除。剩下的(因而被翻譯了)區(qū)域被稱之為“外顯子”,被剪接在一起形成一個(gè)連續(xù)的mrna序列。mrna剪接位點(diǎn),即內(nèi)含子-外顯子的接頭也可能是優(yōu)選的靶區(qū)域,當(dāng)在與疾病相關(guān)的異常剪接或者一種特殊的mrna剪接產(chǎn)物的生產(chǎn)過剩的情況下它們是特別有用處的。由于重排或缺失所造成的異常融合接頭也是優(yōu)選的靶。業(yè)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子也可能是有效的,因而是優(yōu)選的適合于反義化合物靶向dna或pre-mrna的靶區(qū)域。

業(yè)內(nèi)也知曉從dna的同一個(gè)基因組區(qū)域里可以產(chǎn)生出可替代的rna轉(zhuǎn)錄物。這些可替代的轉(zhuǎn)錄物統(tǒng)稱為“變異體”。更準(zhǔn)確地說,“pre-mrna變異體”產(chǎn)自同一基因組dna的轉(zhuǎn)錄物，它與產(chǎn)自同一基因組dna的其他轉(zhuǎn)錄物的不同之處在于,或者是它們的開始位置或者是它們的終止位置,以及它們含有內(nèi)含子區(qū)域與外顯子區(qū)域。

剪接過程中去除一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或者它們的部分時(shí),pre-mrna變異體產(chǎn)生出較小的“mrna變異體”。因此,mrna變異體是被加工過的pre-mrna變異體,作為剪接的結(jié)果,每個(gè)獨(dú)特的pre-mrna變異體一定總是產(chǎn)生出一個(gè)獨(dú)特的mrna變異體。這些mrna變異體也稱之為“可替代剪接變異體”。如果不存在pre-mrna變異體的剪接,則該pre-mrna變異體與mrna變異體一致。.

業(yè)內(nèi)也知曉可以通過利用替代的信號(hào)來開始或終止轉(zhuǎn)錄以生產(chǎn)變異體,而且,pre-mrna和mrna可以具有多于一個(gè)的開始密碼子或終止密碼子。來自利用替代開始密碼子的pre-mrna或mrna的生產(chǎn)處的變異體被稱之為該pre-mrna或mrna的“替代開始變異體”。那些利用替代終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物被稱之為該pre-mrna或mrna的“替代終止變異體”。替代終止變異體的一個(gè)特殊類型是“多聚腺苷酸變異體“(polyavariant),其中的許多個(gè)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物是由轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)替代選擇了“polya終止信號(hào)”的一個(gè)信號(hào)所引起的,從而生產(chǎn)出在獨(dú)特的polya位點(diǎn)上終止的轉(zhuǎn)錄物。

反義化合物一般被用作研究試劑和診斷學(xué)。例如,反義寡核苷酸能以敏銳的特異性來抑制基因的表達(dá),常被業(yè)內(nèi)人士用于解釋特殊基因的功能。反義化合物也被用于,例如區(qū)分生物途徑中各個(gè)成員的功能。因此,反義調(diào)整已經(jīng)被拿來作研究之用。

當(dāng)用于試驗(yàn)盒和診斷學(xué)時(shí),本發(fā)明的反義化合物既可以單獨(dú)也可以結(jié)合其他的反義化合物或療法,用作差異和/或組合分析的工具來解釋在細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因的一部分或整個(gè)補(bǔ)體的表達(dá)模式。

將在用一種或多種反義化合物處理過的細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)模式與未經(jīng)過反義化合物處理的對(duì)照的細(xì)胞或組織進(jìn)行比較,產(chǎn)生的模式被用于分析它們的基因表達(dá)的差異水平是屬于,例如,與疾病有關(guān),信號(hào)傳輸途徑,細(xì)胞定位,表達(dá)水平,所檢驗(yàn)的基因的大小,結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可以在受激的或未受激的細(xì)胞上進(jìn)行,可以有或者沒有影響表達(dá)模式的其他化合物存在下進(jìn)行。

業(yè)內(nèi)知曉的基因表達(dá)分析方法的例子包括dna陣列或微陣列(brazmaandvilo,fedslett.,2000,480,17-24；celis,etal.,febslett.,2000,480,2-16),saga(serialanalysisofgeneexpression)(基因表達(dá)的系列分析)(madden,etal.,drugdiscov.today,2000,5,415-425),reads(restrictionenzymeamplificationofdigestedcdnas)(消化的cdnas的限制性酶擴(kuò)增)(prasharandweissman,methodsenzymol.,1999,303,258-72),toga(totalgeneexpressionanalysis)(全基因表達(dá)分析)(sutcliffe,etal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.2000,97,1976-81),蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(proteinarraysandproteomics)(celis,etal.,febslett.,2000,480,2-16；jungblut,etal.,electrophoresis,1999,20,2100-10),表達(dá)序列標(biāo)記物(expressedsequencetag)(est)測序(celis,etal.,febslett.,2000,480,2-16；larsson,etal.,j.biotechnol.,2000,80,143-57),相減rna指紋圖譜(subtractivernafingerprinting)(surf)(fuchs,etal.,anal.biochem.,2000,286,91-98；larson,etal.,cytometry,2000,41,203-208),相減克隆(subtractivecloning),差異顯示(differentialdisplay)(dd)(jurecicandbelmont,curr.opin.microbiol.,2000,3,316-21),比較基因組雜交(carrrrrrrulli,etal.,j.cellbiochem.suppl.,1998,31,286-96),fish(fluorescentinsituhybridization)(熒光原位雜交)技術(shù)(goingandgusterson,eur.j.cancer,1999,35,1895-904)以及質(zhì)譜方法(reviewedin(to,comb.chem.highthroughputscreen,2000,3,235-41)。

反義化合物

在本發(fā)明的內(nèi)容中,術(shù)語“寡核苷酸”指的是核糖核酸(rna)或者脫氧核糖核酸(dna)或者它們的模擬物的一種寡聚物或聚合物。該術(shù)語包括由天然存在的核堿基,糖類和共價(jià)核苷間(骨架)鍵合組成的寡核苷酸,以及具有非天然存在的但功能類似的部分的寡核苷酸。相對(duì)于天然形式,由于具有合乎理想的性質(zhì),像增強(qiáng)的細(xì)胞攝入,與核酸靶之間增強(qiáng)的親和力,以及核酸酶的存在下的穩(wěn)定性提高,所以通常優(yōu)選這種修飾的或取代的寡核苷酸。

盡管反義寡核苷酸是反義化合物一種優(yōu)選的形式,本發(fā)明還是包含了其他寡聚反義化合物,包括但不限寡核苷酸模擬物。

反義化合物指的是一種能與靶核酸通過氫鍵雜交的寡聚化合物。反義化合物包括但不限于寡核苷酸類,寡核苷類,寡核苷酸類似物,寡核苷酸模擬物,反義寡核苷酸類,sirna,rnai,核糖酶類(ribozymes),外部指導(dǎo)序列(externalguidesequence,egs)寡核苷酸類(oligozymes),和其他與靶核酸雜交并調(diào)控其表達(dá)的寡核苷酸類。

在某些實(shí)施例中,反義化合物具有一種核堿基序列,當(dāng)在5’至3’的方向上書寫時(shí),它包含它被靶向的靶核酸的靶片段的反向補(bǔ)體(reversecomplement)。在某些這樣的實(shí)施例中,反義寡核苷酸具有一種核堿基序列,當(dāng)在5’至3’的方向上書寫時(shí),它包含它被靶向的靶核酸的靶片段的反向補(bǔ)體。

在某些實(shí)施例中,靶向一種核酸的反義化合物的長度為12-30個(gè)亞單位。換言之,反義化合物是從12個(gè)至30個(gè)連接的亞單位。在其他的實(shí)施例中,反義化合物是8-80個(gè),12-50個(gè),15-30個(gè),18-24個(gè),19-22個(gè),或者20個(gè)連接的亞單位。在某些這樣的實(shí)施例中,反義化合物的長度是8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,或80個(gè)連接的亞單位,或者是由任何兩個(gè)上述數(shù)值定義的范圍。在某些實(shí)施例中,反義化合物是一種反義寡核苷酸,連接的亞單位是核苷酸。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,該化合物包含20個(gè)或者至少14個(gè)連接的核苷,其特征在于,修飾的寡核苷酸具有與seqidnos:28,30,39,40,45,52,56,78,125和166中的所提出的一個(gè)序列100％一致。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,感興趣的先導(dǎo)化合物具有seqidno:39中提出的序列(isis412294)。

在某些實(shí)施例中,一種靶向一種核酸的截短的(shortened)或缺失的(truncated)反義化合物具有一個(gè)亞單位從5’端缺失(5’truncation),或者就是從3’端缺失(3’truncation)。一種靶向一種核酸的截短的或缺失的化合物可以有兩個(gè)亞單位從該反義化合物的5’端,或者有兩個(gè)亞單位從該反義化合物的從3’端缺失?；蛘?該缺失的核苷可以分散在整個(gè)反義化合物中,例如,在一個(gè)反義化合物中,它有一個(gè)核苷從5’端缺失,一個(gè)核苷從3’端缺失。

當(dāng)一個(gè)伸長的反義化合物中存在有一個(gè)另外的亞單位時(shí),該另外的亞單位可以位于該反義化合物的5’端或者3’端。當(dāng)有兩個(gè)或更多另外的亞單位存在時(shí),增加的亞單位可以相互鄰接,例如,在一種有兩個(gè)加在該反義化合物的5’端上的亞單位(5’加成),或者加在3’端上的亞單位(3’加成)的反義化合物中?；蛘?該增加的亞單位可以分散在整個(gè)反義化合物中,例如,在一個(gè)反義化合物中,它有一個(gè)核苷加到5’端上,一個(gè)核苷加到3’端上。

有可能增加或減少像寡核苷酸那樣反義化合物的長度,和/或引入錯(cuò)配(mismatch)堿基而不消除活性。例如,woolf等(proc.natl.acad.sci.usa89:7305-7309,1992)測試了一系列長度為13-25個(gè)核堿基的反義寡核苷酸在注射卵母細(xì)胞的模式中誘導(dǎo)一種靶rna切割的能力。長度為25個(gè)核堿基,且在靠近該反義寡核苷酸端點(diǎn)處有8或11個(gè)錯(cuò)配的反義寡核苷酸，其能夠引導(dǎo)靶mrna的特異切割,雖然要比不含有錯(cuò)配的反義寡核苷酸的程度低。類似地,采用有13個(gè)核堿基的反義寡核苷酸,包括那些有1個(gè)或3個(gè)錯(cuò)配的反義寡核苷酸,實(shí)現(xiàn)了靶向特異切割。

gautschi等(j.natl.cancerinst.93:463-471，march2001)證實(shí)了一種寡核苷酸在體外和體內(nèi)降低bcl-2和bcl-xl表達(dá)的的能力,該寡核苷酸100％與該bcl-2mrna互補(bǔ)，并且對(duì)bcl-xlmrna有3個(gè)錯(cuò)配。更進(jìn)一步,證實(shí)了這種寡核苷酸在體內(nèi)具有強(qiáng)有力的抗癌活性。

maher和dolnick(nuc.acid.res.16:3341-3358,1988)分別試驗(yàn)了一系列串聯(lián)14個(gè)核堿基的反義寡核苷酸,以及有28個(gè)和42個(gè)核堿基的反義寡核苷酸,后兩種反義寡核苷酸由2個(gè)或3個(gè)該串聯(lián)反義寡核苷酸的序列組成,用以試驗(yàn)它們阻止人類dhpf在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞試驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄的能力。這三種14個(gè)核堿基反義寡核苷酸中的任意一種單獨(dú)就能抑制轉(zhuǎn)錄,雖然要比28個(gè)或42個(gè)核堿基的反義寡核苷酸的水平更加適度。

bhanot等(pct/us2007/068401)提供了短反義化合物,包括哪些包含化學(xué)修飾的高親和力單體,，其有8-16個(gè)單體的化合物。這些短反義化合物顯示出可用于減少細(xì)胞,組織和動(dòng)物的靶核酸和/或蛋白,提高了效力,改善了治療指數(shù)。短反義化合物在比上述的那些反義化合物劑量低時(shí)就有效果，可以降低毒性和治療成本。此外,所述的短反義化合物有更大的潛力作為口服藥劑。

雜交

一旦一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)被識(shí)別,就會(huì)選擇與靶足夠互補(bǔ)的寡核苷酸,即足夠好,足夠特異地與靶雜交,以獲得理想的效果。

在本發(fā)明的內(nèi)容中,“雜交”意指氫鍵,它們可以是互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基之間的watson-crick,hoogsteen或者反向hoogsteen氫鍵。例如,腺嘌呤與胸腺嘧啶是互補(bǔ)核堿基,它們通過形成氫鍵來配對(duì)。

在某些實(shí)施例中,雜交發(fā)生在此披露的一種反義化合物與一種核酸之間。雜交最常見的機(jī)理涉及核酸分子的互補(bǔ)核堿基之間的氫鍵。

雜交過程可以在各不相同的條件下發(fā)生。嚴(yán)格的條件是序列依賴性的,它們是由要雜交的核酸分子的性質(zhì)和組成來決定的。

確定一個(gè)序列對(duì)于一種靶核酸是否能特異地雜交的方法是業(yè)內(nèi)所熟知的。在一個(gè)實(shí)施例中,在此提供的一種反義化合物與一種核酸是能特異地雜交的。

互補(bǔ)

在此說的“互補(bǔ)”指的是兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如,在寡核苷酸的某一個(gè)位置上的核苷酸能與一種dna或rna分子同樣位置上的核苷酸形成氫鍵,則該寡核苷酸與dna或rna被認(rèn)為在那個(gè)位置上是互補(bǔ)的。當(dāng)在每個(gè)分子中有足夠數(shù)量的位置被能相互形成氫鍵的核苷酸占據(jù)時(shí),該寡核苷酸與dna或者rna是互補(bǔ)的。因而,“特異地可雜交的”和“互補(bǔ)”是用以表明互補(bǔ)性或者精確配對(duì)充分程度的術(shù)語,以致于在寡核苷酸與dna或者rna靶之間產(chǎn)生穩(wěn)定,特異的氫鍵。業(yè)內(nèi)懂得反義化合物的序列不必100％與其特異地可雜交的靶核酸的序列互補(bǔ)。當(dāng)該化合物結(jié)合到靶dna或rna分子上去時(shí),干擾了該靶dna或rna分子的正常功能,造成失去了效用,并且有充分程度的互補(bǔ)以避免該反義化合物與非靶序列之間在希望有特異結(jié)合的條件下,即在體內(nèi)試驗(yàn)或者治療處理中的生理?xiàng)l件下,以及在體外的試驗(yàn)中的試驗(yàn)條件下有非特異的結(jié)合,則一種反義化合物是特異地可雜交的。

本發(fā)明的與靶雜交并抑制該靶表達(dá)的反義和其他化合物是通過實(shí)驗(yàn)來識(shí)別的,在下文中這些化合物的序列作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例被識(shí)別。與這些優(yōu)選的序列互補(bǔ)的靶位點(diǎn)在下文中被稱之為“活性位點(diǎn)”,因此,它們是優(yōu)選的靶向位點(diǎn)。所以,本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例包含與這些活性位點(diǎn)雜交的化合物。

當(dāng)反義化合物有足夠數(shù)量的核堿基能與靶核酸相應(yīng)的核堿基形成氫鍵,這樣就產(chǎn)生了合乎理想的效果(例如,反義抑制一種像ctgf那樣的核酸的靶核酸),則一種反義化合物與一種靶核酸是互補(bǔ)的。

在一種反義化合物與一種ctgf核酸之間的非互補(bǔ)的核堿基可以被容許,只要該反義化合物保持能與靶核酸特異地雜交。另外,反義化合物可以越過ctgf核酸的一個(gè)或多個(gè)片段來進(jìn)行雜交,這樣一來,介于中間的或鄰接的片段就不會(huì)參與到雜交過程中(例如,一種環(huán)結(jié)構(gòu),錯(cuò)配或者發(fā)夾結(jié)構(gòu))。

在一個(gè)實(shí)施例中,在此提供的反義化合物至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％與一種ctgf核酸互補(bǔ)?？梢圆捎贸Ｒ?guī)方法來確定一種反義化合物與一種靶核酸互補(bǔ)的百分程度。

例如,一種反義化合物有20個(gè)核堿基,其中的18個(gè)與一種靶核酸互補(bǔ),因而,它將會(huì)特異地雜交,將會(huì)代表了90％的互補(bǔ)度。在該實(shí)施例中,剩下的非互補(bǔ)的堿基可以被群集成簇或者與互補(bǔ)的核堿基散布開來,不必相互鄰接或者與互補(bǔ)的核堿基鄰接。同樣地,一種其長度為18個(gè)核堿基的反義化合物有4個(gè)非互補(bǔ)的核堿基,這4個(gè)非互補(bǔ)的核堿基與兩個(gè)完全與靶核酸互補(bǔ)的區(qū)域側(cè)面相接,該反義化合物應(yīng)當(dāng)會(huì)有77.8％總的互補(bǔ)度,因而位于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一種反義化合物與靶核酸的一個(gè)區(qū)域的百分互補(bǔ)度的確定可以例行采用業(yè)內(nèi)知曉的blast程序(basiclocalalignmentsearchtools)和powerblast程序(altschuletal.,j.mol.biol.1990,215,403-410；zhangandmadden,genomeres.,1997,7,649-656)。百分同源性,序列一致性或互補(bǔ)度可以通過例如,gap程序(wisconsin序列分析軟件包,version8forunix,geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwis.),采用默認(rèn)設(shè)置來確定,它是利用smith和waterman算法(adv.appl.maath.,1981,2,482-489)。

在其他的實(shí)施例中,在此提供的反義化合物與靶核酸完全互補(bǔ)(即100％互補(bǔ))。例如,反義化合物可以完全與ctgf核酸互補(bǔ),或者是它的一個(gè)靶部分,或者一個(gè)靶片段或靶序列互補(bǔ)。在此所說的“完全互補(bǔ)”指的是反義化合物的每個(gè)核堿基能與靶核酸相應(yīng)的核堿基精確堿基配對(duì)。

非互補(bǔ)的核堿基可以位于反義化合物的5’端或3’端?；蛘?非互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)核堿基可以位于反義化合物里邊的位置。當(dāng)有兩個(gè)或更多個(gè)非互補(bǔ)的核堿基存在時(shí),他們可以鄰接(即連接的)或者不鄰接的。在一個(gè)實(shí)施例中,一個(gè)非互補(bǔ)的核堿基位于gapmer反義寡核苷酸的翼段。

在一個(gè)實(shí)施例中,長度達(dá)20個(gè)核堿基的反義化合物包含不多于4個(gè),不多于3個(gè),不多于2個(gè),不多于1個(gè)的相對(duì)于如ctgf核酸那樣的靶核酸的非互補(bǔ)核堿基。

在另外一個(gè)實(shí)施例中,長度達(dá)30個(gè)核堿基的反義化合物包含不多于6個(gè),不多于5個(gè),不多于4個(gè),不多于3個(gè),不多于2個(gè),不多于1個(gè)的相對(duì)于如ctgf核酸那樣的靶核酸的非互補(bǔ)核堿基。

在此提供的反義化合物也包括那些與靶核酸的一部分互補(bǔ)的反義化合物。在此所說的“部分”指的是在靶核酸的一個(gè)區(qū)域或片段內(nèi)規(guī)定數(shù)量的鄰接的(即連接的)核堿基。一個(gè)“部分”也可以指一種反義化合物的定義數(shù)量的鄰接核堿基。在一個(gè)實(shí)施例中,該反義化合物與靶片段的一個(gè)至少有8個(gè)核堿基的部分互補(bǔ)。在另外一個(gè)實(shí)施例中,該反義化合物與靶片段的一個(gè)至少有12個(gè)核堿基的部分互補(bǔ)。在還有一個(gè)實(shí)施例中,該反義化合物與靶片段的一個(gè)至少有15個(gè)核堿基的部分互補(bǔ)。還注視到那些反義化合物，其與靶片段的一個(gè)至少有9，10，11，12,13，14，15,16，17，18，19,20個(gè)或更多個(gè)核堿基的部分,或者由任意兩個(gè)這些數(shù)值所規(guī)定的范圍互補(bǔ)。

一致性

在此提供的反義化合物也可以有一個(gè)明確表示的對(duì)于一個(gè)特定核苷酸序列,seqidno,或者用一個(gè)特定isis號(hào)碼代表的化合物的百分一致性。如果一種反義化合物具有同樣的核堿基配對(duì)能力,在在此就說它與在此披露的系列一致。例如,一種rna含有尿嘧啶代替了披露出的dna序列中的胸腺嘧啶脫氧核苷,該rna則應(yīng)該被認(rèn)為與該dna序列一致,因?yàn)槟蜞奏ず托叵汆奏っ撗鹾塑斩寂c腺嘌呤配對(duì)。也注視到在此描述的反義化合物截短的或伸長的版本,以及具有與在此提供的反義化合物不一致的堿基的化合物。不一致的堿基可以互相鄰接或者分散在整個(gè)反義化合物中。反義化合物的百分一致性是按照具有的同一堿基配對(duì)的堿基數(shù)目相對(duì)于與之相比較的序列來計(jì)算。

在一個(gè)實(shí)施例中,反義化合物至少70％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％與在此披露的一個(gè)或更多個(gè)反義化合物,或者seqidnos,或者它們得一個(gè)部分一致。

修飾

在本發(fā)明的某實(shí)施例中,對(duì)于反義化合物的修飾包含取代或者對(duì)核苷之間的連接,糖組成部分,或核堿基的改變。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該化合物包含至少一項(xiàng)修飾,該修飾選自修飾的核苷間連接,修飾的糖,和修飾的核堿基組成的一組。

雖然可以采用含有各種各樣修飾核苷間連接的反義寡核苷酸,目前優(yōu)選的修飾核苷間連接是一種在一個(gè)或多個(gè)核苷之間的硫代磷酸酯(phosphothioate)連接,或者,其中所有的核苷間連接都是硫代磷酸酯核苷間連接。一般地,也優(yōu)選含有至少一個(gè),而且典型地多于一個(gè)的修飾糖的反義寡核苷酸,其特征在于該糖是一種二環(huán)糖。盡管可以采用各種各樣的修飾糖,現(xiàn)在還是優(yōu)選采用2’-o-甲氧基乙基糖。

更進(jìn)一步,包含在反義寡核苷酸中的至少一個(gè),而且典型地多于一個(gè)的核堿基將是一種修飾的核苷酸,像5-甲基胞嘧啶。

核苷是一種堿-糖的結(jié)合物。核苷的核堿基(也稱之為堿基)部分通常是一個(gè)雜環(huán)堿基組成部分。核苷酸是進(jìn)一步還包括一個(gè)共價(jià)地鍵合在核苷的糖的部分的磷酸酯基的核苷。對(duì)于那些包括五元呋喃(pentofuranosyl)糖的核苷,該磷酸酯基可以連接在該糖的2’,3’或5’-位羥基組成部分上。寡核苷酸是通過相鄰核苷互相共價(jià)連接以形成線性多聚的寡核苷酸來形成的。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi),磷酸酯基通常被稱之為形成了寡核苷酸的核苷間的連接。

對(duì)反義化合物的修飾包含取代或者改變核苷之間的連接,糖組成部分,或核堿基。經(jīng)過修飾的反義化合物往往優(yōu)于原來的形態(tài),這是因?yàn)榫哂泻虾趵硐氲男再|(zhì),像增強(qiáng)的細(xì)胞攝入,與核酸靶之間增強(qiáng)的親和力,以及核酸酶(nucleases)的存在下的穩(wěn)定性提高,或者抑制活性的提高。

也可以采用化學(xué)修飾核苷來提高截短的或缺失的反義寡核苷酸對(duì)于其靶核酸的結(jié)合親和力。因此,經(jīng)常能獲得具有那樣的化學(xué)修飾核苷的較短的反義化合物的可比較的結(jié)果。

修飾的核苷酸間連接

天然存在的rna和dna的核苷間連接是一種3’到5’的磷酸二酯鍵。通常選擇具有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的,即非天然存在的核苷間連接的反義化合物,而非選擇具有天然存在的核苷間連接的反義化合物，這是由于其合乎理想的性質(zhì),像增強(qiáng)的細(xì)胞攝入,與核酸靶之間增強(qiáng)的親和力,以及核酸酶的存在下的穩(wěn)定性提高。

具有修飾的核苷間連接的寡核苷酸包括保留一個(gè)磷原子的核苷間連接以及沒有一個(gè)磷原子的核苷間連接。有代表性的含磷核苷間連接包括,但不限于磷酸二酯,磷酸三酯,甲基磷酸酯(methylphosphonates),氨基磷酸酯(phosphoramidate),和硫代磷酸酯。制備含磷和不含磷的連接的方法是大家熟知的。

在一個(gè)實(shí)施例中,靶向ctgf核酸的反義化合物包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷間連接。在一些實(shí)施例中,修飾核苷間連接是硫代磷酸酯鍵。在其他實(shí)施例中,反義化合物的每個(gè)核苷間連接是硫代磷酸酯鍵。

如業(yè)內(nèi)所知,核苷是一種堿-糖的結(jié)合物。核苷的堿基部分通常是一個(gè)雜環(huán)堿基。兩類最普通的這樣的雜環(huán)堿基是嘌呤類和嘧啶類。核苷酸是進(jìn)一步還包括一個(gè)共價(jià)地鍵合在核苷的糖的部分的磷酸酯基的核苷。對(duì)于那些包括五元呋喃糖的核苷,該磷酸酯基可以鍵合在該糖的2’,3’或5’-位羥基組成部分上。在形成寡核苷酸時(shí),磷酸酯基通過相鄰核苷互相共價(jià)連接以形成一種線型聚合物。隨后,該線型聚合物結(jié)構(gòu)的各端可以連接起來形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu),但是,一般優(yōu)選開放的線型結(jié)構(gòu)。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi),該磷酸酯基常被稱之為形成了寡核苷酸的核苷間的骨架。rna和dna正常的連接或骨架是一種3’到5’的磷酸二酯鍵。

可用于本發(fā)明的優(yōu)選的反義化合物的特別的例子包括包含有修飾骨架或非天然核苷間連接的寡核苷酸。如在本說明書中所定義，具有修飾骨架的寡核苷酸包括那些骨架中保留有一個(gè)磷原子以及骨架中沒有一個(gè)磷原子的骨架。為了本說明書的目的，以及有時(shí)業(yè)內(nèi)所參考，在其核苷間骨架中沒有一個(gè)磷原子的修飾的寡核苷酸也被認(rèn)為是寡核苷。

優(yōu)選的修飾寡核苷酸骨架包括但不限于,例如硫代磷酸酯類,手性硫代磷酸酯類,二硫代磷酸酯類,磷酸三酯類,氨烷基磷酸三酯類(aminoalkylphosphotriesters),磷酸甲酯和其他的烷基酯類,包括3’-亞烷基(alkylene)磷酸酯類,5’-亞烷基磷酸酯類和手性磷酸酯類,次磷酸酯類(phosphinates),氨基磷酸酯類,包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯類(aminoalkylphosphoramidates),硫羰氨基磷酸酯類(thiono-phosphoramidates),硫羰磷酸烷基酯類(thionoalkylphosphonates),硫羰磷酸烷基三酯類(thionoalkylphospho-triesters),硒代磷酸酯類(selenophosphates)和硼代磷酸酯類(boranophosphates),上述這些酯類具有正常3’-5’連接，這些化合物的2’-5’結(jié)合類似物,以及那些具有反轉(zhuǎn)極性的化合物,其特征在于,一個(gè)或多個(gè)連接是3’-3’,5’-5’或者2’-2’連接。優(yōu)選的具有反轉(zhuǎn)極性的寡核苷酸在3’-most核苷酸間的連接上包含單一的3’-3’連接,即一個(gè)單一的反轉(zhuǎn)核苷殘基,它可能是脫堿基的(核堿基丟失或者用一個(gè)羥基來替代)。各種各樣的鹽類,混合的鹽類和游離酸形式也都包括在其中。

講授上述含磷連接制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于,u.s.pat.nos:3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，它們中的某一些本發(fā)明所共同,這些專利每篇都被結(jié)合于此作為參考。

優(yōu)選的其中不含磷原子的修飾寡核苷酸骨架具有由短鏈烷基或者環(huán)烷基核苷間連接,混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基的核苷間連接,或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷連接構(gòu)成的骨架。這些還包括那些具有嗎啉代連接(部分地是由核苷的糖部分形成的)；硅氧烷骨架(siloxane)；硫化物(sulfide),亞砜(sulfoxide)和砜(sulfone)骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亞甲基(methylene)formacetyl和thioformacetyl骨架；riboacetyl骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；及其他具有混合的n,o,s和`ch2成分部分的骨架。

講授上述寡核苷制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于,u.s.pat.nos:5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269；和5,677,439，它們中的某一些本發(fā)明所共有,每個(gè)這些專利都被結(jié)合于此作為參考。

在其他的優(yōu)選寡核苷酸模擬物中,核苷酸單位的糖和核苷間連接,即骨架,都用新穎的基團(tuán)替代掉。堿基單位保持下來與合適的核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物,一種已經(jīng)顯示出具有優(yōu)異的雜交性能的寡核苷酸模擬物被稱之為肽核酸(peptidenucleicacid,pna)。在pna化合物中,寡核苷酸的糖骨架被一個(gè)含酰胺的骨架,特別是,被一個(gè)氨乙基甘氨酸(aminoethylglycine)骨架所替代。核堿基被保留下來,并直接或間接地與骨架酰胺部分的氮雜氮原子(azanitrogenatoms)相連。講授pna化合物制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于,u.s.pat.nos:5,539,082；5,714,331；和5,719,262,這些專利每篇都被結(jié)合于此作為參考。還可以在nielsenetal.,science,1991,254,1497-1500中找到關(guān)于pna化合物的講授。

大多數(shù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸類和具有雜原子骨架的寡核苷類,特別是,上述參考的美國專利u.s.pat.no.5,489,677的-ch2-nh-o-ch2-,-ch2-n(ch3)-o-ch2-[稱之為亞甲基(甲基亞氨基)或mmi骨架],-ch2-o-n(ch3)-ch2-,-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-[其中,原本的磷酸酯骨架被表示為–o-p-o-ch2-],以及上述參考的美國專利u.s.pat.no.5,602,240的酰胺骨架。還優(yōu)選的是上述參考的美國專利u.s.pat.no.5,034,506的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸類。

修飾糖組成部分

修飾寡核苷酸類也可以含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖組成部分。例如,呋喃糖(furanosylsugar)環(huán)可以利用多種方法來修飾,包括用取代基來取代,橋聯(lián)以形成一種二環(huán)核酸“bna”(bicyclicnucleicacid),以及如頒授給seth等的美國專利u.s.pat.no.:7,399,845中描述的,并全部被結(jié)合于此作為參考的,利用像s或n(r)那樣的雜原子來取代4’-o。其他關(guān)于bna的例子可見國際專利申請(qǐng)?zhí)杦o2007/146511的出版物,全部被結(jié)合于此作為參考。

本發(fā)明的反義化合物可選地可以含有一個(gè)或多個(gè)具有修飾糖組成部分的核苷酸。糖修飾可以賦予反義化合物核酸酶穩(wěn)定性,結(jié)合親和力或者一些其他有益的生物特性。核苷的呋喃糖環(huán)可以利用多種方法來修飾,包括單不限于:加入一個(gè)取代基,特別是在2’位置上；橋接兩個(gè)不成對(duì)(non-geminal)環(huán)的原子以形成一種二環(huán)核酸(bna)；利用一個(gè)原子或者像-s-,-n(r)-或–c(r1)(r2)那樣的基團(tuán)來取代環(huán)上4’位置的o。修飾糖包括但不限于:取代糖,尤其是具有2’-f,2’-och2(2’-ome)或者2’-o(ch2)2-och3(2’-o-甲氧基乙基或2’-moe)取代基的2’-取代糖；以及具有4’-(ch2)n-o-2’橋接的二環(huán)糖類(bnas),其中n＝1或n＝2。制備修飾糖的方法是業(yè)內(nèi)人士所熟知的。

在某些實(shí)施例中,2’-修飾核苷具有一個(gè)二環(huán)糖組成部分。在某些這樣的實(shí)施例中,該二環(huán)糖組成部分是一種α-d-糖。在某些這樣的實(shí)施例中,該二環(huán)糖組成部分是一種β-d-糖。在某些這樣的實(shí)施例中,該二環(huán)糖組成部分是一種α-l-糖。在某些這樣的實(shí)施例中,該二環(huán)糖組成部分是一種β-l-糖。

在某些這樣的實(shí)施例中,該二環(huán)糖組成部分包含在2’-c原子與4’-c原子間的橋接基團(tuán)。在某些這樣的實(shí)施例中,該橋接基團(tuán)包含從1至8個(gè)連接的雙自由基(biradical)基團(tuán)。在某些實(shí)施例中,該橋接基團(tuán)包含從1至4個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)。在某些實(shí)施例中,該橋接基團(tuán)包含2個(gè)或3個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)。在某些實(shí)施例中,該橋接基團(tuán)包含2個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)。在某些實(shí)施例中,一個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)選自–o-,-s-,-n(r1)-,-c(r1)(r2)-,-c(r1)＝c(r1)-,-c(r1)＝n-,-c(＝nr1)-,-si(r1)(r2)-,-s(＝o)2-,-s(＝o)-,_c(＝o)-和-c(＝s)-；式中,每個(gè)r1和r2是獨(dú)立的,h,羥基,c1-c12烷基,取代的c1-c12烷基,c2-c12鏈烯基,取代的c2-c12鏈烯基,c2-c12炔基,取代的c2-c12炔基,c5-c20芳基,取代的c5-c20芳基,雜環(huán)自由基(radical),取代的雜環(huán)自由基,雜芳基(heteroaryl),取代的雜芳基,c5-c7脂環(huán)自由基,取代的c5-c7脂環(huán)自由基,鹵素,取代的氧代(-o-),氨基,取代的氨基,疊氮基(azido),羧基,取代的羧基,酰基,取代的?；?cn,硫羥(thiol),取代的硫羥,磺?；?s(＝o)2-h),取代的磺?；?砜基(sulfoxyl)(s(＝o)-h)或取代的砜基(s(＝o)-h)；而且,每個(gè)取代基各自獨(dú)立的是鹵素,c1-c12烷基,取代的c1-c12烷基,c2-c12鏈烯基,取代的c2-c12鏈烯基,c2-c12炔基,取代的c2-c12炔基,氨基,取代的氨基,?；?取代的?；?c1-c12氨烷基,c1-c12氨代烷氧基,取代的c1-c12氨烷基,取代的c1-c12氨代烷氧基或者一種保護(hù)基團(tuán)。

在某些實(shí)施例中,該二環(huán)糖組成部分利用一個(gè)雙自由基基團(tuán)被橋接在2’與4’位置之間,該雙自由基基團(tuán)選自-o-(ch2)p-,-o-ch2-,-o-ch2ch2-,-o-ch(alkyl)-,-nh-(ch2)p-,-n(alkyl)-(ch2)p-,-o-ch(alkyl)-,-(ch(alkyl))-(ch2)p-,-nh-o-(ch2))p-,n(alkyl)-o-(ch2)p-,或者-o-n(alky)-(ch2)p-,式中的p為1,2,3,4或者5,每個(gè)烷基(alkyl)還可以被進(jìn)一步取代。在某些實(shí)施例中,p為1,2或者3。

一方面,每個(gè)所說的橋接獨(dú)立地是–[c(r1)(r2)]]n-,-[c(r1)(r2)]n-o-,-c(r1r2)-n(r1)-o-或者-c(r1r2)-o-n(r1)-。另一方面,每個(gè)所說的橋接獨(dú)立地是4’-(ch2)3-2’,4’-(ch2)2-2’,4’-ch2-o-2’,4’-(ch2)2-o-2’,4’-ch2-o-n(r1)-2’和4’-ch2-n(r1)-o-2’,式中,每個(gè)r1獨(dú)立地是h,一種保護(hù)基團(tuán)或者c1-c12烷基。

在具有修飾糖組成部分的核苷酸中,核堿基組成部分(天然的,修飾的或者它們二者的結(jié)合)保持與合適的核酸靶雜交。

在一個(gè)實(shí)施例中,靶向核酸的反義化合物包含一個(gè)或多個(gè)具有修飾糖組成部分的核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,修飾糖組成部分是2’-moe。在另外一個(gè)實(shí)施例中,該2’-moe修飾核苷酸被配置在一個(gè)gapmer模體中。

目前優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置上包含有以下基團(tuán)之一種:oh；f；o-,s-,或n-烷基；o-,s-,或n-鏈烯基；o-,s-,或n-炔基；或o-烷基-o-烷基,式中,烷基,鏈烯基和炔基可以是取代的或未取代的c1-c10烷基或者c2-c10鏈烯基和炔基。特別優(yōu)選的是o[(ch2)no]mch3,o(ch2)noch3,o(ch2)nnh2,o(ch2)nch3,o(ch2)nonh2,和o(ch2)non[(ch2)nch3]2,式中的n和m為從1至10左右。其他優(yōu)選的寡核苷酸包含如下的在2’位置上的基團(tuán)之一種:c1-c5低碳烷基,取代的低碳烷基,鏈烯基,炔基,烷芳基,芳烷基,o-烷芳基或者o-芳烷基,sh,sch3,ocn,cl,br,cn,cf3,ocf3,soch3,so2ch3,ono2,no2,n3,nh2,雜環(huán)烷基,雜環(huán)烷芳基,氨烷基氨基,多烷基氨基，取代的甲硅烷基,rna切割基團(tuán),報(bào)道基團(tuán)(reportergroup),嵌入劑,改善寡核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)性能的基團(tuán),或者改善寡核苷酸藥效學(xué)性能的基團(tuán),以及其他具有相同性質(zhì)的取代基團(tuán)。一種優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-o-ch2ch2och3,也稱為2’-o-(2-甲氧基乙基)或者2’-moe)(martinetal.,helv.chim.acta,1995,78,486-504),即一種烷氧基烷氧基基團(tuán)(alkoxyalkoxy)。還有一種修飾包括2’-二甲氨基氧乙氧基,即一個(gè)o(ch2)2on(ch3)2,也稱為2’-dmaoe,以及2’-二甲氨基乙氧基乙氧基(業(yè)內(nèi)也稱之為2’-o-二甲氨基乙氧基乙基,或者2’-dmaeoe),即2’-o--ch2--o--ch2--n(ch2)2。還有一個(gè)優(yōu)選的修飾包括二環(huán)核酸(也稱之為鎖定的核酸類(lockednucleicacids，lnas)),其中2’-羥基連接在糖環(huán)3’或4’的碳原子上形成一個(gè)雙環(huán)的糖組成部分。鍵合優(yōu)選橋接2’氧原子與4’碳原子的亞甲基(--ch2--)n,其中n為1或2,包括α-l-亞甲基氧(a-l-methyleneoxy)(4’-ch2-o-2’)bna,β-d-亞甲基氧(4’-ch2-o-2’)bna和亞乙基氧(ethyleneoxy)(4’-(ch2)2-o-2’)bna。二環(huán)修飾糖也包括(6’s)-6’甲基bna,氨基氧(aminooxy)(4’-ch2-o-n(r)-2’)bna,氧氨基(oxyamino)(4’-ch2-n(r)-o-2’)bna,式中,r獨(dú)立地是h,一種保護(hù)基團(tuán),或者c1-c12烷基。lnas也與互補(bǔ)的dna,rna或lna以高的熱親和力形成雙鏈體。圓二色性(circulardichroism,cd)光譜顯示涉及完全修飾的lna(特別是lna:rna)的雙鏈體在結(jié)構(gòu)上類似一種a型的rna:rna雙鏈體。對(duì)一種lna:dna雙鏈體的核磁共振(nuclearmagneticresonance,nmr)檢驗(yàn)肯定了lna單體的3’-內(nèi)向(3’-endo)構(gòu)象。雙鏈dna的識(shí)別也已經(jīng)證實(shí)了假定的lna鏈入侵。關(guān)于錯(cuò)配序列的研究顯示lnas遵循watson-crick堿基配對(duì)規(guī)則,與相應(yīng)的未修飾的參照鏈相比,它的選擇性一般較高。

lans中的2’-羥基與糖環(huán)的4’碳原子連接,形成2’-c,4’-c-氧亞甲基連接,如此形成了一個(gè)二環(huán)糖組成部分。反應(yīng)該連接可以是橋接2’氧原子與4’碳原子的亞甲基(-ch2-)n,其中n為1或2(singhetal.,chem.commun.,1998,4,455-456)。lna和lna類似物表現(xiàn)出非常高的與互補(bǔ)的dna和rna的雙鏈體熱穩(wěn)定性(tm＝+3-+10℃),抗3’-外切核苷酸(3'-exonucleolytic)降解的穩(wěn)定性以及良好的溶解性。其他優(yōu)選橋接集團(tuán)包括2’-脫氧-2’-ch2och2-4’橋接。關(guān)于lnas及其制備可見國際專利申請(qǐng)no.wo98/39353和wo99/14226的出版物。

其他優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基(2’-o-ch3),2’-氨丙氧基(2’-och2ch2ch2nh2),2’-烯丙基(2’-ch2-ch＝ch2),2’-o-烯丙基(2’-o-ch2-ch＝ch2)和2’-氟(2’-f)。2’-修飾可以在阿糖(arabino)(上邊)位置或者在核糖(ribo)(下邊)位置。優(yōu)選的2’-阿糖修飾是2’-f。也可以在寡核苷酸的其他位置上進(jìn)行類似的修飾,尤其是在3’末端核苷酸上或者在2’-5’連接的寡核苷酸中的糖的3’位上，以及5’末端核苷酸的5’位置上。寡核苷酸也可以具有糖模擬物或者替代物(有時(shí)指的是dna類似物),像環(huán)丁基組成部分來替代五元呋喃糖。講授這樣的修飾糖結(jié)構(gòu)制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于,u.s.pat.nos:4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920,它們中的某一些為本申請(qǐng)所共有,每個(gè)這些專利都被結(jié)合于此作為參考。在某些實(shí)施例中,核苷的修飾是把核糖基環(huán)用替代物環(huán)系統(tǒng),像嗎啉代環(huán),環(huán)己烯基環(huán),環(huán)己基環(huán)或者四氫吡喃基環(huán)來代替,例如有如以下結(jié)構(gòu)式中的一種:

業(yè)內(nèi)也知曉許多其他的二環(huán)和三環(huán)的糖替代物環(huán)系統(tǒng)可以用于修飾核苷,以結(jié)合到反義化合物中去(見綜述文章,例如:leumann,christianj.,)。這樣的環(huán)系統(tǒng)可以經(jīng)歷各種各樣另外的取代反應(yīng)來增強(qiáng)其活性。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該化合物包含至少一個(gè)四氫吡喃修飾核苷,其中,一個(gè)四氫吡喃環(huán)取代了呋喃糖環(huán)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中,其中至少一個(gè)四氫吡喃修飾核苷的每一個(gè)具有結(jié)構(gòu):

式中的bx是一個(gè)可選的保護(hù)性雜環(huán)堿基組成部分。

修飾核堿基

寡核苷酸也可以包括核堿基(業(yè)內(nèi)常簡稱之為“堿基”)修飾或取代。核堿基修飾物或者取代物與天然存在的或合成的未修飾核堿基在結(jié)構(gòu)上是可以辨別的,雖然從功能上講是可以互換的。天然的和修飾的核堿基都能參與到氫鍵中。這樣的核堿基修飾可以賦予反義化合物核酸酶穩(wěn)定性,結(jié)合親和力或者一些其他有益的生物學(xué)特性。修飾核堿基包括合成的和天然的核堿基,例如,像5-甲基胞嘧啶(5-me-c)。某些核堿基取代物,包括5-甲基胞嘧啶取代物,對(duì)于提高反義化合物與靶核酸的親和力特別有效。例如,5-甲基胞嘧啶取代物,已經(jīng)表現(xiàn)出提高了核酸雙鏈體的穩(wěn)定性0.6-1.2℃(sanghvi,y.s.,crooke,s.t.andlebleu,b.,eds.,antisenseresearchandapplications,crcpress,bocaraton,1993,pp.276-278)。

其他的未修飾核堿基包括5-羥甲基胞嘧啶,黃嘌呤,次黃嘌呤,2-氨基腺嘌呤,腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基及其他烷基的衍生物,腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基及其他烷基的衍生物,2-硫尿嘧啶,2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶,5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶,5-丙炔基(-c≡c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其他炔基衍生物,6-偶氮(6-azo)尿嘧啶,胞嘧啶和胸腺嘧啶,5-尿嘧啶(假尿嘧啶(pseudouracil)),4-硫尿嘧啶,8-鹵代,8-氨基,8-硫羥,8-硫代烷基,8-羥基和其他的8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤,5-鹵代,特別是5-溴,5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶,7-甲基鳥嘌呤,7-甲基腺嘌呤,2-f-腺嘌呤,2-氨基-腺嘌呤,8-氮雜鳥嘌呤(8-azaguanine)和8-氮雜腺嘌呤(8-azaadenine),7-脫氮腺嘌呤(7-deazaguanine)和7-脫氮尿嘌呤(7-deazaadenine)以及3-脫氮腺嘌呤和3-脫氮尿嘌呤。

雜環(huán)堿基組成部分也可以包括那些其中的嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環(huán)替代的組成部分,例如,7-脫氮腺嘌呤,7-脫氮鳥嘌呤核苷,2-氨基吡啶和2-吡啶酮(pyridone)。對(duì)于提高反義化合物的親和力特別有效的核堿基包括5-取代的嘧啶,6-氮雜嘧啶以及n-2,n-6和o-6取代的嘌呤,包括2-氨丙基腺嘌呤,5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。

在一個(gè)實(shí)施例中,靶向ctgf核酸的反義化合物包含一個(gè)或多個(gè)修飾核堿基。在另外一個(gè)實(shí)施例中,靶向ctgf核酸的缺口放寬的(gap-widened)反義寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核堿基。在某些實(shí)施例中,修飾的核堿基是5-甲基胞嘧啶。在還有的實(shí)施例中,每個(gè)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。

如這里所說的,“未修飾的”或者“天然的”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g),以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(t),胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修飾的核堿基包括合成的和天然的核堿基,像5-甲基胞嘧啶(5-me-c),5-羥甲基胞嘧啶,黃嘌呤,次黃嘌呤,2-氨基腺嘌呤,腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基及其他烷基的衍生物,腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基及其他烷基的衍生物,2-硫尿嘧啶,2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶,5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶,5-丙炔基(-c≡c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其他炔基衍生物,6-偶氮尿嘧啶,胞嘧啶和胸腺嘧啶,5-尿嘧啶(假尿嘧啶),4-硫尿嘧啶,8-鹵代,8-氨基,8-硫羥,8-硫代烷基(thioalkyl),8-羥基和8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤,5-鹵代,特別是5-溴,5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶,7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤,2-f-腺嘌呤,2-氨基-腺嘌呤,8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤,7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。更多的修飾核堿基包括三環(huán)嘧啶類,像吩噁嗪(phenoxazine)胞嘧啶核苷(1h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3h)–酮(lh-pyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3h)-one)),吩噻嗪(phenothiazine)胞嘧啶核苷(1h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3h)–酮(ih-pyrimido[5,4-b][1,4]benzothiazin-2(3h)-one)),g-夾類(g-clamps),像取代的吩噁嗪胞嘧啶核苷(例如9-(2-氨乙氧基)-h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3h)–酮(9-(2-aminoethoxy)-h-pyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3h)–one)),咔唑(carbazol)胞嘧啶(2h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮(2h-pyrimido[4,5-b]indol-2-one)),吡啶并吲哚(pyridoindole)胞嘧啶(h-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮(h-pyrido[3',2':4,5]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-one))。修飾的核堿基類也可以包括那些其中的嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環(huán)替代的組成部分,例如,7-脫氮腺嘌呤,7-脫氮鳥嘌呤,2-氨基吡啶和2-吡啶酮。更多的核堿基包括那些披露在美國專利u.s.pat.no.3,687,808,那些披露在theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering,pp858-859,kroschwitz,j.i.,ed.johnwiley&sons,1990,那些披露在englisch等人的angewandtechemie,internationaledition,1991,30,613,以及那些披露在sanghvi,y.s.,charpter15,antisenseresearchandapplications,pp289-302,crooke,s.t.andlebleu,b.,eds.,crcpress,bocaraton,1993中的核堿基。

這些核堿基中的某一些對(duì)于提高本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力(bindingaffinity)是特別有效的。這些堿基包括5-取代的嘧啶,6-氮雜嘧啶以及n-2,n-6和o-6取代的嘌呤,包括2-氨丙基腺嘌呤,5-丙炔基尿嘧啶和5-炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代物已經(jīng)表現(xiàn)出提高了核酸雙鏈體的穩(wěn)定性0.6-1.2℃(sanghvi,y.s.,crooke,s.t.andlebleu,b.,eds.,antisenseresearchandapplications,crcpress,bocaraton,1993,pp.276-278),是目前優(yōu)選的堿基取代物,更具體地是當(dāng)與2’-o-甲氧基乙基糖的修飾物結(jié)合在一起時(shí)。

講授某些上述修飾核堿基以及其他修飾核堿基制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于上述的u.s.pat.no:3,687,808,以及u.s.pat.nos:4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；和5,681,941，這些專利中的某些為本申請(qǐng)所共有,每個(gè)這些專利都被結(jié)合于此作為參考,u.s.pat.no:5,750,692的擁有者與本申請(qǐng)的擁有者相同,也被結(jié)合于此作為參考。

反義化合物模體

在本發(fā)明的某些實(shí)施例中,該化合物包含一種修飾寡核苷酸,它由以下所組成:(a)由連接的脫氧核苷組成的缺口(gap)片段,優(yōu)選由13個(gè)連接的脫氧核苷組成；(b)由連接的修飾核苷組成的5’翼(wing)片段,優(yōu)選由兩個(gè)連接的修飾核苷組成；和(c)由連接的修飾核苷組成的3’翼片段,優(yōu)選由五個(gè)連接的修飾核苷組成；其特征在于,該缺口片段位于該5’翼片段與3’翼片段之間,其特征在于,每個(gè)翼片段中的每個(gè)修飾核苷包含一個(gè)修飾糖,優(yōu)選白2’-o-甲氧基乙基糖；以及其特在在于,每個(gè)核苷之間的連接是硫代磷酸酯連接。在反義化合物中修飾核苷的這些類型模式被稱之為模體(motifs)。這些模體賦予反義化合物特性以增強(qiáng)抑制活性,提高與靶核酸結(jié)合的親和力,或者增強(qiáng)抵抗在體內(nèi)由于核酸酶造成的降解。

在某些實(shí)施例中，靶向一個(gè)ctgf核酸的反義化合物具有修飾的亞單位，這些亞單位按照模式或者模體排列，以賦予反義化合物特性如增強(qiáng)抑制活性,提高與靶核酸結(jié)合的親和力,或者抵抗在體內(nèi)由于核酸酶造成的降解。

嵌合反義化合物典型地含有至少一個(gè)區(qū)域，其被修飾,結(jié)果賦予了提高對(duì)核酸酶降解的抵抗力,提高的細(xì)胞攝入,提高的對(duì)靶核酸的結(jié)合親和力,和/或升高的抑制活性。嵌合反義化合物的第二個(gè)區(qū)域可選地可以作為一種細(xì)胞核酸內(nèi)切酶rnaseh的底物,它切割rna:dna雙鏈體的rna鏈。

具有g(shù)apmer模體的反義化合物被認(rèn)為是嵌合反義化合物。在gapmer中,一個(gè)具有多個(gè)支持rnaseh切割的核苷的內(nèi)部區(qū)域位于具有多個(gè)化學(xué)上與內(nèi)部區(qū)域中的核苷不同的核苷的外部區(qū)域。在具有g(shù)apmer模體的反義化合物的情況下,缺口片段通常作為核酸內(nèi)切酶切割的底物,而翼片段包含修飾核苷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,gapmer的各區(qū)域通過包含每個(gè)獨(dú)特區(qū)域的糖組成部分的類型來加以區(qū)分。在一些實(shí)施例中用來區(qū)分gapmer各區(qū)域的糖組成部分的類型包括β-d-核糖核苷,β-d-脫氧核糖核苷,2’-修飾核苷(這樣的2’-修飾核苷尤其可以包括2’-moe,和2’-o-ch3，除其他的外),和二環(huán)糖修飾核苷(這樣的二環(huán)糖修飾核苷可以包括那些具有4’-(ch2)n-o-2’橋接的,n＝1或n＝2)。優(yōu)選地,每個(gè)獨(dú)特的區(qū)域包含同樣的糖組成部分。翼-缺口-翼模體常被描述為“x-y-z”,其中“x”表示5’翼區(qū)域的長度,“y”表示缺口區(qū)域的長度,“z”表示3’翼區(qū)域的長度。在此所描述的任意反義化合物可以具有g(shù)apmer模體。在某些實(shí)施例中,x和z相同,在另一些實(shí)施例中,它們是不同的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,y為8-15個(gè)核苷酸。x,y或z可以是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30任意一個(gè)數(shù)或更多個(gè)核苷酸。這樣一來,本發(fā)明的gapmer包括,但不限于,例如2-13-5，5-10-5,4-8-4,4-12-3,4-12-4,3-14-3，2-16-2,1-18-1,3-10-3,2-10-2,1-10-1或者2-8-2。

在某些實(shí)施例中,以一種“wingmer”模體的反義化合物具有翼-缺口或者缺口-翼構(gòu)型,即如同上述gapmer構(gòu)型的x-y或y-x構(gòu)型。如此,本發(fā)明的wingmer構(gòu)型包括,但不限于,例如5-10,8-4,4-12,12-4,3-14,16-2,18-1,10-3,2-10,1-10或8-2。

在一個(gè)實(shí)施例中,靶向核酸的反義化合物具有5-10-5的gapmer構(gòu)型。

在某些實(shí)施例中,靶向核酸的一種反義化合物具有缺口放寬的模體。在另一個(gè)實(shí)施例中,靶向核酸的一種反義寡核苷酸具有缺口放寬的模體。

在一個(gè)實(shí)施例中,一種靶向核酸的缺口放寬的反義寡核苷酸具有一個(gè)有14個(gè)2’-脫氧核糖核酸的缺口片段,它位于有3個(gè)化學(xué)修飾核苷的兩個(gè)翼片段之間。在一個(gè)實(shí)施例中,化學(xué)修飾包含2’-糖修飾。在另一個(gè)實(shí)施例中,化學(xué)修飾包含2’-moe糖修飾。

具有g(shù)apmer模體的反義化合物被認(rèn)為是“嵌合的”反義化合物或者“嵌合體”,它含有兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)的獨(dú)特區(qū)域,每個(gè)至少由一個(gè)單體單位,即在寡核苷酸化合物的情況下是一個(gè)核苷酸,組成。這些寡核苷酸典型地含有至少一個(gè)修飾區(qū)域以賦予提高對(duì)核酸酶降解的抵抗力,細(xì)胞攝入的增加,與靶核酸結(jié)合親和力的提高,和/或抑制活性的增加。在一個(gè)給定的化合物中無需所有的位置都要一致地被修飾,事實(shí)上,一個(gè)以上的上述修飾可以被結(jié)合進(jìn)單一化合物中,或者甚至是寡核苷酸內(nèi)部的單一核苷中。

寡核苷酸的另外一個(gè)區(qū)域可以作為能切割rna:dna或者rna:rna雜交物的酶的底物。作為實(shí)施例,rnaseh是一種細(xì)胞內(nèi)切酶,它切割rna:dna雙鏈體的rna鏈。因此,rnaseh的活化導(dǎo)致rna靶的切割,從而大大地增強(qiáng)了寡核苷酸抑制基因表達(dá)的效率。因此,當(dāng)嵌合寡核苷酸類被采用時(shí),和與相同靶區(qū)域的雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸類相比,采用較短的寡核苷酸?？傻玫娇杀容^的結(jié)果。rna靶的切割可以利用常規(guī)的凝膠電泳法來檢測,需要時(shí)還可以結(jié)合業(yè)內(nèi)知曉的核酸雜交技術(shù)。

本發(fā)明的嵌合反義化合物可以被形成為兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸,修飾寡核苷酸,寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸模擬物的組合結(jié)構(gòu)。這樣的化合物也已經(jīng)被業(yè)內(nèi)稱之為雜交物或gapmer。講授這樣的雜交物結(jié)構(gòu)制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于u.s.pat.nos:5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，這些專利中的某些為本申請(qǐng)所共有,每個(gè)這些專利都被結(jié)合于此作為參考。

當(dāng)一種反義寡核苷酸具有g(shù)apmer模體時(shí),該缺口片段通常是作為核酸內(nèi)切酶切割的底物,而翼片段包含修飾核苷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,gapmer的各個(gè)區(qū)域通過包含每個(gè)獨(dú)特區(qū)域的糖組成部分的類型來加以區(qū)分。用來區(qū)分gapmer各區(qū)域的糖組成部分的類型可以包括β-d-核糖核苷,β-d-脫氧核糖核苷,2’-修飾核苷(這樣的2’-修飾核苷可以包括2’-moe),和二環(huán)糖修飾核苷。

本發(fā)明寡核苷酸的另外一種修飾涉及在該寡核苷酸上化學(xué)地連接上一個(gè)或多個(gè)能增強(qiáng)該寡核苷酸的活性和細(xì)胞分布或細(xì)胞攝入的組成部分或共軛物。本發(fā)明的化合物可以包含共價(jià)地結(jié)合在像伯羥基或仲羥基那樣的官能團(tuán)上的共軛物基團(tuán)。本發(fā)明中的共軛物基團(tuán)包括嵌合劑,報(bào)道分子(reportermolecules),聚胺類,聚酰胺類,聚乙二醇類,聚醚類,提高寡聚物藥效性能的基團(tuán),以及提高寡聚物藥物動(dòng)力學(xué)性能的基團(tuán)。典型的結(jié)合物基團(tuán)包括膽固醇類,類脂類,磷脂類,生物素,吩嗪(phenazine),葉酸酯(folate),菲啶(phenanthridine),蒽醌(anthraquinone),吖啶(acridine),熒光素類,若丹明類(rhodamines),香豆素類(coumarins),以及染料。在本發(fā)明的內(nèi)容中,提高藥效性能的基團(tuán)包括增進(jìn)寡聚物攝入,增強(qiáng)寡聚物抗降解能力和/或加強(qiáng)與rna的序列特異性雜交。在本發(fā)明的內(nèi)容中,提高藥物動(dòng)力學(xué)性能的基團(tuán)包括改善寡聚物攝入,分布,代謝或分泌的基團(tuán)。有代表性的共軛物基團(tuán)披露在1992年10約23日提交的國際專利申請(qǐng)pct/us92/09196中,披露的全部內(nèi)容被納入在此作為參考。共軛物部分包括但不限于像膽固醇那樣的類脂部分(letsingeretal.,proc.natl.acad.sci.usa,1989,86,6553-6556),膽酸(manoharanetal.,bioorg.med.chem.let.,1994,4,1053-1060),硫醚,例如,己基-s-三苯甲基硫醇(hexyl-s-tritylthiol)(manoharanetal.,ann.n.y.acad.sci.,1992,660,306-309；manoharanetal.,bioorg.med.chem.let.,1993,3,2765-2770),硫代膽固醇(thiocholesterol)(oberhauseretal.,nucl.acidsres.,1992,20,533-538),脂肪族鏈,例如,十二烷二醇或十一烷殘基(saison-behmoarasetal.,emboj.,1991,10,1111-1118；kabanovetal.,febslett.,1990,259,327-330；svinarchuketal.,biochimie,1993,75,49-54),磷脂,例如雙十六烷基-rac-甘油(di-hexadecyl-rac-glycerol)或者三乙基銨,1,2-二-o-十六烷基-rac-甘油基-3-h-膦酸酯(1,2-di-0-hexadecyl-rac-glycero-3-h-phosphonate)(manoharanetal.,tetrahedronlett.,1995,36,3651-3654；sheaetal.,nucl.acidsres.,1990,18,3777-3783),聚胺或聚乙二醇鏈(manoharanetal.,nucleosides&nucleotides,1995,14,969-973),或者金剛烷乙酸(adamantaneaceticacid)(manoharanetal.,tetrahedronlett.,1995,36,3651-3654),棕櫚基(palmityl)部分(mishraetal.,biochim.biophys.acta,1995,1264,229-237),或者十八胺,或者己氨基-羰基-羥膽固醇(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol)部分(crookeetal.,j.pharmacol.exp.ther.,1996,277,923-937)。本發(fā)明的寡核苷酸也可以與活性藥物成分,例如,阿司匹林,華法林(warfarin),保泰松(phenylbutazone),布洛芬(ibuprofen),舒洛芬(suprofen),芬布芬(fenbufen),酮洛芬(ketoprofen),普拉洛芬((s)-(+)-pranoprofen),卡洛芬(carprofen),丹磺酰肌氨酸(dansylsarcosine),2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-triiodobenzoicacid),氟芬那酸(flufenamicacid),亞葉酸(folinicacid),苯并噻二嗪(benzothiadiazide),氯噻嗪(chlorothiazide),二氮雜卓(diazepine),吲哚美辛(indomethicin),一種巴比土酸鹽(barbiturate),一種頭孢菌素(cephalosporin),一種磺胺藥(sulfadrug),一種抗糖尿病藥,一種抗菌劑或抗生素。美國專利申請(qǐng)u.s.patentapplicationser.no.09/334,130(1999年6月5日提交)描述了寡核苷酸-藥物共軛物和他們的制備方法,披露的全部內(nèi)容被納入在此作為參考。

講授這樣的寡核苷酸共軛物制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于u.s.pat.nos:4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941,這些專利中的某些為本申請(qǐng)所共有,每個(gè)這些專利都被結(jié)合于此作為參考。

在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例中,該化合物包含的修飾寡核苷酸由20個(gè)連接的核苷組成。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,該化合物包含的核堿基序列為seqidnos:39,40,45,52和166中提出的序列。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該組合物包含一種修飾寡核苷酸,它包含連接的核苷,其核堿基序列為seqidnos:28,30,39,40,43,44,45,50,51,52,56,78,125和166中提出的序列,或者是它的鹽,以及一種藥物上可接受的載體或稀釋劑。藥物上可接受的鹽類為業(yè)內(nèi)人士所熟知。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該反義化合物在ctgf序列上的一個(gè)核苷酸范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。在某些實(shí)施例中,該反義化合物在seqidno:9的核苷酸718-751,1388-1423,1457-1689,2040-2069,2120-2147,或2267-2301的范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。在某個(gè)實(shí)施例中,該反義化合物在seqidno:10的核苷酸2728-2797的范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。靶向這些范圍的化合物證實(shí)了至少50％的抑制(即seqidnos:15，29,31,42,46-49,53,72,81,82,152-154,164和165)。表1中列出的某些靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少50％的抑制(即seqidnos:12,20,33,34,76,107,129,132,134，136和146)。在某些實(shí)施例中,該反義化合物在seqidno:9的核苷酸553-611,1394-1423,1469-1508,1559-1605,1659-1689或2100-2129，以及seqidno:10的2623-2647的范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。靶向其中的化合物證實(shí)了至少60％的抑制(即seqidnos:27,28,38,39,40,43,44,45,50,51,52,54,55,56,77,78,79,138和139)。表1中列出的某些另外的靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少60％的抑制(即seqidnos:24,30,61,63,67,69,73,86,125,128和161)。在某些實(shí)施例中,該反義化合物在核苷酸1399-1423的范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。靶向其中的化合物證實(shí)了至少70％的抑制(即seqidnos:39和40)。表1中列出的某些另外的靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少70％的抑制(即seqidnos:28,30,44,45,51,56,78,128和138)。表中列出的一個(gè)靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少80％的抑制(即seqidno:44)。在某些實(shí)施例中,當(dāng)該反義化合物以50nm的濃度被輸送至huvec細(xì)胞時(shí),實(shí)現(xiàn)了該百分抑制率。參照實(shí)施例8,以下提供了更多的細(xì)節(jié)。

在該組合物的一個(gè)實(shí)施例中,該修飾寡核苷酸是一種單鏈或者雙鏈的寡核苷酸。在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例中,包含修飾寡核苷酸，其由20個(gè)連接的核苷組成。

在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例中,提供了一種在細(xì)胞或組織中抑制結(jié)締組織生長因子表達(dá)的方法,它包括使該細(xì)胞或組織與該受關(guān)注的化合物在結(jié)締組織生長因子的表達(dá)受到抑制的條件下接觸。

組合物以及按配方制備藥用組合物的方法

反義寡核苷酸可以與藥用可接受的活性的和/或惰性的物質(zhì)摻合以制備藥用組合物或制劑。組合物和按配方制備藥用組合物的方法取決于一些準(zhǔn)則,包括但不限于給藥途徑,疾病的程度,或者給藥的劑量。

通過使反義化合物與一種適合的藥用可接受的稀釋劑或載體結(jié)合,靶向核酸的反義化合物可以被用在藥用組合物中。藥用可接受的稀釋劑包括磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-bufferedsaline，pbs)。pbs是適用于腸胃外輸送組合物的稀釋劑。因此,在一個(gè)實(shí)施例中,用于在在此描述的方法的是一種藥用組合物,它包含一種靶向核酸的反義化合物和一種藥用可接受的稀釋劑。在一個(gè)實(shí)施例中,該藥用可接受的稀釋劑是pbs。在另外一個(gè)實(shí)施例中,該藥用可接受的稀釋劑是藥用級(jí)鹽水或者藥用級(jí)pbs。在另外一個(gè)實(shí)施例中,該反義化合物是反義寡核苷酸。

包含反義化合物的藥用組合物包含任何的藥用可接受的鹽類,酯類,或者這樣的酯類的鹽類,或者任何其他的寡核苷酸,在給動(dòng)物,包括人類施藥時(shí),它能夠直接或間接地提供其有生物活性的代謝產(chǎn)物或殘?jiān)?。因?也披露出例如,反義化合物的藥用可接受的鹽類,前藥(prodrugs),這樣的前藥的藥用可接受的鹽類,以及其他的生物等效物。合適的藥用可接受的鹽類包括但不限于鈉鹽和鉀鹽。

前藥可以包括在反義化合物的一個(gè)末端或兩個(gè)末端引入另外的核苷,它們在體內(nèi)被內(nèi)源性核酸酶切割形成活性反義化合物。尤其是,本發(fā)明的寡核苷酸的前藥根據(jù)頒發(fā)給gosselin等的wo93/24510,1993年12月9日出版,或wo94/26764或者頒發(fā)給imbach等的美國專利u.s.pat.no.5,770,713中披露的方法,被制備成sate[(s-乙?；?2-硫乙基)磷酸酯]衍生物的形式。

術(shù)語“藥用可接受的鹽類”指的是本發(fā)明的化合物生理學(xué)上和藥學(xué)上可接受的鹽類:即保留了母體化合物理想的生物活性,并且不賦予不希望看到的毒理學(xué)的效果的鹽類。

藥用可接受的加堿鹽類是用金屬或胺類形成的,像堿金屬和堿土金屬或有機(jī)胺類。用作陽離子的金屬的例子是鈉,鉀,鎂,鈣等。適合的胺類的例子有n,n’-二芐基乙二胺,氯代普魯卡因,膽堿,二乙醇胺,二環(huán)己基胺,乙二胺,n-甲葡胺(n-methylglucamine),和普魯卡因(例如,見bergeetal.,“pharmaceuticalsalts,”j.ofpharma.sci.,1997,66,1-19)。所述酸性化合物的加堿鹽類是通過常規(guī)方法使游離酸與足量的堿接觸來制取該鹽。通過常規(guī)方法使該鹽形式與酸接觸并分離出該自由酸，該自由酸可被重新生成。在某些物理性質(zhì)方面,如在極性溶劑中的溶解性,游離酸形式與它相應(yīng)的鹽的形式是有些不同的,但除此之外,對(duì)于本發(fā)明的目的而言,該鹽類是等價(jià)于它們各自的游離酸的。在在此所說的“藥用加成鹽”包括本發(fā)明的組合物的成分之一的酸式的藥用可接受的鹽。它們包括胺的有機(jī)或無機(jī)酸式鹽。優(yōu)選的酸式鹽是鹽酸鹽,醋酸鹽,水楊酸鹽,硝酸鹽和磷酸鹽。其他合適的藥用可接受的鹽類是業(yè)內(nèi)人士所熟知的,包括各種各樣無機(jī)和有機(jī)酸的堿式鹽,像,例如與無機(jī)酸,如鹽酸,氫溴酸,硫酸或磷酸；與有機(jī)羧基的,磺酸基的,磺酸或膦酸(sulfoorphosphoracids)或n-取代的氨基磺酸,例如醋酸,丙酸,甘醇酸,琥珀酸,馬來酸,羥基馬來酸,甲基馬來酸,富馬酸,蘋果酸,酒石酸,乳酸,草酸,葡糖酸,葡糖二酸(glucaricacid),葡醛酸(glucuronicacid),檸檬酸,苯甲酸,肉桂酸,扁桃酸,水楊酸,4-氨基水楊酸,2-苯氧基苯甲酸,2-乙酰氧基苯甲酸(2-acetoxybenzoicacid),亞甲基雙羥萘酸(embonicacid),煙酸或異煙酸；與氨基酸,像在自然界中涉及蛋白質(zhì)合成的20種α-氨基酸,例如谷氨酸或天冬氨酸,還有與苯乙酸,甲磺酸,乙磺酸,2-羥基乙磺酸,1,2-二磺酸基乙烷(ethane-1,2-disulfonicacid),苯磺酸,4-甲基苯磺酸,萘-2-磺酸(naphthalene-2-sulfonicacid),萘-1,5-二磺酸,2-或3-磷酸甘油酸,葡糖-6-磷酸酯,n-環(huán)己基氨基磺酸(生成環(huán)己基氨基磺酸酯(cyclamates)),或者與其他酸性有機(jī)化合物,像抗壞血酸?；衔锏乃幱每山邮艿柠}類還可以利用藥用可接受的陽離子來制備。合適的藥用可接受的陽離子為業(yè)內(nèi)人士所熟知,包括堿金屬陽離子,堿土金屬陽離子,銨和季銨陽離子。碳酸鹽或碳酸氫鹽也是可能的。

對(duì)于寡核苷酸,優(yōu)選的藥用可接受的鹽類包括但不限于,(a)用陽離子,像鈉,鉀,銨,鎂,鈣,用多胺,像精胺(spermine)和亞精胺(spermidine)等形成的鹽類；(b)用無機(jī)酸,例如鹽酸,氫溴酸,硫酸,磷酸,硝酸等形成的酸加成鹽類；(c)用有機(jī)酸,像醋酸,草酸,酒石酸,琥珀酸,馬來酸,富馬酸,葡糖酸,檸檬酸,蘋果酸,抗壞血酸,苯甲酸,單寧酸,棕櫚酸,藻酸,聚谷氨酸,萘磺酸,甲磺酸,對(duì)甲苯磺酸,萘二磺酸,聚半乳糖醛酸等形成的鹽類；以及(d)由元素陰離子,像氯,溴和碘離子形成的鹽類。

在本發(fā)明的某些實(shí)施例中,藥用可接受的載體或稀釋劑是組合物中一種沒有藥物活性的成分,但是作為一種溶劑,懸浮劑或者其他藥學(xué)上惰性的載體工具以輸送給人或非人動(dòng)物一個(gè)或多個(gè)核酸在藥學(xué)上是必需的或理想的。藥用載體是業(yè)內(nèi)人士所熟知的。

載體

本發(fā)明的某些組合物還在配方中摻合進(jìn)了載體化合物。在此所說的“載體化合物”或者“載體”可以指一種核酸,或其類似物,它是惰性的(即本身不具備生物活性),但在體內(nèi)的過程被認(rèn)為是一種核酸,它通過,例如使有生物活性的核酸降解或者促進(jìn)有生物活性的核酸從循環(huán)中排除出去來降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和載體化合物的一起給藥,典型地,后者物質(zhì)是過量的,可以引起在肝,腎或者其他外循環(huán)儲(chǔ)器中的回收的核酸大大減少,大概是因?yàn)檩d體化合物與核酸之間對(duì)于同一個(gè)受體的競爭所致。例如,部分硫代磷酸酯寡核苷酸在肝組織中的回收會(huì)減少,當(dāng)它與聚肌苷酸,硫酸葡聚糖(dextransulfate),聚胞苷酸(polycytidicacid)或者4-乙酰氨基-4’-異硫氰基-均二苯乙烯-2,2’-二磺酸(4-acetamido-4'isothiocyano-stilbene-2,2'-disulfonicacid)一起給藥時(shí)(miyaoetal.,antisenseres.dev.,1995,5,115-121；takakuraetal.,antisensenucl.aciddrugdev.,1996,6,177-183)。

賦形劑

與載體化合物形成對(duì)照,“藥用載體或賦形劑”是藥用可接受的溶劑,懸浮劑或者任何其他的藥理學(xué)上將一種或多種核酸輸送給動(dòng)物的惰性運(yùn)載工具。賦形劑可以是液體或者固體,根據(jù)計(jì)劃的給藥方式來選擇以保證在與核酸和給定藥用組合物的其他成分摻合起來時(shí)有合乎理想的體積和稠度。典型的藥用載體包括但不限于粘結(jié)劑(例如預(yù)膠凝化的玉米淀粉,聚乙烯吡咯烷酮或者羥丙基甲基纖維素等)；填料(例如乳糖和其他糖類,微晶纖維素,果膠,明膠,硫酸鈣,乙基纖維素,聚丙烯酸酯類或者磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂,滑石,二氧化硅,膠態(tài)二氧化硅,硬脂酸,硬脂酸金屬鹽類,氫化植物油,玉米淀粉,聚乙二醇,苯甲酸鈉,醋酸鈉等)；崩解劑(例如淀粉,羥基乙酸淀粉鈉等)；以及潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉等)。

也可以采用不與核酸發(fā)生有害反應(yīng)的,適合于經(jīng)腸道給藥的藥用可接受有機(jī)或無機(jī)的賦形劑來配制本發(fā)明的組合物。合適的藥用可接受的載體包括但不限于水,鹽溶液,醇類,聚乙二醇,明膠,乳糖,直鏈淀粉,硬脂酸鎂,滑石,硅酸,粘性石蠟,羥甲基纖維素,聚乙烯吡咯烷酮等。

核酸的局部給藥劑型可以包括無菌的和不消毒的水溶液,在普通溶劑像醇類中的非水溶液,或者核酸在液體或固體油基中的溶液。這些溶液還可以含有緩沖劑,稀釋劑和其他合適的添加劑?？梢圆捎貌慌c核酸發(fā)生有害反應(yīng)的,適合于經(jīng)腸給藥的藥用可接受有機(jī)或無機(jī)的賦形劑。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該組合物包含一種修飾管核苷酸,它包含一種單鏈或雙鏈寡核苷酸,其特征在于,該修飾寡核苷酸由20個(gè)連接的核苷組成。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例涉及在細(xì)胞或組織中抑制結(jié)締組織生長因子表達(dá)的方法,它包括使該細(xì)胞或組織在結(jié)締組織生長因子被抑制的條件下任一個(gè)上述的化合物接觸。

本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及治療患有與結(jié)締組織生長因子表達(dá)有關(guān)的疾病或癥狀的動(dòng)物的方法,它包括對(duì)該動(dòng)物給予一定量的上述化合物,有效地抑制結(jié)締組織生長因子的表達(dá)來治療該動(dòng)物。

在實(shí)施本發(fā)明的方法中,動(dòng)物包括人以及非人動(dòng)物,但優(yōu)選人類。

本發(fā)明還包括含有本發(fā)明反義化合物的藥用組合物和劑型。本發(fā)明的藥用組合物可以采用多種方法來給藥,它取決于想要局部治療還是系統(tǒng)治療,以及要處理的面積大小。給藥可能是局部的(包括眼的和粘膜的,包括陰道和直腸給藥).肺的,例如吸入或粉末吹入或氣霧劑,包括利用噴霧器；氣管內(nèi)的,鼻內(nèi)的,表皮的和經(jīng)皮的),口服的或者不經(jīng)腸道的。不經(jīng)腸道的給藥包括靜脈內(nèi)的,動(dòng)脈內(nèi)的(intraarterial)，皮下的，腹膜內(nèi)的或者肌肉的注射或輸液；或者顱內(nèi)的,例如鞘內(nèi)的或心室內(nèi)的給藥。具有至少一個(gè)2’-o-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸被認(rèn)為是對(duì)于口服給藥特別有效的。

用于局部給藥的藥用組合物和劑型包括經(jīng)皮膚貼劑,軟膏,洗液,乳膏,凝膠,滴劑,栓劑,噴霧劑,液體和粉劑。常規(guī)的藥用載體,水的,粉末或油基,增稠劑等可能是必需和合乎理想的。涂層的陰莖套或者手套等可能也是有用的。優(yōu)選的局部用配方包括那些其中本發(fā)明的寡核苷酸類與局部輸送劑,像類脂,脂質(zhì)體類,脂肪酸類,脂肪酸酯類,固醇類,螯合劑和表面活性劑摻合。優(yōu)選的類脂和脂質(zhì)體類包括中性的(例如二油?；姿狨；鵧ope乙醇胺(dioleoylphosphatidyldopeethanolamine),二肉豆蔻酰基磷酸?；憠A(dimyristoylphosphatidylcholine)dmpc,二硬脂?；姿狨；憠A(distearolyphosphatidylcholine)),陰性的(例如二肉豆蔻基磷酸?；视?dimyristoylphosphatidylglycerol)dmpg)和陽離子的(例如二油?；募谆北鵧otap(dioleoyltetramethylaminopropyldotap)和二油?；姿狨；掖及?dioleoylphosphatidylethanolamine)dotma)。本發(fā)明的寡核苷酸可以包在脂質(zhì)體中間或者與它形成絡(luò)合物,尤其是與陽離子脂質(zhì)體?；蛘?寡核苷酸可以與類脂絡(luò)合,特別是與陽離子類脂。優(yōu)選的脂肪酸類和酯類包括但不限于花生四烯酸,油酸,二十烷酸,月桂酸,辛酸,癸酸,肉豆蔻酸,棕櫚酸,硬脂酸,亞油酸,亞麻酸，二癸酸酯,三癸酸酯(tricaprate),單甘油一油酸酯(monoolein),甘油二月桂酸酯,甘油1-單癸酸酯(glyceryl1-monocaprate),1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮(1-dodecylazacycloheptan-2-one),一種酰基肉堿,一種酰基膽堿,或者一種c1-10烷基酯(例如肉豆蔻酸異丙酯ipm),單酸甘油酯,甘油二酯或者它們的藥用可接受的鹽類。于1999年5月20日提交的美國專利申請(qǐng)u.s.patentapplicationser.no.09/315,298詳細(xì)描述了局部配方,它的全部被結(jié)合于此作為參考。

用于口服給藥的組合物和劑型包括粉劑或顆粒劑,微粒,納米顆粒,在水或非水介質(zhì)中的混懸液或溶液,膠囊,凝膠膠囊,香囊,片劑或小型片劑。增稠劑,調(diào)味劑,稀釋劑,乳化劑,分散助劑或粘結(jié)劑可以是合乎需要的。優(yōu)選的口服劑型是那些其中本發(fā)明的寡核苷酸連同一種或多種穿透增強(qiáng)劑,表面活性劑和螯合劑一起給藥。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或它們的酯類或鹽類,膽汁酸和/或它們的鹽類。優(yōu)選的膽汁酸類/鹽類包括鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholicacid，cdca)和熊去氧膽酸(ursodeoxychenodeoxycholicacid，ucda),膽酸,脫氫膽酸,脫氧膽酸,谷氨膽酸(glucholicacid),甘氨膽酸(glycholicacid),脫氧甘氨膽酸(glycoldeoxycholicacid),?；悄懰?taurocholicacid),脫氧?；悄懰??；?24,25-二氫-梭鏈孢酸鈉(sodiumtauro-24,25-dihydro-fusidate),甘油二氫梭鏈孢酸鈉(taurodeoxycholicacid)。優(yōu)選的脂肪酸類包括花生四烯酸,十一烷酸,油酸,月桂酸,辛酸,癸酸,肉豆蔻酸,棕櫚酸,硬脂酸,亞油酸,亞麻酸，二癸酸酯,三癸酸酯,單甘油一油酸酯,甘油二月桂酸酯,甘油1-單癸酸酯,1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮,一種酰基肉堿,一種?；憠A,或者一種單酸甘油酯,甘油二酯或者它們的藥用可接受的鹽類。也優(yōu)選摻合穿透增強(qiáng)劑,例如,脂肪酸類/鹽類與膽汁酸類/鹽類摻合。特別優(yōu)選的結(jié)合是月桂酸的鈉鹽,癸酸與ucda的結(jié)合。穿透增強(qiáng)劑進(jìn)一步還包括聚氧化乙烯-9-十二烷基醚(polyoxyethylene-9-laurylether),聚氧化乙烯-20-十六烷基醚(polyoxyethylene-20-cetylether)。本發(fā)明的寡核苷酸可以顆粒劑形式口服,包括噴霧干顆粒,或者絡(luò)合起來形成微?；蚣{米顆粒。寡核苷酸絡(luò)合劑包括聚氨基酸類；聚亞胺類；聚丙烯酸酯類；聚丙烯酸烷基酯類,氧化聚醚類(polyoxethanes),聚氰基丙烯酸烷基酯類；陽離子化的明膠類,白蛋白類,淀粉類,丙烯酸酯類,聚乙二醇類(peg)和淀粉類；聚氰基丙烯酸烷基酯類；deae-衍生的聚亞胺類,短梗霉多糖類(pollulans),纖維素類和淀粉類。特別優(yōu)選的絡(luò)合劑包括殼聚糖,n-三甲基殼聚糖,聚-l-賴氨酸,聚組氨酸,聚鳥氨酸,聚精胺類,精蛋白,聚乙烯吡啶,聚硫代二乙氨基甲基-乙烯(polythiodiethylaminomethyl--ethylene)p(tdae),聚氨基苯乙烯(例如對(duì)-氨基),聚氰基丙烯酸甲酯,聚氰基丙烯酸乙酯,聚氰基丙烯酸丁酯,聚氰基丙烯酸異丁酯,聚氰基丙烯酸異己酯,deae-甲基丙烯酸酯,deae-丙烯酸己酯,deae-丙烯酰胺,deae-白蛋白和deae-葡聚糖,聚丙烯酸甲酯,聚丙烯酸己酯,聚(d,l-乳酸),聚(dl-乳酸-共聚-羥基乙酸)(poly(dl-lactic-co-glycolicacid,plga),藻酸鹽,以及聚乙二醇(peg)。寡核苷酸的口服劑型及其制備詳細(xì)地描述在美國專利申請(qǐng)u.s.applicationser.nos.08/886,829(1997年7月1日提交),ser.no.09/108,673(1998年7月1日提交),ser.no.09/256,515(1999年2月23日提交),ser.no.09/082,624(1998年5月21日提交)以及ser.no.09/315,298(1999年5月20日提交)中，這些專利的每一個(gè)都被全部結(jié)合于此作為參考。

不經(jīng)腸道的,鞘內(nèi)的或心室內(nèi)給藥的組合物和劑型可以包括無菌的水溶液,它們也可以含有緩沖劑,稀釋劑和其他合適的添加劑,像,但不限于,穿透增強(qiáng)劑,載體化合物和其他藥用可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明的藥用組合物包括但不限于,溶液,乳劑,和含脂質(zhì)體的配方。這些組合物可以產(chǎn)生自各種各樣的成分,包括但不限于,執(zhí)行液體類(performedliquids),自乳化固體類和自乳化半固體類。

本發(fā)明的藥用制劑可以方便地以單位劑量的形式提供,它們可以根據(jù)制藥行業(yè)所熟知的常規(guī)工藝來制備。這樣的工藝包括使活性成分與藥用載體或賦形劑結(jié)合的步驟。一般而言,通過使活性成分與液體載體或細(xì)分散的固體載體或二者兼有之均勻密切地結(jié)合來制備制劑,如果需要的話,然后可以將產(chǎn)品加工成形。

本發(fā)明的組合物可以被制備成許多可能的劑量形式的任一種形式,像,但不限于,片劑,膠囊,凝膠膠囊,液體糖漿,軟膠,栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以被配制成在水,非水或混合介質(zhì)中的混懸液。水性混懸液還可以再含有增加該混懸液粘度的物質(zhì),包括,例如羧甲基纖維素鈉,山梨糖醇和/或葡聚糖。該混懸液還可以含有穩(wěn)定劑。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,藥用組合物可以被配制成和用作泡沫。藥用泡沫包括,但不限于的劑型,像乳劑,微乳狀液,霜?jiǎng)?膠凍和脂質(zhì)體。盡管在性質(zhì)上相似,但這些劑型在成分和最后產(chǎn)品的稠度上是不相同的。配制這樣的組合物和劑型對(duì)于醫(yī)藥配方行業(yè)的業(yè)內(nèi)人士是熟知的,可以把他們用于本發(fā)明組合物的配制。

乳劑

本發(fā)明的組合物可以被制備成乳劑。典型地,乳劑是一種液體以通常直徑超過0.1μm的液滴形式分散在另一種液體中的非均質(zhì)系統(tǒng)。(idson,inpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.199；rosoff,inpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.245；blockinpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume2,p.335；higuchietal.,inremington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pa.,1985,p.301)。乳劑往往是兩相的系統(tǒng),包含兩種不溶混的液體相,互相密切混合和分散。通常,乳劑變型要么是油包水(water-in-oil，w/o),要么是水包油(oil-in-water，o/w)。當(dāng)水相被細(xì)分隔成并作為微細(xì)的水滴被分散到大部分的油相中去時(shí),所產(chǎn)生的組合物就稱為油包水乳液。反過來,當(dāng)油相被細(xì)分隔成并作為微細(xì)的油滴被分散到大部分的水相中去時(shí),所產(chǎn)生的組合物就稱為水包油乳液。除了分散相和活性藥物,乳劑也可含有其他的組分,活性藥物可以作為在水相中或者油相中的溶液存在,或者其本身就是一個(gè)獨(dú)立的相。需要時(shí),乳劑中也可以有藥用賦形劑,像乳化劑,穩(wěn)定劑,染料,和抗氧化劑存在.藥用乳劑也可以是多重乳狀液,它由兩個(gè)以上的相組成,比如像油包水包油(oil-in-water-in-oil，o/w/o)和水包油包水(water-in-oil-in-water，w/o/w)乳狀液。這樣的復(fù)雜劑型往往具有了簡單的二元乳狀液所不具備的優(yōu)點(diǎn)。在多重乳狀液中,o/w乳狀液的各個(gè)微細(xì)的油滴包圍住小的微細(xì)水滴構(gòu)成了w/o/w乳狀液。同樣,被包圍在水的液滴中的細(xì)微油滴和被穩(wěn)定在油的連續(xù)相中的系統(tǒng)形成了o/w/o乳狀液。

乳狀液的特征是很少或者沒有熱力學(xué)穩(wěn)定性。乳狀液的分散相或不連續(xù)相往往很好地分散在外部的或連續(xù)相中,利用乳化劑或者該制劑的粘度保持住這種形式。乳狀液的任何一個(gè)相可以是固體或半固體,比如像乳劑類型的軟膏基質(zhì)和乳膏那樣的情形。其他穩(wěn)定乳劑的手段需要采用乳化劑,它可以結(jié)合到乳劑的任何一相中去。乳化劑可以大致分成四種類型:合成的表面活性劑,天然存在的乳化劑,吸收基,和細(xì)分散的固體(idson,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.199)。

合成的表面活性劑,也稱之為表面活性劑,已被發(fā)現(xiàn)在乳劑的配方中有廣泛的應(yīng)用范圍,在文獻(xiàn)中已有綜述(rieger,inpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.285；idson,inpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),marceldekker,inc.,newyork,n.y.,1988,volume1,p.199)。表面活性劑是典型的親水親油的,包含一個(gè)親水部分和一個(gè)憎水部分。表面活性劑的親水性質(zhì)與憎水性質(zhì)之比被稱之為親水/親油平衡值(hydrophile/lipophilebalance，hlb),在配制制劑時(shí)它是表面活性劑分類和選擇的有價(jià)值的工具。根據(jù)親水基團(tuán)的性質(zhì),表面活性劑可以被分成不同類型:非離子型,陰離子型,陽離子型和兩性型(rieger,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.285)。

用于乳劑配制的天然存在的乳化劑包括羊毛脂,蜂蠟,磷脂,卵磷脂和阿拉伯膠(acacia)。吸收基具有親水性質(zhì),所以它能全部吸收水以形成w/o乳狀液仍然保持其半固體的稠度,像無水羊毛脂和親水礦脂。細(xì)分隔的固體也已被用作優(yōu)良的乳化劑,尤其是與表面活性劑結(jié)合起來和在配制粘性制劑時(shí)。這些包括極性的無機(jī)固體,像重金屬的氫氧化物,不溶脹的粘土,像膨潤土,凹凸棒土(attapulgite),鋰蒙脫石,高嶺土,蒙脫石,膠態(tài)硅酸鋁和膠態(tài)硅鋁酸鎂,顏料和非極性固體,像碳或者甘油三硬脂酸酯。

有相當(dāng)多種類的非乳化物質(zhì)也被包括在乳劑的配方中為乳劑的性質(zhì)獻(xiàn)力。這些包括脂肪類,油類,蠟類,脂肪酸類,脂肪醇類,脂肪酯類,濕潤劑類,親水膠體類,防腐劑類和抗氧化劑類(block,inpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.335；idson,inpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.199)。

親水膠體類(hydrophiliccolloidsorhydrocolloids)包括天然存在的樹膠類和合成的聚合物,像多糖類(例如阿拉伯膠,瓊脂,藻酸,角叉菜膠(carrageenan),瓜耳豆膠(guargum),刺梧桐樹膠(karayagum)和黃蓍膠(tragacanth)),纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羧丙基纖維素),以及合成的聚合物(例如卡波姆(carbomers)類,纖維素醚類,和羧基乙烯基聚合物類)。它們在水中分散或溶脹形成膠體溶液,它通過在分散相液滴周圍形成強(qiáng)有力的界面膜,并且增加了外相的粘度來使乳狀液穩(wěn)定。

由于乳狀液常常包含多種成分，例如碳水化合物類，蛋白質(zhì)類，甾醇類和磷脂類，這些成分可能易于支持微生物的生長，這些制劑常常加入防腐劑。在乳狀液中一般使用的防腐劑包括苯甲酸甲酯防腐劑(methylparaben)，苯甲酸丙酯防腐劑，季銨鹽，氯化苯甲羥胺(benzalkoniumchlorid)，對(duì)羥基苯甲酸的醚和硼酸?？寡趸瘎┮惨话惚患尤氲饺闋钜褐苿┲幸苑乐怪苿┳儔摹Ｋ捎玫目寡趸瘎┛梢允亲杂苫宄齽?像生育酚,沒食子酸烷基酯,丁基化羥基苯甲醚,丁基化羥基甲苯,或者還原劑,像抗壞血酸和偏亞硫酸氫鈉(sodiummetabisulfite),以及抗氧化劑增效劑,像檸檬酸,酒石酸和卵磷脂。

通過皮膚的,口服的和不經(jīng)腸道途徑的乳劑配方的應(yīng)用以及它們的制造方法已在文獻(xiàn)中有綜述(idson,inpharmaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.199)。由于容易配制以及從吸收和生物利用度的角度出發(fā)的功效,口服乳液制劑已被廣泛采用。(roseff,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.245；idson,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.199)。礦物油基輕瀉劑類,油溶性維生素類和高脂肪營養(yǎng)制劑屬于常用的口服給藥的o/w乳劑的物質(zhì)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,寡核苷酸和核酸的組合物被配制成微乳狀液。微乳狀液可以被定義為水,油和兩親物的系統(tǒng),它是單一的光學(xué)各向同性的并且熱力學(xué)穩(wěn)定的液體溶液(roseff,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.245)。典型地,微乳狀液是系統(tǒng)，它的制備是先將一種油分散在一種水相的表面活性劑溶液中,然后,加入足夠量的一種第四成分,通常它是一種鏈長中等的醇以形成一個(gè)透明的系統(tǒng)。因此,微乳狀液也被描述成兩種不溶混的液體熱力學(xué)穩(wěn)定的,各向同性的透明分散體,這兩種不溶混的液體通過表面活性劑分子的界面膜被穩(wěn)定化(leungandshah,in:controlledreleaseofdrugs:polymersandaggregatesystems,rosoff,m.,ed.,1989,vchpublishers,newyork,pp185-215)。微乳狀液通常由結(jié)合三至五種成分來制備,它們包括油,水,表面活性劑,助表面活性劑和電解質(zhì)。微乳狀液是油包水(w/o)類型還是水包油(o/w)類型則取決于所采用的油和表面活性劑的性質(zhì),以及該表面活性劑分子的結(jié)構(gòu)和極性頭與烴尾巴的幾何包裝(schottinremington’spharmaceuticalscience,markpublishingco.,easton,pa.,1985,p.271)。

利用相圖的現(xiàn)象學(xué)方法已被廣泛研究,對(duì)于業(yè)內(nèi)人士已獲得了如何配制微乳狀液全面的知識(shí)(roseff,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.245；block,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.335)。與常規(guī)的乳狀液相比,微乳狀液的優(yōu)點(diǎn)在于,在配制自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定地液滴時(shí),它使水溶性的藥物增溶。

制備微乳狀液時(shí)采用的表面活性劑包括,但不限于,離子型表面活性劑,非離子型表面活性劑,brij96,聚氧化乙烯油烯基醚類(polyoxyethyleneoleylethers),聚甘油脂肪酸酯類,一月桂酸四甘油酯(tetraglycerolmonolaurate,ml310),一油酸四甘油酯(tetraglycerolmonooleate,ml310),一油酸六甘油酯(po310),五油酸六甘油酯(po500),一癸酸十甘油酯(mca750),一油酸十甘油酯(mo750),sequi油酸十甘油酯(decaglycerolsequioleate,so750),十油酸十甘油酯(dao750)，單獨(dú)或者與助表面活性劑摻合。助表面活性劑通常是一種短鏈的醇,像乙醇,1-丙醇和1-丁醇,它的作用是通過滲透進(jìn)表面活性劑膜來增加界面的流動(dòng)度,因而形成了一層無序的膜,這是由于在表面活性劑分子中間產(chǎn)生的空隙空間所造成的緣故。但是,可以不用助表面活性劑來制備微乳狀液,無醇的自乳化微乳狀液系統(tǒng)是業(yè)內(nèi)知曉的。典型地,水相可以為,但并不限于,水,藥物的水溶液,甘油,peg300，peg400,聚甘油類,丙二醇類,以及乙二醇的衍生物。油相可以包括,但不限于,像captex300,captex355,capmulmcm,脂肪酸酯類,鏈長中等(c8-c12)的單-,二-,三-甘油酯類,聚氧化乙烯化甘油脂肪酸酯類,脂肪醇類,聚乙二醇化甘油酯類,飽和聚乙二醇c8-c12化甘油酯類,植物油類和硅油。

從藥物增溶作用和提高藥物吸收的觀點(diǎn)出發(fā),微乳狀液受到特別的關(guān)注。類脂基的微乳狀液(o/w和w/o都有)已經(jīng)被提議用來增強(qiáng)藥物,包括肽類的口服生物利用度(constantinidesetal.,pharmaceuticalresearch,1994,11,1385-1390；ritschel,meth.find.exp.clin.pharmacol.,1993,13,205)。微乳狀液的優(yōu)點(diǎn)在于,改善了藥物的增溶,保護(hù)藥物不受酶的水解作用,有可能提高藥物的吸收,這是由于表面活性劑引起的膜流動(dòng)度及滲透性的改變的緣故,容易制備,比固體劑量形式容易口服給藥,改進(jìn)臨床效能,降低毒性(constantinidesetal.,pharmaceuticalresearch,1994,11,1385；hoetal.,j.pharm.sci.,1996,85,138-143)。當(dāng)它們的成分在室溫下被匯集起來時(shí)，微乳狀液往往可以自發(fā)地形成。當(dāng)配制不耐熱的藥物,肽類或者寡核苷酸時(shí),這可以成為特別的優(yōu)勢。在美容和藥物的應(yīng)用中,經(jīng)皮膚輸送活性成分時(shí)微乳狀液也是有效的。期望本發(fā)明的微乳狀液組合物和制劑會(huì)促進(jìn)從胃腸道增加寡核苷酸和核酸的系統(tǒng)吸收,以及改善在胃腸道,陰道,口腔和其他給藥區(qū)域內(nèi)對(duì)于寡核苷酸和核酸的局部細(xì)胞攝入。

本發(fā)明的微乳狀液也可以含有另外的成分和添加劑,像山梨糖醇單硬脂酸酯(grill3),葵酸酯(labrasol),和滲透增強(qiáng)劑以改進(jìn)制劑的性能和增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明的寡核苷酸及核酸的吸收。用于本發(fā)明的微乳狀液的滲透增強(qiáng)劑可以被分成屬于五個(gè)粗分大類中之一類–表面活性劑類,脂肪酸類,膽汁鹽類,螯合劑類,以及非螯合非表面活性劑(leeetal.,criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems,1991,p.92)。每一類已在上面討論過。

脂質(zhì)體

除了微乳狀液之外,還有許多有序的表面活性劑結(jié)構(gòu)已被研究并用于藥物配制。這些包括單分子層(monolayers),膠束(micelles),雙分子層和泡囊。泡囊,像脂質(zhì)體受到了極大的關(guān)注,這是由于從藥物輸送角度看,它們發(fā)揮作用的特異性和持續(xù)時(shí)間長的緣故。如本發(fā)明中所用,術(shù)語“脂質(zhì)體”指的是一種泡囊,它由排列成球形的雙分子層或多個(gè)雙分子層的兩親的類脂組成。

脂質(zhì)體是單薄層狀或多薄層狀的泡囊,泡囊有一層由親油物質(zhì)形成的膜和一個(gè)水相的內(nèi)部。該水相部分含有要輸送的組合物。陽離子型脂質(zhì)體具有能融合到細(xì)胞壁上去的優(yōu)勢。非陽離子型的脂質(zhì)體雖然不能與細(xì)胞壁那樣有效地融合,但在體內(nèi)被巨噬細(xì)胞吞噬。

為了跨過哺乳動(dòng)物完整的皮膚,在一個(gè)適合的經(jīng)皮的梯度影響之下,類脂泡囊必須穿越一系列的每個(gè)直徑都小于50nm的微孔。因此,利用脂質(zhì)體是合乎理想的,它是高度可變形的,而且能夠穿越這樣的微孔。

脂質(zhì)體深一層的優(yōu)點(diǎn)包括:由天然的磷脂獲得的脂質(zhì)體是生物相容的以及生物可降解的；脂質(zhì)體可以范圍廣泛地與水溶性和脂溶性藥物摻合；脂質(zhì)體能將包裹在內(nèi)的藥物保護(hù)在它們的內(nèi)部室免受代謝與降解(roseff,inpharnaceuticaldosageforms,lieberman,riegerandbanker(eds.),1988,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,volume1,p.245)。在制備脂質(zhì)體制劑時(shí)重要的考慮因素是脂質(zhì)體的類脂表面電荷,泡囊大小以及水相的體積。

脂質(zhì)體有助于將活性成分轉(zhuǎn)移和輸送到作用位點(diǎn)。由于脂質(zhì)體膜的結(jié)構(gòu)與生物膜類似,所以,當(dāng)脂質(zhì)體被施加到組織時(shí),脂質(zhì)體就開始與細(xì)胞膜融合。隨著脂質(zhì)體與細(xì)胞融合過程的進(jìn)行,脂質(zhì)體內(nèi)容物注入到細(xì)胞中去,活性物質(zhì)可在細(xì)胞中發(fā)揮作用。

脂質(zhì)體制劑一直是深入研究許多藥物傳遞模式的焦點(diǎn)。有越來越多的證據(jù)表明,對(duì)于局部給藥,脂質(zhì)體表現(xiàn)出比其他制劑有好些優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括減少了與所給藥物的高的系統(tǒng)吸收有關(guān)的副作用,提高了所給藥物在期望靶點(diǎn)的累積,以及可以給皮膚施用各種各樣藥物的能力,親水的和親油的藥物都行。

有幾份報(bào)告詳細(xì)列舉了脂質(zhì)體輸送試劑的能力,包括將高分子量的dna傳遞到皮膚中。包括止痛劑,抗體,激素和高分子量的dna的化合物已經(jīng)被施藥給皮膚。大部分的這些用途導(dǎo)致把上表皮作為靶標(biāo)。

脂質(zhì)體分為兩個(gè)大類。陽離子型脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體,它與帶負(fù)電荷的dna分子相互作用形成一種穩(wěn)定的絡(luò)合物。帶正電荷的dna/脂質(zhì)體絡(luò)合物結(jié)合在帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面,并且在核內(nèi)體被內(nèi)在化。由于在核內(nèi)體中酸性的ph,脂質(zhì)體被破壞,將里面的物質(zhì)釋放到細(xì)胞的胞質(zhì)中去(wangetal.,biochem,biophys.res.commun.,1987,147,980-985)。

對(duì)ph敏感的或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體捕獲dna而不是與其絡(luò)合。由于dna與類脂帶同樣的電荷,所以發(fā)生的是排斥而并非形成絡(luò)合物。盡管如此,一些dna被捕獲到這些脂質(zhì)體的水相的內(nèi)部室中。對(duì)ph敏感的脂質(zhì)體已被用于將編碼胸腺嘧啶核苷激酶基因的dna傳遞給培養(yǎng)物中的細(xì)胞單分子層。在此靶細(xì)胞中探測到了外源基因的表達(dá)(zhouetal.,journalofcontrolledrelease,1992,19,269-274)。

脂質(zhì)體組合物的一種主要類型包括磷脂類而不是從天然衍生的磷脂酰膽堿。中性的脂質(zhì)體組合物,例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(dimyristoylphosphatidylcholine，dmpc)或者二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine，dppc)來形成。而陰離子融合型(fusogenic)的脂質(zhì)體主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，dope)來形成。另外一類的脂質(zhì)體組合物是由磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，pc),例如像,大豆pc和蛋pc來形成。另外一類是由磷脂和/或磷脂酰膽堿和/或膽固醇來形成。

有幾項(xiàng)研究已經(jīng)評(píng)估了將脂質(zhì)體藥物制劑局部輸送給皮膚。將含有脂質(zhì)體的干擾素應(yīng)用在豚鼠皮膚上時(shí)導(dǎo)致皮膚皰疹潰瘍的減少,而通過其他途徑(例如,作為溶液或者乳劑)輸送干擾素是無效的(weineretal.,journalofdrugtargeting,1992,2,405-410)。又,還有一項(xiàng)研究試驗(yàn)了作為脂質(zhì)體組合物部分的干擾素的給藥功效與采用水相系統(tǒng)的干擾素給藥功效的比較,得出的結(jié)論是脂質(zhì)體組合物優(yōu)于水相的給藥(duplessieetal.,antiviralresearch,1992,18,259-265)。

也已測試了非離子型的脂質(zhì)體系統(tǒng)以確定其在將藥物輸送給皮膚時(shí)的效用,尤其是包含非離子表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng)。含有novasome^tmi(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂醇醚)和novasome^tmii(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂醇醚)的非離子型脂質(zhì)體制劑被用來將環(huán)孢霉素a(cyclosporin-a)輸送給老鼠皮膚的真皮。結(jié)果表明這樣的非離子型脂質(zhì)體系統(tǒng)可以有效地促進(jìn)環(huán)孢霉素a在不同層的皮膚上的沉積(huetal.,s.t.p.pharma.sci.,1994,4,6,466)。

脂質(zhì)體也包括“立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的”脂質(zhì)體,在此所用的術(shù)語指的是包含一個(gè)或者多個(gè)專門的類脂的脂質(zhì)體,當(dāng)這些類脂結(jié)合到脂質(zhì)體中去時(shí),相對(duì)于那些沒有這樣的專門的類脂的脂質(zhì)體而言,結(jié)果增強(qiáng)了循環(huán)壽命。立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的脂質(zhì)體的例子有那些在脂質(zhì)體中形成泡囊類脂這部分的一部分(a)包含一個(gè)或者多個(gè)糖脂(glycolipids),像單唾液神經(jīng)節(jié)苷酯(monosialoganglioside)gm1,或者(b)衍生自一個(gè)或多個(gè)親水聚合物,像一個(gè)聚乙二醇(peg)組成部分。盡管無意受到任何具體理論的束縛,業(yè)內(nèi)還是認(rèn)為,至少對(duì)于含有神經(jīng)節(jié)苷脂(gangliosides),鞘髓磷脂(sphingomyelin),或者peg-衍生的類脂的立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的脂質(zhì)體來說,這些立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的脂質(zhì)體的循環(huán)半衰衰期的提高源自于進(jìn)入到網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res)的細(xì)胞中的攝取量的減少(allenetal.,febsletters,1987,223,42:wuetal.,cancerresearch,1993,53,3765)。

包含一個(gè)或多個(gè)糖脂的各種各樣的脂質(zhì)體為業(yè)內(nèi)所知曉。papahadjopoulos等(ann.n.y.acad.sci.,1987,507,64)報(bào)告了單唾液神經(jīng)節(jié)苷脂gm1,半乳糖腦苷脂硫酸酯(galactocerebrosidesulfate)和磷脂酰肌醇改善脂質(zhì)體血液半衰期的能力。這些發(fā)現(xiàn)由gabizon等進(jìn)行了詳細(xì)的闡述(proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1988,85,6949)。頒授給allen等人的美國專利u.s.patno4,837,028以及wo88/04924披露了包含(1)鞘髓磷脂和(2)神經(jīng)節(jié)苷脂gm1或半乳糖腦苷脂硫酸酯的脂質(zhì)體。美國專利u.s.patno5,543,152(webbetal.)披露了包含鞘髓磷脂的脂質(zhì)體。wo97/13499(limetal.)披露了包含1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體。

許多包含衍生自一個(gè)或多個(gè)親水聚合物的類脂的脂質(zhì)體,以及它們的制備方法為業(yè)內(nèi)所知曉。sunamoto等人(bull.chem.soc.jpn.,1980,53,2778)描述了包含一種非離子型洗滌劑,2c1215g的脂質(zhì)體,其含有一個(gè)peg的組成部分。illum等人(febslett.,1984,167,79)注意到利用聚甘醇對(duì)聚苯乙烯顆粒進(jìn)行親水涂布,結(jié)果顯著地提高了血液半衰期。通過附著聚亞烷基二醇(例如peg)的羧基來對(duì)合成的磷脂進(jìn)行修飾見sears(u.s.pat.nos.4,426,330和4,534,899)的描述。klibanov等人(febslett.,1990,268,235)描述了實(shí)驗(yàn)證實(shí)包含衍生自peg或硬脂酸peg酯的磷脂酰乙醇胺(pe)的脂質(zhì)體顯著地提高了血液循環(huán)半衰期。blume等人(biochemicaetbiophysicsacta,1990,1029,91)將此觀察結(jié)果延伸到其他peg-衍生的磷脂,例如dspe-peg,它是由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)與peg形成的。在其外表面上具有共價(jià)結(jié)合的peg組成部分的脂質(zhì)體見于歐洲專利europeanpatentno.ep0445131b1和頒授給fisher的wo90/04384。包含1-20mol％的衍生自peg的pe的脂質(zhì)體組合物，以及其用途被woodle等人(美國專利u.s.pat.nos.5,013,556和5,356,633)以及martin等人(美國專利u.s.pat.no.5,213,804和歐洲專利europeanpatentno.ep0496813b1)描述。包含數(shù)個(gè)其他類脂-聚合物結(jié)合物的脂質(zhì)體被披露在wo91/05545和美國專利u.s.pat.no.5,225,212(均頒授給martinetal.)以及wo94/20073(zalipskyetal.)中。wo96/10391(choietal.)描述了包含peg-修飾的神經(jīng)酰胺類脂。美國專利u.s.pat.nos.5,540,935(miyazakietal.)和5,556,948(tagawaetal.)描述了含peg的脂質(zhì)體可以進(jìn)一步在其表面上的官能組成部分被衍生。

有限數(shù)量的包含核酸的脂質(zhì)體為業(yè)內(nèi)所知。頒授給thierry等人的wo96/40062講述了將高分子量的核酸包囊在脂質(zhì)體中的方法。頒授給tagawa等人的美國專利u.s.pat.no.5,264,221講述了與蛋白質(zhì)結(jié)合的脂質(zhì)體,并且聲稱這樣的脂質(zhì)體內(nèi)容物可以包括反義rna。頒授給rahman等人的美國專利u.s.pat.no.5,665,710描述了將寡脫氧核苷酸包囊在脂質(zhì)體中的方法。頒授給love等人的wo97/04787描述了包含靶向raf基因的反義寡核苷酸的脂質(zhì)體。

傳遞體(transfersomes)是另外一種類型的脂質(zhì)體,是高度可變形類脂的聚集體,是藥物傳遞工具富有吸引力的選擇物。傳遞體可以被描述成可高度變形的類脂滴,它們能容易地穿透過比滴還小的孔。傳遞體可以適應(yīng)他們的使用環(huán)境,例如它們是自動(dòng)優(yōu)化的(適應(yīng)皮膚上孔的形狀),自動(dòng)恢復(fù),往往到達(dá)它們的靶標(biāo)而無碎裂,經(jīng)常自動(dòng)裝載。為了制備傳遞體,可能要往標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體組合物中加入表面邊緣-活化劑(surfaceedge-activators),通常是表面活性劑。傳遞體一直被用于將血清白蛋白傳遞給皮膚。由傳遞體介導(dǎo)的傳遞血清白蛋白已經(jīng)顯示出與皮下注射含血清白蛋白的溶液同樣有效。

表面活性劑在像乳劑(包括微乳狀液)和脂質(zhì)體的制劑中有著廣泛的用途。對(duì)許多包括天然和合成的不同類型的表面活性劑的性質(zhì)最通常的分類和評(píng)級(jí)辦法是利用親水/親油平衡(hlb)。親水基團(tuán)(也叫“頭部”)的性質(zhì)提供了最有用的手段來對(duì)用于制劑的不同表面活性劑進(jìn)行分類(rieger,inpharnaceuticaldosageforms,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,1988,p.285)。

如果表面活性劑分子未離子化,則它被分類為非離子型表面活性劑。非離子型表面活性劑在醫(yī)藥和美容產(chǎn)品中有著廣泛的應(yīng)用,可以在一個(gè)寬的ph范圍內(nèi)使用。通常,根據(jù)其結(jié)構(gòu),它們的hlb值的范圍在2至18左右。非離子型表面活性劑包括非離子型酯類,像乙二醇酯類,丙二醇酯類,甘油酯類,聚甘油酯類,山梨糖醇羧酸酯類,蔗糖酯類,以及乙氧基化的酯類。非離子型鏈烷醇酰胺類和醚類,像脂肪醇乙氧基化物,丙氧基化醇類,以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括在這一類型中。聚氧化乙烯表面活性劑是非離子型表面活性劑類型中最受歡迎的成員。

如果表面活性劑在溶解或分散在水中時(shí)攜帶負(fù)電荷,則它被分類為陰離子型表面活性劑。陰離子型表面活性劑包括羧酸鹽類,像肥皂類,?；樗猁}(acyllactylates),氨基酸的酰基酰胺類,硫酸的酯類,像烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯,磺酸酯類,像烷基苯磺酸類,乙?；u乙磺酸鹽類(acylisethionates),乙?；｜S酸酯(acyltaurates)和磺基琥珀酸(sulfosuccinates)酯,和磷酸酯。陰離子型表面活性劑類中最重要的成員是烷基硫酸酯類和肥皂類。

如果表面活性劑在溶解或分散在水中時(shí)攜帶正電荷,則它被分類為陽離子型表面活性劑。陽離子型表面活性劑包括季銨鹽類和乙氧基化胺類。季銨鹽類是這一類型中最常用的成員。

如果表面活性劑分子能夠攜帶要么是正電荷要么是負(fù)電荷,則該表面活性劑被劃分為兩性的。兩性的表面活性劑包括丙烯酸衍生物類,取代的烷基酰胺類,n-烷基甜菜堿和磷脂類。

在藥物產(chǎn)品,制劑中和乳劑中使用表面活性劑已有綜述(rieger,inpharnaceuticaldosageforms,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,1988,p.285)。

促透劑

在一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明使用了各種促透劑以實(shí)現(xiàn)將核酸,尤其是寡核苷酸有效地輸送給動(dòng)物皮膚。大多數(shù)的藥物以離子化的和非離子化的形式存在于溶液中。但是,通常只有脂溶性的或親油的藥物才容易地穿越細(xì)胞膜。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),如果要被穿越的膜用促透劑處理過的話,即使非脂溶性藥物也可以穿越細(xì)胞膜。除了有助于非脂溶性藥物的擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜,促透劑還提高了非脂溶性藥物的滲透性。

促透劑可以被分類屬于五大類中的一類,即表面活性劑類,脂肪酸類,膽汁酸鹽類,螯合劑類,和非螯合劑非表面活性劑類(leeetal.,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1991,p.92)。以下詳細(xì)描述上述促透劑的每一類型。

表面活性劑:結(jié)合本發(fā)明,表面活性劑是化學(xué)體,當(dāng)溶于水溶液中時(shí),它降低了溶液的表面張力或者水溶液與另一種液體之間的界面張力,結(jié)果提高了寡核酸穿越粘膜的吸收。除了膽汁酸和脂肪酸,這些促透劑包括,例如十二烷基硫酸鈉,聚氧化乙烯-9-十二烷基醚和聚氧化乙烯-20-十六烷基醚(leeetal.,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1991,p.92)；以及全氟化學(xué)乳液，像fc-43(takahashietal.,j.pharm.pharmacol.,1988,40,252)。

脂肪酸類:充當(dāng)促透劑的各種脂肪酸及其衍生物包括,例如油酸,月桂酸,癸酸(正癸酸),肉豆蔻酸,棕櫚酸,硬脂酸,亞油酸,亞麻酸,二癸酸酯類,三癸酸酯類,一油酸酯(1-油?；?外消旋-甘油),二月桂酸酯,辛酸,花生四烯酸,甘油1-單癸酸酯,1-十二烷基氮雜庚-2-酮,?；鈮A類,?；憠A類,它們的c1-10烷基酯(例如,甲基,異丙基和叔丁基),以及它們的單甘油酯類和二甘油酯類(例如,油酸酯,月桂酸酯,癸酸酯,肉豆蔻酸酯,棕櫚酸酯,硬脂酸酯,亞油酸酯等)(leeetal.,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1991,p.92；muranishi,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1990,7,1-33；elharirietal.,j.pharmpharmacol.,1992,44,651-654)。

膽汁酸鹽類：膽汁的生理功用包括促進(jìn)類脂和脂溶性維生素的分散和吸收(brunton,chapter38in:goodman&gilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,9^thed.,hardmanetal.eds.,mcgraw-hill,newyork,1996,pp.934-935)。各種天然的膽汁酸鹽及其合成的衍生物用作促透劑。因此,術(shù)語“膽汁酸鹽類”包括任何天然存在的膽汁成分以及任何它們的合成衍生物。本發(fā)明的膽汁酸鹽類包括,例如膽酸(或者其藥用可接受的鈉鹽,膽酸鈉),脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉),脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉),谷氨膽酸(glucholicacid)(谷氨膽酸鈉),甘氨膽酸(甘氨膽酸鈉),甘氨脫氧膽酸(甘氨脫氧膽酸鈉),牛磺膽酸(?；悄懰徕c),?；敲撗跄懰?牛磺脫氧膽酸鈉),鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉),烏索脫氧膽酸(ursodeoxycholicacid，udca),牛磺-24,25-二氫梭鏈孢酸鈉(sodiumtauro-24,25-dihydro-fusidate，stdhf),甘油二氫梭鏈孢酸鈉(sodiumglycodihydrofusidate)及聚氧化乙烯-9-十二烷基醚(poe)(leeetal.,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1991,page92；swinyard,chapter39in:remington'spharmaceuticalsciences,18thed.,gennaro,ed.,mackpublishingco.,easton,pa.,1990,pages782-783；muranishi,criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems,1990,7,1-33；yamamotoetal.,j.pharm.exp.ther.,1992,263,25；yamashitaetal.,j.pharm.sci.,1990,79,579-583)

螯合劑類:用于本發(fā)明的螯合劑可以被定義為通過與金屬離子形成絡(luò)合物將金屬離子從溶液中除去的化合物,結(jié)果提高了寡核苷酸穿過粘膜的吸收。有關(guān)將它們用作本發(fā)明的促透劑,螯合劑還具有同時(shí)作為dnase抑制劑的另一個(gè)好處，因?yàn)榇蠖鄶?shù)表征的dna核酸酶需要一個(gè)二價(jià)金屬離子作催化劑,因而受到螯合劑的抑制(jarrett,j.chromatogr.,1993,618,315-339)。本發(fā)明的螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(edta),檸檬酸,水楊酸鹽類(例如,水楊酸鈉,5-甲氧基水楊酸鹽和高香蘭酸鹽(homovanilate)),骨膠原的n-乙酰基衍生物,乙二醇月桂醇聚醚-9(laureth-9)和β-二酮的n-氨?；苌?烯胺類)(leeetal.,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1991,p.92；muranishi,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1990,7,1-33；buuretal.,j.controlrel.,1990,14,43-51)。

非螯合劑非表面活性劑類:在此所說的非螯合劑非表面活性劑促透化合物可以被定義為沒有表現(xiàn)出像螯合劑或者表面活性劑那樣有效的活性,但仍然增加了寡核苷酸通過消化的粘膜吸收的一類化合物(muranishi,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1990,7,1-33)。這類促透劑包括,例如,不飽和環(huán)狀脲類,1-烷基-和1-鏈烯基氮雜環(huán)-烷酮的衍生物(leeetal.,criticalreviewintherapeuticdrugcarriersystems,1991,p.92)；以及非膽固醇抗炎劑,像雙氯芬酸鈉,吲哚美辛和保泰松(phenylbutazone)(yamashitaetal.,j.pharm.pharmacol.,1987,39,621-626)。

本發(fā)明的藥用和其他組合物中還可以加入增加寡核苷酸在細(xì)胞水平上的吸收的試劑。例如陽離子型的類脂,像轉(zhuǎn)化脂(lipofectin)(junichietal.,u.s.pat.no.5,705,188),陽離子型甘油衍生物類，及聚陽離子分子,像聚賴氨酸(lolloetal.,pctapplicationwo97/30731)都是已知可增加寡核苷酸在細(xì)胞中的吸收的。

其他可以用來增加給藥的核酸的滲透的試劑包括甘醇類,像乙二醇和丙二醇,吡咯類,像2-吡咯,氮酮類,及萜類,像苧烯和薄荷酮。

其他成分

本發(fā)明的組合物還可以在既定工藝慣例的含量上另外含有藥用組合物慣用的其他附加成分。因此,組合物可以含有,例如另外的,相容的,藥學(xué)上有活性的物質(zhì),像止癢劑,收斂劑,局部麻醉劑或者抗炎劑,或者可以含有另外的有助于配制本發(fā)明組合物各種劑型的材料,像染料,調(diào)味劑,防腐劑,抗氧化劑,遮光劑,增稠劑和穩(wěn)定劑。但是,這些材料在加入時(shí)不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)馗蓴_本發(fā)明組合物中成分的生物活性。制劑可以被消毒,如果希望的話,可以與助劑混和,像潤滑劑,防腐劑,穩(wěn)定劑,濕潤劑,乳化劑,影響滲透壓的鹽類,緩沖劑,著色劑,調(diào)味和/或芳香物質(zhì)等,它們與配方中的核酸不發(fā)生有害的相互作用。

水相的混懸液可以含有提高混懸液粘度的物質(zhì),包括例如羧甲基纖維素鈉,山梨糖醇和/或葡聚糖。混懸液也可以含有穩(wěn)定劑。

本發(fā)明的某些實(shí)施例提供了藥用組合物,它們含有(a)一種或多種反義化合物和(b)一種或多種其他的通過非反義機(jī)理發(fā)揮作用的化療藥劑。這樣的化療藥劑包括,但不限于柔紅霉素,道諾霉素,更生霉素,阿霉素,表柔比星,依達(dá)比星,依索比星,平陽霉素,馬磷酰胺,異環(huán)磷酰胺,阿糖胞苷,雙氯乙基亞硝基脲(bis-chloroethylnitrosurea),白消安,絲裂霉素c,放線菌素d,光輝霉素,強(qiáng)的松,羥孕酮,睪酮,他莫昔芬,達(dá)卡巴嗪,丙卡巴肼,六甲嘧胺(hexamethylmelamine),五甲嘧胺,米托蒽醌(mitoxantrone),安吖啶,瘤可寧,甲基環(huán)己基亞硝基脲,氮芥,左旋溶肉瘤素,環(huán)磷酰胺,6-巰基嘌呤,6-硫鳥嘌呤,阿糖胞苷,5-氮雜胞苷,羥基脲,脫氧助間型霉素(deoxycoformycin),4-羥基過氧化環(huán)磷酰胺,5-氟尿嘧啶(5-fu),5-氟脫氧尿苷(5-fudr),甲氨蝶呤(mtx),秋水仙素,紫杉酚,長春新堿,長春堿,依托伯甙(vp-16),三甲曲沙,伊立替康,托泊替康,吉西他濱,替尼泊甙(teniposide),順鉑和己烯雌酚(des)。一般地,見手冊themerckmanualofdiagnosisandtherapy,15^thed.1987,pp.1206-1228,berkowetal.,eds.,rathway,n.j.當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，這樣的化療劑可以個(gè)別地使用(例如,5-fu與寡核苷酸),按順序地使用(例如,5-fu與寡核苷酸用一段時(shí)間,接著用mtx與寡核苷酸),或者與一個(gè)或多個(gè)其他的這些化療劑結(jié)合起來使用(例如,5-fu,mtx與寡核苷酸,或者5-fu,放療與寡核苷酸)。抗炎藥物，包括但不限于非膽固醇抗炎藥和皮質(zhì)甾醇類,以及抗病毒藥物,包括但不限于,三唑核苷(ribivirin),阿糖腺苷,無環(huán)鳥苷和更昔洛韋,也可以與本發(fā)明的組合物結(jié)合起來。分別見手冊themerckmanualofdiagnosisandtherapy,15^thed.1987,berkowetal.,eds.,rathway,n.j.pp.2499-2506和pp.46-49.其他的非反義化療劑也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。兩種或多種聯(lián)用的化合物可以一起使用或者按順序使用。在另外一個(gè)相關(guān)的實(shí)施例中,本發(fā)明的組合物可以含有一種或多種反義化合物,特別是寡核苷酸,靶向第一種核酸,一種或多種另外的反義化合物靶向第二種靶核酸。不少反義化合物的例子為業(yè)內(nèi)所知曉。兩種或多種聯(lián)用的化合物可以一起使用或者按順序使用。

依照本發(fā)明所使用的反義化合物可以利用熟知的固相合成的工藝便利地按常規(guī)制備。有幾家供應(yīng)商出售這樣的合成設(shè)備,包括,例如appliedbiosystems(fostercity,calif.)。業(yè)內(nèi)知曉的任何其他合成手段也可以附加地或交替使用。利用相似的工藝來制備寡核苷酸,像硫代磷酸酯類和烷基化的衍生物類是大家所熟知的。

本發(fā)明的反義化合物在體外被合成,不包括生物來源的反義組合物,或者設(shè)計(jì)來對(duì)準(zhǔn)體內(nèi)合成反義分子的基因載體構(gòu)建物。本發(fā)明的化合物也可以與其他分子,化合物分子結(jié)構(gòu)體或者混合物,例如,脂質(zhì)體類,受體靶向的分子,口服制劑,直腸制劑,局部制劑或其他的以輔助攝入,分配和/或吸收的制劑混合,包囊,共軛(conjugate)或者取別的方式締合。有代表性的講授這樣的輔助攝入,分配和/或吸收的助劑制備的美國專利包括,但不限于,u.s.pat.nos.:5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；and5,595,756,這些專利的每一個(gè)都被結(jié)合于此作為參考。

某些適應(yīng)癥

反義的特異性和靈敏度也被業(yè)內(nèi)人士用作治療效力的動(dòng)力。在處理動(dòng)物和人的病狀時(shí),反義寡核苷酸已經(jīng)被用作治療的組成部分。反義寡核苷酸藥物,包括核糖酶(ribozymes),已經(jīng)被安全有效地施用給人類,許多臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行之中。如此證實(shí)了寡核苷酸能成為有效的治療模式,它在治療細(xì)胞,組織和動(dòng)物,特別是人類的領(lǐng)域中可以作為有效的配置。

在本發(fā)明的某些實(shí)施例中提供了一種治療與ctgf表達(dá)有關(guān)的疾病或狀況,其特征在于,該疾病是一種過度增殖病癥,它包括癌癥,其特征在于,該癌癥是乳腺癌,前列腺癌,腎癌,胰腺癌,頭和頸癌,胃癌和多發(fā)性骨髓瘤(見picklesmandleaska,jcellcommunsignal.2007sep；1(2):85-90.epub2007jui17；mullist.c,tangx.,chongk.t.,jclinpathol.2008may；61(5):606-10；liul.y.,etal.worldjgastroenterol.2008apr7；14(13):2110-4；chintalapudim.r.,etal.,carcinogenesis.2008apr；29(4):696-703.epub2008jan22；munemasas.,etal.brjhaematol.2007oct；139(1):41-50；shimot.,etal.jboneminerres.2006jui；21(7):1045-59；andyangf.,etal.cancerres.2005oct1；65(19):8887-95.)

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該方法包含治療一種疾病或狀況,其特征在于,該疾病或失調(diào)是一種纖維變性病。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中,該纖維變性病是瘢痕肥大,瘢痕疙瘩,皮膚瘢痕,肝纖維化,肺纖維化,腎纖維化,心纖維化,或者再狹窄。

在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例中,該方法還包含治療上述的疾病或狀況,其特征在于,該疾病或失調(diào)是關(guān)節(jié)纖維化(包括凍結(jié)肩綜合癥,腱和周圍神經(jīng)損傷),脊髓損傷,冠狀動(dòng)脈搭橋,腹部和腹膜粘連(包括子宮內(nèi)膜異位癥,子宮平滑肌瘤和纖維瘤),角膜放射狀切開術(shù)和角膜光反射狀切開術(shù),視網(wǎng)膜再附著手術(shù),器械介導(dǎo)的纖維變性(例如在糖尿病中),腱粘連,掌攣縮病,或者硬皮病。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例也提供了一種在需要時(shí)減少受試者因皮膚傷口愈合引起的肥厚性瘢痕的方法,它包括給該受試者施加一定量的一種反義寡核苷酸化合物,有效地抑制結(jié)締組織生長因子(ctgf)的表達(dá)以減少受試者因傷口愈合引起的瘢痕。所述受試者可包括人或非人類的動(dòng)物。

治療組合物的配方以及其隨之的給藥被認(rèn)為是在業(yè)內(nèi)人士的技藝之中。劑量取決于要醫(yī)治的病狀的嚴(yán)重程度和應(yīng)答程度,隨著治療的進(jìn)程,持續(xù)幾天至數(shù)月,或者直至完成一個(gè)療程,或者實(shí)現(xiàn)了病狀的減輕。優(yōu)化的投藥時(shí)間進(jìn)度可以根據(jù)藥物在患者體內(nèi)積累量的測量來計(jì)算。有一般本領(lǐng)的人能容易地確定最佳劑量,給藥的方法和重復(fù)率。最佳劑量隨著各個(gè)寡核苷酸相對(duì)效力的不同而變,一般可以根據(jù)在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)的有效的ec50s來估計(jì)。通常的劑量為每kg體重從0,01μg到100g,可每天,每周,每月,或每年一次或數(shù)次,或者甚至每2-20年一次。根據(jù)測得的藥物在體液或組織中的停留時(shí)間及濃度,有一般本領(lǐng)的業(yè)內(nèi)人士能容易地估計(jì)出重復(fù)率。遵循成功的療法,讓患者經(jīng)受維持治療以防止病狀的復(fù)發(fā)可能是合乎理想的,其特征在于,寡核苷酸以維持劑量給藥,每kg體重從0,01μg到100g,每天一次或數(shù)次,至每20年一次。

在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例中,該方法還包含減少因皮膚傷口愈合引起的肥大瘢痕,其特征在于,傷口愈合為選自由皮膚破損,手術(shù)切口,和燒傷組成的這一組的傷口的愈合。

在某些實(shí)施例中,本發(fā)明提供了治療個(gè)體的方法,它們包含施用一種或多種本發(fā)明的藥用組合物。在某些實(shí)施例中,該個(gè)體有上述病癥中之一種。在某些實(shí)施例中,該個(gè)體處于上述病癥中之一種的危險(xiǎn)之中。在某些實(shí)施例中,該個(gè)體已經(jīng)被確認(rèn)需要治療。在某些實(shí)施例中,本發(fā)明提供了預(yù)防性的降低ctgf在個(gè)體中表達(dá)的方法。

某些實(shí)施例包括通過給一個(gè)個(gè)體施用有效治療量的靶向ctgf核酸的反義化合物來治療一個(gè)有需要的個(gè)體。

在一個(gè)實(shí)施例中,給一個(gè)個(gè)體施用有效治療量的靶向ctgf核酸的反義化合物的同時(shí)，監(jiān)視個(gè)體血清中ctgf的水平,以確定個(gè)體對(duì)反義化合物給藥的響應(yīng)。醫(yī)生利用個(gè)體對(duì)于反義化合物給藥的響應(yīng)來確定治療介入的量與持續(xù)時(shí)間。

在一個(gè)實(shí)施例中,施用靶向ctgf核酸的反義化合物的導(dǎo)致ctgf表達(dá)程度的降低了至少15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或99％,或者由任意兩個(gè)這些數(shù)值規(guī)定的范圍。在一個(gè)實(shí)施例中,施用靶向ctgf核酸的反義化合物的導(dǎo)致如標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測量例如,但不限于,ctgf那樣的ctgf測量值的變化。在某些實(shí)施例中,施用ctgf反義化合物增加了該測量值至少15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或99％,或者由任意兩個(gè)這些數(shù)值規(guī)定的范圍。在某些實(shí)施例中,施用ctgf反義化合物降低了該測量值至少15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或99％,或者由任意兩個(gè)這些數(shù)值規(guī)定的范圍。

在某些實(shí)施例中,包含靶向ctgf的反義化合物的藥用組合物被用來制備藥物以治療患有或者疑似患有上述病癥之中任意一種的患者。

某些聯(lián)合治療

在某些實(shí)施例中,本發(fā)明的一種或多種藥用組合物與一種或多種其他藥劑一起給藥。在某些實(shí)施例中,這樣的一種或多種其他藥劑被設(shè)計(jì)來治療相同的一種或多種本發(fā)明的藥用組合物要治療的疾病或狀況。在某些實(shí)施例中,這樣的一種或多種其他藥劑被設(shè)計(jì)來治療不同的一種或多種本發(fā)明的藥用組合物要治療的疾病或狀況。在某些實(shí)施例中,這樣的一種或多種其他藥劑被設(shè)計(jì)來處理一種或多種本發(fā)明的藥用組合物所帶來的不希望得到的后果。在某些實(shí)施例中,一種或多種本發(fā)明的藥用組合物與另一種其他藥劑一起給藥,來處理那另一種其他藥劑所帶來的不希望得到的后果。在某些實(shí)施例中,一種或多種本發(fā)明的藥用組合物與一種或多種其他藥劑同時(shí)給藥。在某些實(shí)施例中,一種或多種本發(fā)明的藥用組合物與一種或多種其他藥劑在不同時(shí)間給藥。在某些實(shí)施例中,一種或多種本發(fā)明的藥用組合物與一種或多種其他藥劑一起制備成一個(gè)單一配方。在某些實(shí)施例中,一種或多種本發(fā)明的藥用組合物與一種或多種其他藥劑分別配制。

在某些實(shí)施例中,可以與本發(fā)明的一種藥用組合物一起給藥的藥劑包括一種第二治療劑。在某些實(shí)施例中,可以與本發(fā)明的一種藥用組合物一起給藥的藥劑包括,辦不限于第二治療劑。在某些這樣的實(shí)施例中,該第二治療劑在本發(fā)明的一種藥用組合物給藥之前施用。在某些這樣的實(shí)施例中,該第二治療劑在本發(fā)明的一種藥用組合物給藥之后施用。在某些這樣的實(shí)施例中,該第二治療劑與本發(fā)明的一種藥用組合物同時(shí)施用。在某些這樣的實(shí)施例中,一起給藥的第二治療劑的劑量與如果該第二治療劑單獨(dú)給藥時(shí)的劑量相同。在某些這樣的實(shí)施例中,一起給藥的第二治療劑的劑量比如果該第二治療劑單獨(dú)給藥時(shí)的劑量低。在某些這樣的實(shí)施例中,一起給藥的第二治療劑的劑量比如果該第二治療劑單獨(dú)給藥時(shí)的劑量大。

在某些實(shí)施例中,一種第二化合物的共同給藥增強(qiáng)了第一化合物的療效,如此,兩種化合物的共同給藥導(dǎo)致療效高于該第一化合物單獨(dú)給藥帶來的效果,是一種協(xié)同效應(yīng)。在其他的實(shí)施例中,共同給藥導(dǎo)致療效是兩種化合物單獨(dú)給藥時(shí)效果的疊加。在其他的實(shí)施例中,共同給藥導(dǎo)致療效超過兩種化合物單獨(dú)給藥時(shí)效果的疊加。在一些實(shí)施例中,該第一化合物是一種反義化合物。在一些實(shí)施例中,該第二化合物是一種反義化合物。

在以下的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)部分來闡明本發(fā)明。提出這部分是為了幫助對(duì)于本發(fā)明的理解,但無意而且不應(yīng)該被解釋為以任何方式來限制在下面的權(quán)利要求書中所提出的本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)1：細(xì)胞培養(yǎng)及反義化合物處理

反義化合物對(duì)ctgf核酸的水平,活性或者表達(dá)的作用可以在各種細(xì)胞類型上進(jìn)行體外的測試?？梢詮纳虡I(yè)的供應(yīng)商那里獲得用于這樣分析的細(xì)胞類型(例如,americantypeculturecollection,manassus,va；zen-bio,inc.,researchtrianglepark,nc.,cloneticscorporation,walkersville,md),細(xì)胞培養(yǎng)采用市售的試劑按照供應(yīng)商的說明書進(jìn)行(例如,invitrogenlifetechnologies,carlsbad,ca)。例證性的細(xì)胞類型包括,但不限于hepg2細(xì)胞,hep3b細(xì)胞和原發(fā)性肝細(xì)胞(primaryhepatocytes)。

實(shí)驗(yàn)2：反義寡核苷酸的體外測試

在此描述的是利用反義寡核苷酸處理細(xì)胞的方法,在利用其他反義化合物處理細(xì)胞時(shí),這些方法可作適當(dāng)變化。

通常,當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)物中達(dá)到約60-80％的克隆率(confluency)時(shí),用反義寡核苷酸來處理細(xì)胞。

一種常用的將反義寡核苷酸引入到培養(yǎng)的細(xì)胞中的試劑包括陽離子型類脂轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen,carlsbad,ca)。反義寡核苷酸與在1(invitrogen,carlsbad,ca)中混合,達(dá)到反義寡核苷酸最后希望的濃度和濃度,典型地,濃度范圍為每100nm反義寡核苷酸在2-12μg/ml。

另一種用于將反義寡核苷酸引入到培養(yǎng)的細(xì)胞中的試劑包括(invitrogen,carlsbad,ca)。反義寡核苷酸與在1還原血清介質(zhì)(invitrogen,carlsbad,ca)中混合,達(dá)到反義寡核苷酸最后希望的濃度和濃度,典型地,濃度范圍為每100nm反義寡核苷酸在2-12μg/ml。

通過常規(guī)方法用反義寡核苷酸處理細(xì)胞。典型地,在反義寡核苷酸處理后的16-24小時(shí)之后采集細(xì)胞,此時(shí),采用業(yè)內(nèi)知曉的和在此描述的方法測量靶核酸的rna或者蛋白水平。通常,當(dāng)進(jìn)行多個(gè)重復(fù)處理,數(shù)據(jù)以重復(fù)處理的平均值提出。

所采用的反義寡核苷酸濃度根據(jù)不同的細(xì)胞系是變化的。對(duì)于一種特定細(xì)胞系,確定反義寡核苷酸最佳濃度的方法為業(yè)內(nèi)所熟知。反義寡核苷酸使用濃度的典型范圍為1-300nm。

實(shí)驗(yàn)3：rna分離

rna分析可以在總細(xì)胞rna或者多聚腺苷酸(poly(a))+mrna上進(jìn)行。分離rna的方法為業(yè)內(nèi)所熟知。采用業(yè)內(nèi)熟知的方法制備rna,例如采用試劑(invitrogen,carlsbad,ca)按照制造商推薦的草案來操作。

實(shí)驗(yàn)4：目標(biāo)水平或表達(dá)的抑制的分析

ctgf核酸的水平或表達(dá)抑制可以用業(yè)內(nèi)知曉的各種方法來分析。例如,靶核酸水平可以通過northern印跡分析,競爭聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，pcr),或者定量實(shí)時(shí)pcr來定量。rna分析可以在總細(xì)胞rna或者多聚腺苷酸(poly(a))+mrna上進(jìn)行。分離rna的方法為業(yè)內(nèi)所熟知。northern印跡分析也是業(yè)內(nèi)的常規(guī)手段。利用市售的abiprism7600,7700或7900測序系統(tǒng)(pe-appliedbiosystems,fostercity,ca出品)按照制造商的說明書操作可以方便地完成定量實(shí)時(shí)pcr。

實(shí)驗(yàn)5：靶rna水平的定量實(shí)時(shí)pcr分析

靶rna水平的定量可以利用abiprism7600,7700或7900測序系統(tǒng)(pe-appliedbiosystems,fostercity,ca出品)按照制造商的說明書操作,完成定量實(shí)時(shí)pcr。定量實(shí)時(shí)pcr的方法為業(yè)內(nèi)所熟知。

在實(shí)時(shí)pcr進(jìn)行之前,分離出來的rna要經(jīng)歷一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase，rt)反應(yīng)，其產(chǎn)生互補(bǔ)dna(cdna)作為隨后實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增的底物。rt和實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)依次在同樣的樣品池完成。rt和實(shí)時(shí)pcr的試劑從invitrogen(carlsbad,ca)購得。rt和實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)用為業(yè)內(nèi)人士所熟知的方法進(jìn)行。

由實(shí)時(shí)pcr獲得的基因(或者rna)靶的數(shù)量利用其表達(dá)為常數(shù)的基因的表達(dá)水平,像親環(huán)蛋白a(cyclophilina)的表達(dá)水平,或者通過用(invitrogen,carlsbad,ca)來定量總rna的方法被歸一化。親環(huán)蛋白a的表達(dá)通過實(shí)時(shí)pcr來定量,通過與靶同時(shí)運(yùn)行,多通道或者分別測?？俽na利用rna定量分析試劑(invitrogen,eugene,or)來定量。利用定量分析rna的方法見jones,l.j.,etal(analyticalbiochemistry,1998,265,368-374)的講授?？梢圆捎?imgfile="bda0001139004640000504.gif"wi="338"he="58"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>4000儀器(peappliedbiosystems)來測量的熒光。

探針和引物被設(shè)計(jì)成與ctgf核酸雜交。設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)pcr探針和引物的方法為業(yè)內(nèi)所熟知,可以包括運(yùn)用像primersoftware(appliedbiosystems,fostercity,ca)那樣的軟件。

實(shí)驗(yàn)6：蛋白水平分析

通過測量ctgf蛋白水平可以評(píng)估ctgf核酸的反義抑制。ctgf蛋白水平可以用各種業(yè)內(nèi)熟知的方法,像免疫沉淀法,如下面實(shí)驗(yàn)9中描述的western印跡分析(免疫印跡),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa),定量蛋白試驗(yàn),蛋白活性試驗(yàn)(例如半胱天冬酶(caspase)活性試驗(yàn)),免疫組織化學(xué),免疫細(xì)胞化學(xué)或者熒光活化的細(xì)胞分選(fluorescence-activatedcellsorting，facs)來評(píng)估或量化。定向一個(gè)靶的抗體可以從各種來源加以識(shí)別和獲得,像msrs抗體目錄(aeriecorporation,birmingham,mi),或者可以利用業(yè)內(nèi)熟知的常規(guī)的產(chǎn)生單克隆抗體或多克隆抗體的方法來制備。用于檢測人和鼠的ctgf的抗體可在市場上買到。

實(shí)驗(yàn)7：反義化合物在體內(nèi)的測試

反義化合物,例如反義寡核苷酸,在動(dòng)物身上試驗(yàn)以評(píng)估它們抑制ctgf表達(dá)和產(chǎn)生表型變化的能力?？梢栽谡５膭?dòng)物身上進(jìn)行試驗(yàn),也可以在實(shí)驗(yàn)疾病模型中進(jìn)行。對(duì)動(dòng)物給藥時(shí),反義寡核苷酸被配制在一種藥用可接受的稀釋劑,像磷酸鹽緩沖的鹽水中。給藥包括不經(jīng)腸道途徑的給藥,像腹膜內(nèi)的,靜脈內(nèi)的,和皮下的給藥。反義寡核苷酸劑量和給藥頻率的計(jì)算是在業(yè)內(nèi)人士的技藝能力中的,它取決于像給藥途徑和動(dòng)物體重那樣的因素。用反義寡核苷酸處理一段時(shí)間后,從肝組織中分離出rna,測量ctgf核酸表達(dá)的變化。利用上面實(shí)驗(yàn)6中描述的方法還測量ctgf蛋白水平的變化。

實(shí)驗(yàn)8：人類結(jié)締組織生長因子(ctgf)先導(dǎo)反義寡核苷酸候選物的選擇

引言

依照本發(fā)明,采用發(fā)表過的序列(genbankaccessionnumbernm_001901.2,并入在此的seqidno:9,以及genbankaccessionnumbernm_025741.14,并入在此的seqidno:10),設(shè)計(jì)了一系列的寡核苷酸以靶向人結(jié)締組織增生因子rna的不同區(qū)域。

該研究分析了可用的序列空間和靶向ctgf的外顯子空間及內(nèi)含子空間的修飾反義寡核苷酸。每個(gè)靶約有150個(gè)新的序列被合成和評(píng)估其阻止ctgf在細(xì)胞-培養(yǎng)物中的活性。這些寡核苷酸與表1所示。表1中的所有化合物是長度為20個(gè)核苷酸的嵌合型寡核苷酸(“gapmers”),它由中間的“缺口”(“gap”)區(qū)域組成,該區(qū)域由10個(gè)2’-脫氧核苷酸組成,兩端(5’和3’方向上)被5個(gè)核苷酸“翼”(“wing”)側(cè)面包圍住,或者該區(qū)域由13個(gè)2’-脫氧核苷酸組成,兩端(5’和3’方向上)分別被2個(gè)和5個(gè)核苷酸“翼”側(cè)面包圍住。該翼由2’-甲氧基乙基(2’-moe)核苷酸組成。在整個(gè)寡核苷酸中的核苷間(骨架)連接是硫代磷酸酯(p＝s)。所有的胞嘧啶核苷殘基為5-甲基胞嘧啶核苷。利用在其他例子中描述過的定量實(shí)時(shí)pcr來分析這些化合物對(duì)于人結(jié)締組織增生因子mrna水平的影響作用。數(shù)據(jù)為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。表中如果出現(xiàn)“n.d.”則表示“沒有數(shù)據(jù)”。

表1

具有2’-moe翼和脫氧缺口的嵌合型硫代磷酸酯寡核苷酸對(duì)人結(jié)締組織增生因子mrna水平的抑制

^*nd–即實(shí)驗(yàn)中未測定,但在其他的試驗(yàn)中是高度活性的。

如表1所示,seqidnos11-15,17-20,24,26-34,36-57,59,61,63-82,84-86,88,95,97,99,102,103,105,107,108,122,125,127-140,145,146,149,151-154,156,159,161-165證實(shí)了該試驗(yàn)中對(duì)于人結(jié)締組織增生因子表達(dá)的抑制率至少為24％，因此是優(yōu)選的。與這些優(yōu)選序列互補(bǔ)的靶位點(diǎn)在在此被稱之為“活性位點(diǎn)”,因而是本發(fā)明的化合物靶向的優(yōu)選位點(diǎn)。

反義化合物在ctgf序列的一個(gè)核苷酸范圍內(nèi)是互補(bǔ)的,即在seqidno:9的核苷酸718-751,1388-1423,1457-1689,2040-2069,2120-2147,或者2267-2301的范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。在某個(gè)實(shí)施例中,反義化合物在seqidno:10的核苷酸2728-2797的范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。靶向這些范圍的化合物證實(shí)了至少50％的抑制率(即seqidnos:15,29,31,42,46-49,53,72,81,82,152-154,164,和165)。表1中的某些靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少50％的抑制率(即seqidnos:12,20,33,34,76,107,129,132,134,136,和146)。

在某些實(shí)施例中,反義化合物在核苷酸553-611,1394-1423,1469-1508,1559-1605,1659-1689或2100-2129的范圍內(nèi)是互補(bǔ)的。靶向這些范圍的化合物證實(shí)了至少60％的抑制率(即seqidnos:27,38,43,50,52,54,55，77,79,和86)。表1中的某些靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少60％的抑制率即seqidnos:24,61,63,67,69,73,125,139,和161)。

反義化合物在核苷酸1399-1423的范圍內(nèi)也是互補(bǔ)的。靶向這些范圍的化合物證實(shí)了至少70％的抑制率(即seqidnos:39和40)。表1中的某些靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少70％的抑制率(即seqidnos:28,30,45,51,56,78,128,和138)。列于表1中的一個(gè)靶位點(diǎn)也證實(shí)了至少80％的抑制率(即seqidno:44)。在某些實(shí)施例中,當(dāng)該反義化合物在50nm的濃度下被傳遞給huvec細(xì)胞時(shí),實(shí)現(xiàn)了百分抑制。

多個(gè)先導(dǎo)序列在其外顯子和內(nèi)含子序列中都發(fā)現(xiàn)它們的活性明顯高于過去的aso先導(dǎo)序列,seqidno.15(isis124238)。

對(duì)9個(gè)高活性的序列(seqidnos:28,30,39,40,45,52,56,78,125)完成了劑量應(yīng)答研究(見圖8)。seqno.13和15(isis124212和isis124238)是先前指定的寡核苷酸,seqidno:167(isis141923，序列ccttccctgaaggttcctcc)為陰性對(duì)照。

材料和方法

寡核苷酸在人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)中,濃度為50nm下,利用lipofectin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染被篩選和確認(rèn)。從cascadebiologics(portland,or)購得的huvec細(xì)胞被保存在補(bǔ)充有低血清生長添加物(lowserumgrowthsupplement,購自cascadebiologics)的培養(yǎng)基medium200中,huvec細(xì)胞被鋪在96池的平皿上,每池5000個(gè)細(xì)胞,37℃和5％co2存在下培養(yǎng)過夜。第二天,該培養(yǎng)基被吸出(aspirated),被替換成預(yù)熱過的opti-memi(invitrogen公司制備),其中含有oligo-lipofectamine2000(invitrogen公司制備)的混合物(每1ml的opti-memi培養(yǎng)基中含3mg的lipofectamine2000)。4小時(shí)后,該轉(zhuǎn)染混合物被換成新配制的補(bǔ)充有低血清生長添加物的新鮮培養(yǎng)基medium200,在37℃和5％co2存在下培養(yǎng)。16-24小時(shí)后,約80％的克隆率,細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebuffersaline,pbs)洗滌,溶化,用qiagenrneasykit試劑盒進(jìn)行rna提純。ctgf信息由定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)測量(引物/探針組見下面),結(jié)果被歸一化為總rna。

統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品一式兩份做分析,豎直條表示兩個(gè)測量值之間的差距。

結(jié)果與討論

靶向每個(gè)靶合成了大約150個(gè)新序列，并對(duì)評(píng)估了其在培養(yǎng)液中阻止ctgf的活性，新的ctgf寡核苷酸(seqidnos:28,30,39,40,45,52,56,78,125,和166)表現(xiàn)出優(yōu)異的對(duì)人ctgfmrna表達(dá)的抑制。識(shí)別出的高度活性的寡核苷酸見圖7。

若干新的內(nèi)顯子(圖4,5和6)以及外顯子(圖1,2和3)的寡核苷酸令人驚訝地遠(yuǎn)比過去篩選出來的化合物包括isis124238活性要高。

反義靶向外顯子的功效一般要比那些靶向內(nèi)含子的高(圖7a)。圖7b提供了這些外顯子核苷酸的序列。

利用上述的方法,在huvec細(xì)胞中通過劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了10個(gè)活性最好的反義寡核苷酸。

實(shí)驗(yàn)9：結(jié)締組織生長因子蛋白水平的western印跡分析

western印跡分析(免疫印跡分析)用標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行。在寡核苷酸處理后的16-24小時(shí)后收集細(xì)胞,用pbs洗滌一次,懸浮在laemmli緩沖液中(100μl/池),煮沸5分鐘,上載到16％sds-page凝膠上。凝膠在150v下運(yùn)行1.5個(gè)小時(shí),轉(zhuǎn)移到薄膜上作western印跡。采用了適當(dāng)?shù)陌邢蚪Y(jié)締組織生長因子的初級(jí)抗體,并使用直接抗初級(jí)抗體種類的放射標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的次級(jí)抗體。用phosphorimager^tm(moleculardynamics,sunnyvalecalif.)使條帶可視化。

實(shí)驗(yàn)10：ctgf反義寡核苷酸實(shí)驗(yàn)小鼠毒性研究

研究目的

該實(shí)驗(yàn)毒性研究的目的是評(píng)估三種向靶人ctgf的寡核苷酸對(duì)正常的雄性balb/c小鼠的潛在毒性。試驗(yàn)的寡核苷酸是isis序列412294(seqidno:39),412295(seqidno:40),和418899(seqidno:166)。

方法

雄性balb/c小鼠(約8周大),重約25克,在整個(gè)研究過程中喂以一般的飲食實(shí)驗(yàn)室食物。通過皮下(sq)向鼠給藥,每周兩次25或50mg/kg的反義寡核苷酸，連續(xù)4周(n＝6)。測量了下述的端點(diǎn)值：

●每周體重；

●4周時(shí)的血漿化學(xué)組成；

●尸體剖檢時(shí)的器官重量,體重；和

●肝和腎的h&e(hematoxylin–eosi，蘇木精-伊紅染色)色斑

結(jié)果

跟隨4周給藥25或50mg/kg的反義寡核苷酸isis序列412294(seqidno:39),412295(seqidno:40),和418899(seqidno:166)的結(jié)果表明若干端點(diǎn)值與鹽水處理對(duì)照組小鼠的有較大不同。這些區(qū)別包括:

1)血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast)水平在跟隨4周給藥25或50mg/kg的412294(seqidno:39),412295(seqidno:40),或者25mg/kg的418899(seqidno:166)后與鹽水(媒介物)對(duì)照組的水平相似,但是,給藥50mg/kg的418899(seqidno:166)的小鼠顯示出alt/ast水平升高,明顯高于對(duì)照組所觀察到的值(見圖9a和9b)。這個(gè)結(jié)果令人感到意外,在以往的研究或基于細(xì)胞的試驗(yàn)中沒有預(yù)期過。

2)50mg/kg的412295處理組的體重增加大大低于對(duì)照組的體重增加(見圖10)。

結(jié)論

序列seqidno:39(isis412294)沒有表現(xiàn)出如序列seqidno:40(isis412295)和序列seqidno:166(isis418899)那樣多的毒物學(xué)特征。其結(jié)果完成出于意料，通過這些寡核苷酸序列的細(xì)胞培養(yǎng)液行為而沒有預(yù)計(jì)到。

實(shí)驗(yàn)11：鼠的ctgf反義寡核苷酸(seqidno:163)對(duì)膠原的作用以及ctgfmrna在受傷的鼠身上的表達(dá)

目的

ctgf反義寡核苷酸seqidno:163(isis412442)被用于檢驗(yàn)ctgf反義寡核苷酸降低ctgf和co11a2(一種瘢痕的生物標(biāo)志物)在瘢痕的鼠動(dòng)物模型上表達(dá)的能力。該反義寡核苷酸與seqidno:39(isis412294)的化學(xué)結(jié)構(gòu)相同,但是其序列已稍加修飾,以100％與鼠mrna序列互補(bǔ)。

創(chuàng)傷

四支全厚度0.8cm的活組織檢查鉆被插進(jìn)10周大(研究項(xiàng)目的第一天)無毛鼠的背部,脊柱中線的每一邊有兩支。傷口保持開放,但是用消毒咬合繃帶敷裹。

反義寡核苷酸給藥

在活檢后的第1,5,9,和13天,在動(dòng)物右側(cè)的兩個(gè)活檢點(diǎn)用3.0,1.0,0.3或0.1mg的反義寡核苷酸作真皮內(nèi)的處理。動(dòng)物左側(cè)的活檢點(diǎn)用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)作真皮內(nèi)的處理。動(dòng)物在活檢后的第15天被處死?？偭繛?00μl的反義寡核苷酸或pbs被輸送進(jìn)入每個(gè)鉆孔器活檢點(diǎn)。該200μl的體積被分成四份50μl的等分注射到傷口的四周圍,大約離傷口的左,右,頂部,和底部0.25-0.5cm。

樣本收集/處死

在處死的日子鼠被處以安樂死,從傷口中心得到一塊帶有0.5cm活檢鉆的皮膚樣本，采用標(biāo)準(zhǔn)步驟從這些樣本中提取mrna。進(jìn)行鼠ctgf和co11a2的rt-pcrmrna分析,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法作數(shù)據(jù)分析,采用ribogreen作為內(nèi)務(wù)/正態(tài)化基因。

結(jié)果

所有劑量處理鼠的結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上看出ctgf和co11a2的表達(dá)都有顯著降低(見圖11)。這些結(jié)果清楚地證實(shí)了用2’-moe修飾的反義寡核苷酸對(duì)ctgf表達(dá)的抑制會(huì)減少膠原在皮膚上的沉積,這會(huì)導(dǎo)致形成皮膚瘢痕的嚴(yán)重程度得以緩解。

實(shí)驗(yàn)12：在兔身上ctgf反義寡核苷酸的單劑量真皮內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究

研究目的

在兔子身上的該藥物動(dòng)力學(xué)研究的目的是評(píng)估ctgf反義寡核苷酸(seqidno:39,isis412294)在單次真皮內(nèi)(intra-dermally)注射后的不同時(shí)間點(diǎn)的兔皮膚中的濃度。

研究設(shè)計(jì)

在研究的0天,所有動(dòng)物通過單次注射100μl的ctgf反義寡核苷酸seqidno:39進(jìn)行真皮內(nèi)給藥,濃度為50mg/ml(總劑量為5mg)。給動(dòng)物施用反義寡核苷酸的位置在脊柱中線的左側(cè),與兔子的肩膀大致平行。將針插進(jìn)去以使試驗(yàn)材料被朝著身體的底部往下注射進(jìn)去。在第1,3,7或14天動(dòng)物被處安樂死,獲得兩個(gè)全厚度為1.0cm的鉆孔活檢樣,一個(gè)是在原注射點(diǎn)的中心,另一個(gè)是垂直往下距離0.5cm遠(yuǎn)。在分析反義寡核苷酸藥物水平之前,樣本被速凍并被保存在-80℃下。結(jié)果代表了在顯示的時(shí)間點(diǎn)上來自兩個(gè)活檢樣的平均反義寡核苷酸水平。

結(jié)果與結(jié)論

真皮內(nèi)給藥后直至至少14天,反義寡核苷酸顯示出顯著的水平(見圖12)。藥物的治療濃度為1-100μg/g組織。這些結(jié)果首次證實(shí)具有這種化學(xué)構(gòu)型的2’-moe反義寡核苷酸在皮膚中的停留時(shí)間會(huì)延長,這些結(jié)果清楚地表明這一類的化合物在皮膚中的治療潛力。

實(shí)驗(yàn)13：基因組搜索

seqidno:39誘發(fā)有害的,可能會(huì)翻譯為“脫靶”(“off-target”)毒性的反義作用的潛力被評(píng)估,這是通過搜索人類基因組數(shù)據(jù)庫尋找與seqidno:39核苷酸序列完全或部分同源或互補(bǔ)的序列來進(jìn)行的。

全面搜索了已經(jīng)發(fā)表的人類dna序列數(shù)據(jù)庫以評(píng)估包含seqidno:39的序列是否與人類基因的已知陣列充分地同源,以至于不希望發(fā)生的反義或其他抑制的活性可能會(huì)發(fā)揮出來阻止靶標(biāo)ctgf(結(jié)締組織生長因子)外的人類基因產(chǎn)物的表達(dá),因而誘發(fā)“脫靶”的效果。該搜索需要篩選范圍在20個(gè)核苷酸(即seqidno:39的全長)下至12個(gè)核苷酸的同源序列。

在與seqidno:39同源的有20個(gè),19個(gè)或18個(gè)堿基的人類基因組中未檢出脫靶位點(diǎn)。有18個(gè),19個(gè)或20個(gè)堿基對(duì)而完全沒有脫靶位點(diǎn)表明任何推論的脫靶活性的可能性是最低的。識(shí)別到有三個(gè)17-堿基的seqidno:39的同源物。其中之一是lrfn2基因在內(nèi)含子之內(nèi)。內(nèi)含子典型地在mrna到達(dá)細(xì)胞質(zhì),seqidno:39的作用位點(diǎn)之前就從轉(zhuǎn)錄物中被剪接出。因此,seqidno:39預(yù)料到不會(huì)影響lrfn2的表達(dá)。另外兩個(gè)17-堿基的同源物位于基因間的間隔區(qū)(spacerregions)?；蜷g的間隔區(qū)通常不被轉(zhuǎn)錄,但是作為雙鏈dna存在于細(xì)胞核的隔間(nuclearcompartment)中,與seqidno:39的作用位點(diǎn)隔開。因此不必?fù)?dān)心17-堿基的同源物。

在發(fā)現(xiàn)的16-堿基,15-堿基和14-堿基同源物中間,只有一個(gè)是位于一個(gè)已知的或懷疑的轉(zhuǎn)錄物(即frmd5,它編碼在肝臟中活躍的一種類脂生物合成轉(zhuǎn)移酶)之中。但是,該帶有一個(gè)mrna的正向轉(zhuǎn)錄物(sensetranscript)的14-堿基seqidno:39同源物可能不會(huì)有益于反義活性(即,如果seqidno:39序列的一部分是與該mrna轉(zhuǎn)錄物的序列互補(bǔ)的,而不是同源的,只可能發(fā)生雜交)。因此，序列seqidno:39不會(huì)影響這個(gè)轉(zhuǎn)錄。所有其他的16-堿基至14-堿基的同源物相應(yīng)于內(nèi)含子或者基因間的間隔區(qū),沒有重疊的轉(zhuǎn)錄物,沒有預(yù)料的轉(zhuǎn)錄物或者被表達(dá)的序列標(biāo)記物。沒有13-堿基的同源物。與一個(gè)像seqidno:39有著預(yù)定靶標(biāo)的那樣的有20-堿基的寡核苷酸的結(jié)合相比,任何基于只有12個(gè)或更短的核苷酸同源物的轉(zhuǎn)錄物可能會(huì)呈現(xiàn)出一個(gè)熱力學(xué)上不利的靶標(biāo)。因此,12-堿基及更短的同源物不表現(xiàn)出有脫靶反義活性的顯著潛力。

因此，人基因組數(shù)據(jù)庫搜索表明序列seqidno:39對(duì)于預(yù)定靶標(biāo)具有高度的專一性，而僅有最低的脫靶效應(yīng)的潛力。

實(shí)驗(yàn)14：第i階段單劑量真皮內(nèi)臨床研究以評(píng)估一種ctgf反義寡核苷酸(seqidno:39)的安全性及耐受度

研究目的

將人類ctgf反義寡核苷酸seqidno:39(isisno.412294)通過真皮內(nèi)給藥施用給六個(gè)患者(總劑量80mg),作為第i階段研究計(jì)劃的一部分以評(píng)估單劑量藥物的安全性及耐受度。

結(jié)果

除了局部注射點(diǎn)的反應(yīng),像紅斑,發(fā)炎,癢,和硬結(jié)之外,沒有報(bào)告過不利的事件。列出的不利事件報(bào)告了有約50％的受試者，在嚴(yán)重程度水平是“最小”上。未提到在血清化學(xué)組成,血液學(xué),尿液分析,ecgs,生命體征,體格檢查,和補(bǔ)體活化有什么變化。

結(jié)論

人可以很好地耐受ctgf反義寡核苷酸在預(yù)期是治療劑量范圍內(nèi)的給藥,證實(shí)了該化合物在治療皮膚瘢痕上的安全性。

實(shí)驗(yàn)15：真皮內(nèi)給藥后反義寡核苷酸(seqidno:39)在人皮膚中的藥物水平

在一項(xiàng)初期的臨床研究中,在一同期組群的患者中評(píng)估了皮膚藥物水平,其中5個(gè)患者每人接受了40mg的反義寡核苷酸(aso)(10份相等劑量給藥,每份4mg)。在頭一天單劑量給藥aso后的21天在模擬的手術(shù)傷口位置上(在皮膚上劃一條線作為給藥位置的參考)獲得了皮膚活檢物。鉆活檢物(punchbiopsy)由一塊4mm圓柱形組織樣本的芯子構(gòu)成。利用毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記的序列特異性探針來測定aso的水平,測得為84.2μg/g組織。aso藥物治療濃度預(yù)期為1-100μg/g組織。

這些結(jié)果首次證實(shí)了真皮內(nèi)給藥之后，具有這種化學(xué)構(gòu)型的2’-moe反義寡核苷酸在人類皮膚中的停留時(shí)間會(huì)延長,這些結(jié)果清楚地表明這一類的化合物在皮膚中的治療潛力。

實(shí)驗(yàn)16：seqidno:39在經(jīng)受選擇腹壁整形術(shù)的受試者身上降低瘢痕嚴(yán)重程度的第ii階段隨機(jī),雙盲,受試者內(nèi)的對(duì)照臨床功效和安全性研究

該項(xiàng)研究是隨機(jī)的,雙盲,受試者內(nèi)對(duì)照的研究以評(píng)估ctgf反義寡核苷酸seqidno:39(即該藥品)的功效和安全性。通過真皮內(nèi)注射到經(jīng)歷可選擇的腹壁整形術(shù)的受試者,該藥產(chǎn)品被施用到貼近腹壁整形術(shù)切口的兩側(cè)。

在中線兩側(cè)的一段腹壁整形術(shù)切口,剛好在陰毛的外側(cè),在手術(shù)切口關(guān)閉之后用藥品或安慰劑處理。

該研究的延續(xù)時(shí)間約為24周。受試者接受腹壁整形術(shù)在第一天，接著施用該藥品和安慰劑10周以上。每4周觀察和評(píng)估瘢痕直至第12周,在第24周時(shí)再觀察和評(píng)估瘢痕。

通過對(duì)切口的每個(gè)匹配對(duì)(matchedpair)評(píng)級(jí)來確定功效。

腹壁整形術(shù)后的第12和24周,采用下述的兩種方法對(duì)切口瘢痕的嚴(yán)重程度評(píng)分以評(píng)估功效:

●利用視覺類比評(píng)分(visualanalogscale，vas)的專家組對(duì)不知情的照片的評(píng)估

●調(diào)查者瘢痕評(píng)估標(biāo)度，受試者瘢痕評(píng)估標(biāo)度

seqidno:39對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判是有效的。

實(shí)驗(yàn)17：seqidno:39在經(jīng)受因先前的乳房還原或乳房固定術(shù)引起的內(nèi)側(cè)瘢痕選擇修正的受試者身上降低皮膚瘢痕的第ii階段隨機(jī),雙盲,受試者內(nèi)的對(duì)照的臨床功效和安全性研究

該項(xiàng)研究是隨機(jī)的,雙盲,受試者內(nèi)對(duì)照的研究以評(píng)估ctgf反義寡核苷酸seqidno:39(即該藥品)的功效和安全性。通過真皮內(nèi)注射,該藥品被給到修正乳房還原瘢痕的內(nèi)側(cè)部分。手術(shù)后切口關(guān)閉，該修正的乳房傷口/瘢痕內(nèi)側(cè)部分的任意一側(cè)的一段用藥產(chǎn)品或安慰劑處理。

招募到達(dá)40名受試者參與該項(xiàng)研究。該研究的延續(xù)時(shí)間約為24周。受試者接受瘢痕修正在第一天，接著10周施用該藥品和安慰劑。每4周觀察和評(píng)估瘢痕直至第12周,在第24周時(shí)再觀察和評(píng)估瘢痕。

通過給每一個(gè)切口的匹配對(duì)評(píng)分來確定功效。在乳房還原瘢痕的內(nèi)側(cè)部分修正后的第12周和第24周,采用對(duì)切口瘢痕嚴(yán)重程度評(píng)分的兩種方法來評(píng)估功效:

●利用視覺類比評(píng)分(vas)的專家組對(duì)不知情的照片的評(píng)估

●調(diào)查者瘢痕評(píng)估標(biāo)度，受試者瘢痕評(píng)估標(biāo)度

seqidno:39對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判是有效的。

序列表

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isis制藥有限公司

<120>阻止結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸及其用途

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<212>dna

<213>智人

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<222>(130)..(1180)

<400>2

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的正向pcr引物

(ctgf)

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反向pcr引物

(ctgf)

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<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的pcr探針

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<223>針對(duì)人類gapdh的正向pcr引物

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<220>

<223>針對(duì)人類gapdh的pcr探針

<400>8

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<210>9

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<213>智人

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<221>exon

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<400>9

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330335340345

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tcagctacctacttcctaaaaaggatgtatgtcagtggacagaacagggcaaacttattc720

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t6001

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<220>

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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<213>人工序列

<220>

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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<213>人工序列

<220>

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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<213>人工序列

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(ctgf)

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(ctgf)

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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(ctgf)

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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ttggagataacgggcttata20

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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ctcattccagcaaaacagct20

<210>136

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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tacacaagctctcattccag20

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

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<213>人工序列

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<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>144

tggaatgtcttgaattaact20

<210>145

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

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<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>146

aaaaatagccagagcctctc20

<210>147

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>147

tgtccaaaaatagccagagc20

<210>148

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>148

tgctatgtccaaaaatagcc20

<210>149

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>149

tcatttgctatgtccaaaaa20

<210>150

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>150

gagtctcatttgctatgtcc20

<210>151

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>151

agtttgagtctcatttgcta20

<210>152

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>152

gaggaagtttgagtctcatt20

<210>153

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>153

cttctgttgtctgacttctg20

<210>154

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>154

cctctgtgttttagtcttct20

<210>155

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>155

tttcttcaaccctctgtgtt20

<210>156

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>156

ggagtggctttcttcaaccc20

<210>157

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>157

aggaagacaagggaaaagag20

<210>158

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>158

ttctaaggaagacaagggaa20

<210>159

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>159

tgcccttctaaggaagacaa20

<210>160

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>160

ggatgcgagttgggatctgg20

<210>161

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>161

ccagctgcttggcgcagacg20

<210>162

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>162

gccagaaagctcaaacttga20

<210>163

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>163

ccacaagctgtccagtctaa20

<210>164

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>164

ggtcacactctcaacaaata20

<210>165

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>165

aaacatgtaacttttggtca20

<210>166

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>166

tgacatggcacaatgttttg20

<210>167

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>針對(duì)人類結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸

(ctgf)

<400>167

ccttccctgaaggttcctcc20