本發(fā)明涉及的是基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種玉米抗逆相關(guān)基因ZmDi19-5及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米不僅作為三大糧食物之一，也可作為重要的能源材料。從玉米中生產(chǎn)出的乳酸，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)可生成高分子材料(聚乳酸)，能替代化工塑料，是能夠被生物降解的環(huán)保材料，在社會和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有重要的戰(zhàn)略意義。目前，我國玉米生產(chǎn)總量已超過小麥產(chǎn)量，位于我國第二大糧食作物,其重要性已不言而喻。我國大部分玉米種植地區(qū)受到干旱和鹽漬的脅迫，每年因此而減產(chǎn)，直接影響了旱區(qū)和鹽漬地的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，增強(qiáng)玉米抗旱和耐鹽的能力已成為我國農(nóng)業(yè)研究重要問題之一。

目前選育抗旱和耐鹽的新品種方法有很多，相比于傳統(tǒng)育種，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)見效快的方法。該技術(shù)關(guān)鍵是挖掘出與干旱和鹽脅迫相關(guān)的基因，并分析生物學(xué)功能和抗逆機(jī)理。在模式植物擬南芥中，通過基因缺失突變體進(jìn)行分析其基因功能已成為主流，相比較玉米而言，獲得單基因缺失突變體的方法比較困難，使得對基因功能研究受到一定的限制，因此通過異源轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因材料方法，在抗逆基因的功能研究中發(fā)揮了重要的作用。

植物的抗逆應(yīng)答機(jī)制離不開轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。有報(bào)道顯示，植物的抗逆性能的體現(xiàn)并不是某一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子單獨(dú)調(diào)控的結(jié)果，是由多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同表達(dá)共同影響決定的復(fù)雜生物學(xué)性狀。轉(zhuǎn)錄因子的功能調(diào)控和植物抗逆機(jī)制的應(yīng)答，為作物分子抗逆育種的開展提供了有力支持，為作物綜合抗逆性能的提高和改良提供了理論依據(jù)。

研究表明C2H2鋅指蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子主要參與調(diào)控植物的生長發(fā)育以及植物的抗逆性相關(guān)活動。Di19蛋白不僅是C2H2鋅指蛋白家族的一員，同時(shí)也是干旱誘導(dǎo)蛋白的成員。目前已經(jīng)在擬南芥、棉花、大豆、小麥、水稻等植物中克隆出Di19基因，但在玉米中有關(guān)Di19基因的轉(zhuǎn)錄因子報(bào)道還沒有。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種玉米抗逆相關(guān)基因ZmDi19-5及其應(yīng)用，以提供一種新的可用于玉米抗逆遺傳改良的基因。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種玉米抗逆相關(guān)基因ZmDi19-5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全長720bp。

本發(fā)明還提供了上述玉米抗逆相關(guān)基因ZmDi19-5在降低或提高植物抗逆性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述玉米抗逆相關(guān)基因ZmDi19-5的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具有239個(gè)氨基酸。

本發(fā)明還提供了一種植物過量表達(dá)載體，所述植物過量表達(dá)載體為pCAMBIA1301載體，所述pCAMBIA1301載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域依次連接有35S啟動子、ZmDi19-5基因和終止子。

本發(fā)明還提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有所述植物過量表達(dá)載體，或其基因組中整合有外源的所述ZmDi19-5基因的正向或反向序列。

本發(fā)明還提供了一種提高植物抗逆性的方法，所述方法是將所述ZmDi19-5基因?qū)胫参锏募?xì)胞、組織或器官中，獲得抗逆性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株新品種。

進(jìn)一步地，所述植物包括玉米、水稻、小麥、擬南芥。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種玉米抗逆相關(guān)基因ZmDi19-5及其應(yīng)用，該基因?yàn)橐环N新的植物抗逆相關(guān)基因，豐富了抗逆相關(guān)基因的資源，對玉米抗逆新品種的選育具有重要意義。

附圖說明

圖1為ZmDi19-5基因凝膠電泳檢測結(jié)果圖；

圖2為ZmDi19-5蛋白與其他作物的Di19蛋白家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果圖；

圖3為ZmDi19-5基因過表達(dá)載體構(gòu)建圖譜；

圖4為鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥根生長情況柱狀分析圖；

圖5為鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥株高情況柱狀分析圖；

圖6為鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥丙二醛含量測定結(jié)果柱狀圖；

圖7為鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相對電導(dǎo)率的測定結(jié)果柱狀圖；

圖8為干旱處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥過氧化氫酶測定結(jié)果柱狀圖；

圖9為干旱處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥丙二醛含量測定結(jié)果柱狀圖；

圖10為干旱處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥葉片相對含水量測定結(jié)果柱狀圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、材料

本實(shí)施例所用方法如無特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。

2、方法

2.1ZmDi19-5基因的克隆

選擇玉米B73自交系為實(shí)驗(yàn)材料，提取玉米葉片組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

從玉米數(shù)據(jù)庫檢索獲取ZmDi19-5的生物學(xué)信息，以ZmDi19-5基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，同時(shí)結(jié)合克隆載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，選擇Kpn I和BamHI酶切位點(diǎn)引入ZmDi19-5序列兩端，特異性擴(kuò)增引物序列如下所示：

SEQ ID NO.3：ZmDi19-5-F：5’-GGGGTACCATGGATTCCGACCTCTGGAT-3’

SEQ ID NO.4：ZmDi19-5-R：5’-CGGGATCCCTAGTCTTCAAAAATGGTGGTG-3’

以cDNA為模板，ZmDi19-5-F和ZmDi19-5-R為引物，利用TAKARA公司生產(chǎn)的高保真酶PrimerSTAR Max Premix(2×)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性10min，98℃變性10s，62℃退火5s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)后，加入0.5μL的Taq酶，以給3’端加上PolyA尾巴，最后，72℃下繼續(xù)延伸10min完成反應(yīng)，獲得的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量比為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照。

結(jié)果如圖1所示，圖中可以看出，目標(biāo)基因條帶清晰，且大小與預(yù)測結(jié)果一致，說明PCR結(jié)果良好。

進(jìn)一步地，將目標(biāo)基因用Axygen公司的膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，與T1Simple載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，用Kpn I和BamHI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，篩選陽性克隆子，獲得T1+ZmDi19-5載體，并送去上海生工公司測序。

2.2ZmDi19-5基因的生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果經(jīng)Mega4.0軟件與數(shù)據(jù)庫中的序列比對后，與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致，說明成功克隆獲得ZmDi19-5基因。通過在線程序PFAM對ZmDi19-5基因的編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域特征分析，結(jié)果表明其蛋白結(jié)構(gòu)域含有zf-Di19(位于第49個(gè)到102個(gè)氨基酸位置)和Di19_C(位于第123個(gè)到236個(gè)氨基酸位置)，說明其為一種Di19蛋白。利用DNAMAN軟件，將其氨基酸序列與已知的水稻OsDi19-4的氨基酸序列比對，結(jié)果表明，ZmDi19-5基因不僅含有兩個(gè)Cys2/His2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，還與OsDi19-4的氨基酸序列的同源性達(dá)到74％左右，而OsDi19-4基因被報(bào)道是轉(zhuǎn)錄因子。由此預(yù)測ZmDi19-5屬于干旱誘導(dǎo)蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子一類。

利用Mega4.0軟件，將已報(bào)道功能的擬南芥和水稻的Di19蛋白，與玉米Di19蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖2所示，圖中，ZmDi19-5與OsDi19-4的親緣關(guān)系最近，而OsDi19-4基因已經(jīng)被證明參與調(diào)控植物的抗旱機(jī)制，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)的ZmDi19-5基因功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

2.3ZmDi19-5基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

以pCAMBIA1301為原始載體，在其多克隆位點(diǎn)的EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)之間連接一個(gè)35S啟動子，并在SphI和HindIII酶切位點(diǎn)之間加上一段終止子，獲得改造的載體pCAMBIA1301a。

用Kpn I、BamHI雙酶切T1+ZmDi19-5載體得到小的目的片段，同時(shí)用Kpn I、BamHI雙酶切p1301a得到大片段。

連接反應(yīng)體系為：

連接反應(yīng)在16℃下進(jìn)行3h后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑斑、搖菌、提質(zhì)粒，并通過雙酶切驗(yàn)證，獲得如圖3所示的ZmDi19-5基因過表達(dá)載體p1301a-ZmDi19-5。

2.4ZmDi19-5基因的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

2.4.1擬南芥種子的清洗：

先取12ml次氯酸鈉溶液于88ml水中，配置成配置12％的次氯酸鈉溶液。取待清洗種子于無菌離心管中，每管加入1ml的12％的次氯酸鈉溶液，浸泡清洗15min，期間間隔搖晃；再用無菌水漂洗5次，期間搖晃混勻，以洗凈種子表面次氯酸鈉溶液和雜質(zhì)；將清洗殺菌之后的哥倫比亞野生型擬南芥種子在4℃冰箱處理2天，備用。

2.4.2擬南芥的培養(yǎng)

取出清洗之后種子，借助移液槍均勻鋪散在MS固體培養(yǎng)基的方形培養(yǎng)皿上，擬南芥培養(yǎng)室培養(yǎng)；將培養(yǎng)基上生長10d左右的幼苗移入混合后的營養(yǎng)土中生長，營養(yǎng)黑土和蛭石體積比為1:3，繼續(xù)溫室培養(yǎng)；需要注意的是，剛剛移栽的幼苗需保持水分，采用透光塑料膜覆蓋法，2-3d后揭開。

2.4.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥

將構(gòu)建的過表達(dá)載體p1301a-ZmDi19-5導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，獲得侵染菌。待移栽的擬南芥大部分準(zhǔn)備第一次開花時(shí)，即為擬南芥侵染最佳時(shí)期。為了促進(jìn)擬南芥有花枝的增生，可修剪提前開花的花苞；同時(shí)將已經(jīng)有的角果剪去，提高轉(zhuǎn)基因種子的陽性率。轉(zhuǎn)化方法如下：將侵染菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.8。同時(shí)配置轉(zhuǎn)化Buffer溶液(處理液)：1L的Buffer溶液需要2.3g的MS，50g蔗糖，0.5g的MES，用NaOH調(diào)節(jié)pH值到5.8。處理液使用前還需加入表面活性劑。取攪拌后的混合Buffer溶液懸浮離心得到的菌塊，即得到侵染溶液。

浸染擬南芥花序：擬南芥抽薹約10厘米高時(shí)，用農(nóng)桿菌浸染液浸濕擬南芥花序，重復(fù)2-3次，用保鮮膜包裹住植株地上部分，在黑暗下培養(yǎng)2-3天。一個(gè)禮拜后，再次重復(fù)浸染。約兩個(gè)月，收獲成熟擬南芥的種子(T0代)，干燥后置于4℃下保存。

2.4.5轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選

將上述收獲的擬南芥種子(T0代)經(jīng)消毒(用12％的花王漂白水漂洗9分鐘，然后用滅菌的蒸餾水沖洗5次，每次清洗時(shí)間約1分鐘)，4℃春化兩天(注意避光)，種子均勻?yàn)⒃诤泵顾氐腗S培養(yǎng)基平板上，同時(shí)以野生型擬南芥種子作為對照。如果野生型擬南芥種子在不含抗性的MS平板上能夠正常萌發(fā)生長，在含抗性的平板上均不能正常萌發(fā)生長，而轉(zhuǎn)基因擬南芥中卻有種子在含抗性的平板上能夠正常萌發(fā)生長，則認(rèn)為篩選陽性擬南芥植株是有效的。

以ZmDi19-5基因?yàn)槟康幕?，對篩選的陽性植株進(jìn)行PCR分子檢測，初步鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥是否轉(zhuǎn)化成功。

2.4.6轉(zhuǎn)基因擬南芥后代的獲得

按照步驟2.4.5的方法，將初步鑒定為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的種子(T1代)用含潮霉素的MS培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，獲得T1代植株，待T1代植株果莢成熟時(shí)，收獲轉(zhuǎn)基因T2代種子，以此類推，最終獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子(至少T3代)。

2.5ZmDi19-5轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性分析

2.5.1ZmDi19-5轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗期的耐鹽性分析

將穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥L1、L2、L5株系種子和野生型WT株系種子消毒后，均勻鋪在含有MS培養(yǎng)基的平板上，4天左右(根生長約2-3厘米)將其移至含0、130mM NaCl的MS平板上，將這些平板豎直放于22℃人工溫室中，觀察根生長情況。

結(jié)果如圖4所示，圖中可以看出，鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的根系要比野生型的根系長，說明ZmDi19-5基因的過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物對高鹽的非生物脅迫。

2.5.2ZmDi19-5轉(zhuǎn)基因擬南芥成苗期的耐鹽性分析

將穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥L1、L2、L5株系種子和野生型WT株系種子消毒后，均勻鋪在含有MS培養(yǎng)基的平板上，放在4℃冰箱里春化2天(便于同步發(fā)芽)。然后，置于條件為22℃，16/8h光/暗培養(yǎng)的擬南芥專用培養(yǎng)溫室里培養(yǎng)。萌發(fā)10天左右，選取大小一致的轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗移入營養(yǎng)土和蛭石體積比為1:3混合的營養(yǎng)土中生長。使用220mM的NaCl溶液處理3周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥，連續(xù)處理4周，作為試驗(yàn)組，對照組用水代替220mM的NaCl溶液(正常生長)。

2.5.2.1表型分析

觀察處理前后擬南芥的表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaCl溶液處理之前，ZmDi19-5轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥的生長狀態(tài)一致，但是用220mM NaCl處理3周后，野生型擬南芥的大部分葉片則發(fā)白枯萎，表現(xiàn)出對高鹽脅迫的敏感性，而ZmDi19-5轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的大部分葉片仍然保持綠色，表明ZmDi19-5基因的表達(dá)能增強(qiáng)植物對高鹽的脅迫。

進(jìn)一步地，統(tǒng)計(jì)正常生長條件下和鹽脅迫條件下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的株高，結(jié)果如圖5所示，圖中可以看出，正常生長的野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的株高和大小差不多，但經(jīng)過鹽脅迫處理后，野生型顯著低于轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步表明過量表達(dá)的ZmDi19-5基因增強(qiáng)了擬南芥植株對高鹽的脅迫。

2.5.2.2丙二醛(MDA)含量的測定：

(1)稱取實(shí)驗(yàn)組和對照組同等重量的組織，加入磷酸鈉緩沖液并借助于石英砂，研磨成組織勻漿；

(2)取勻漿于離心管中，離心15min，觀察勻漿是否分層；

(3)取分層的勻漿上清液于新的試管中，先加入3ml的0.5％硫代巴比妥酸混勻，再加入5％三氯乙酸溶液，搖晃混勻，水浴鍋(100℃)10min，并用清水沖洗試管以快速降溫，然后離心，以去離子水為對照，測量離心上清在532nm、600nm波長下吸光值A(chǔ)₅₃₂、A₆₀₀。

(4)數(shù)據(jù)的處理按照下面運(yùn)算公式：

式中，A為吸光度，V₁為反應(yīng)液總量，V為提取液總量，V₂為反應(yīng)液中的提取液量，W為植物樣品的重量，1.55×10^-1為丙二醛的微摩爾吸光系數(shù)。

結(jié)果如圖6所示，圖中可以看出，處理后轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的丙二醛含量都有得到增加，但在上升幅度上，野生型植株明顯高于轉(zhuǎn)基因植株，說明轉(zhuǎn)基因植株中積累的丙二醛含量較少，細(xì)胞受傷程度較輕。

2.5.2.3相對電導(dǎo)率(REL)的測定

(1)取處理前后的實(shí)驗(yàn)組和野生型WT各株系同位置葉片，用ddH₂O沖洗兩次，打孔葉片10-15個(gè)圓片；

(2)各組葉片分別放入試管中，同時(shí)選用紗布和透氣封口膠帶將試管罩住并固定，抽取試管中空氣，30min；

(3)試管放于搖床內(nèi)1h，校準(zhǔn)完成的電導(dǎo)儀測量初電導(dǎo)值K1；

(4)再將包含樣品試管于水浴鍋(100℃)煮沸16min，。沸水浴后用自來冷沖洗試管至室溫，室溫下靜置10min后，搖勻后測其終電導(dǎo)值K2；

(5)以ddH₂O作為對照，電導(dǎo)儀測量值為空白電導(dǎo)值K0；

(6)相對電導(dǎo)率的計(jì)算可按照下面公式計(jì)算：

結(jié)果如圖7所示，圖中可以看出，處理前各組植株相對電導(dǎo)率的是無明顯差異的，處理后野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的相對電導(dǎo)率均顯著升高，但轉(zhuǎn)基因擬南芥的升高幅度顯著低于野生型，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥的葉細(xì)胞間的電解質(zhì)含量少，膜受損情況較輕。

2.6ZmDi19-5轉(zhuǎn)基因擬南芥的干旱性分析

將穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥L1、L2、L5株系種子和野生型WT株系種子消毒后，均勻鋪在含有MS培養(yǎng)基的平板上，放在4℃冰箱里春化2天(便于同步發(fā)芽)。然后，置于條件為22℃，16/8h光/暗培養(yǎng)的擬南芥專用培養(yǎng)溫室里培養(yǎng)。萌發(fā)10天左右，選取大小一致的轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗移入營養(yǎng)土和蛭石體積比為1:3混合的營養(yǎng)土中生長。待幼苗有活力時(shí)，進(jìn)行缺水干旱處理15天，再復(fù)水5天。

2.6.1表型分析

觀察表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱處理15天后，野生型擬南芥植株葉片發(fā)黃并且嚴(yán)重卷曲，而轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片大部分還是綠色，且轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片比野生型葉片展開程度大；復(fù)水5天后，野生型全部死亡，而轉(zhuǎn)基因植株全部恢復(fù)正常生長。表明過量表達(dá)的ZmDi19-5基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱脅迫的適應(yīng)性和耐受性。

2.6.2過氧化氫酶(CAT)測定

CAT測定采用南京建成生物研究所購買的過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)和總蛋白(TP)測定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)進(jìn)行測定，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行，具體為：

分別取干旱脅迫處理前后和野生型WT各實(shí)驗(yàn)組株系同一葉位的蓮座葉，用ddH₂O沖洗兩次，除去葉面上的土壤和雜質(zhì)。

(1)組織樣本的檢測

a.液氮預(yù)冷研缽和研磨棒，加入樣品研磨至粉末狀，稱取1g粉末，并加入9倍體積的生理鹽水，由此得到的組織勻漿，并于離心機(jī)2500rpm離心10分鐘，取上清。

b.取5ml離心管按下面體積加入相應(yīng)的試劑，其中，測定管添加組織原漿，對照管以水代替：

混勻，水浴鍋中37℃溫浴1min，再按下表加入相應(yīng)體積的試劑三、試劑四：

c.搖勻各試劑的混樣，波長405nm，測定各管吸光度值，雙蒸水調(diào)零。

(2)蛋白定量測試

a.取(1)中a.步上清，取上清液用生理鹽水按1：9比例稀釋成1％濃度組織勻漿，待測；

b.將待測組織勻漿加入5ml離心管中，并按下表體積加入相應(yīng)體積的試劑。其中，考馬斯亮藍(lán)顯色液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配置方法：將考馬斯亮藍(lán)貯備液和雙蒸水按1：4的比例混勻。注意：0.563/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(ml)需放-20℃保存，可保存6個(gè)月。

混勻各試劑成分，室溫放置10min，測量前雙蒸水調(diào)零，測量各試管樣品在調(diào)波長595nm的吸光值。

c.實(shí)驗(yàn)組樣本蛋白濃度計(jì)算公式如：

本實(shí)施例中，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.563g/L。

(3)組織中CAT活力的計(jì)算：

為了準(zhǔn)確分析各組數(shù)據(jù)，我們選用SPSS10.0軟件完成本部分?jǐn)?shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)分析。差異顯著性t檢驗(yàn)是基于P<0.01(**)和P<0.05(*)兩個(gè)水平上進(jìn)行。

在逆境條件下，植株會產(chǎn)生過多的活性氧如過氧化氫(H₂O₂)，影響植株的生長發(fā)育，但是植株體內(nèi)的過氧化氫酶能消除體內(nèi)過多的過氧化氫，保護(hù)細(xì)胞免受過氧化氫的毒害。本發(fā)明對轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株葉片中的氧化氫酶活力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖8所示，圖中可以看出，干旱處理后，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的過氧化氫酶活力均有所下降，但野生型中的過氧化氫酶活力極顯著低于轉(zhuǎn)基因植株中的活力，說明野生型植株的細(xì)胞活力明顯沒有轉(zhuǎn)基因植株的活力大。

2.6.3丙二醛含量檢測

檢測方法同步驟2.5.2.2，結(jié)果如圖9所示，圖中可以看出，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的丙二醛含量均有所上升，但轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量極顯著低于野生型植株，說明野生型植株的細(xì)胞受傷程度較大；

2.6.4葉片相對含水量(RWC)測定

(1)分別取干旱處理前、后的轉(zhuǎn)基因植株和對照植株相同部位葉片。

(2)用ddH₂O沖洗兩次，除去葉面上的土壤和雜質(zhì)，再用濾紙吸盡表面水分，稱鮮重W₀；

(3)取稱重后葉片浸泡在去離子水中5-6h，直至吸水飽和重量不變時(shí)，稱鮮重W1；

(4)將(3)中稱重的葉片用錫箔紙包好，放入180℃的烘箱，烘干水分，稱干重W2；

(5)相對含水量的計(jì)算公式：

結(jié)果圖如10所示，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的相對含水量均有所下降，但轉(zhuǎn)基因植株的相對含水量極顯著高于野生型植株，說明野生型植株的細(xì)胞已大部分死亡。

2.7結(jié)論

野生型植株受到鹽脅迫和干旱脅迫程度均大于轉(zhuǎn)基因植株，說明ZmDi19-5基因能明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。

以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種玉米抗逆相關(guān)基因ZmDi19-5及其應(yīng)用

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atggattccg acctctggat ctcgcgtctc acggccgcca agcggcagtt tgcgctgcag 60

cgcgcgcagc gccagcacgc cgccccggca tcccatcacg atcgatttgg gtatgatgat 120

atcgaacctg aggatgattt gcactcagac ttcccatgcc cttactgtta tgaagatcat 180

gatgttgctt ctctctgcgc ccatttggag gacgagcacc ctttcgagtc taaaattgtg 240

tcttgcccag tttgctcagc taggatttcg aaggacttgg tggatcatat aacccttcag 300

catggctacc tatttaaatt gcagaaacat caaagagtac gcagagttac tggtaatggc 360

aaccacaatc tctcctatgc agggagagat cttcaactgc aagagaccta cttaaaggtg 420

cttcttggaa atagcagtcg aagcagcagt accaatgcat caagtacagt caccgattca 480

ctgctaccct cactagtttt aaatttatca tcaccagaag tagaagacgc atcaaagttt 540

tcagctcctg ctgtggtgga aaataattgg tttaaacgat cactgccttc aaaaacttgg 600

aaattaagaa ctgttgattc cacccttagt catgaagaga gggagcgtag gaggaggaga 660

gctgctgtga gatcagcttt tgtccagcat ctccttgtca ccaccatttt tgaagactag 720

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

Met Asp Ser Asp Leu Trp Ile Ser Arg Leu Thr Ala Ala Lys Arg Gln

1 5 10 15

Phe Ala Leu Gln Arg Ala Gln Arg Gln His Ala Ala Pro Ala Ser His

20 25 30

His Asp Arg Phe Gly Tyr Asp Asp Ile Glu Pro Glu Asp Asp Leu His

35 40 45

Ser Asp Phe Pro Cys Pro Tyr Cys Tyr Glu Asp His Asp Val Ala Ser

50 55 60

Leu Cys Ala His Leu Glu Asp Glu His Pro Phe Glu Ser Lys Ile Val

65 70 75 80

Ser Cys Pro Val Cys Ser Ala Arg Ile Ser Lys Asp Leu Val Asp His

85 90 95

Ile Thr Leu Gln His Gly Tyr Leu Phe Lys Leu Gln Lys His Gln Arg

100 105 110

Val Arg Arg Val Thr Gly Asn Gly Asn His Asn Leu Ser Tyr Ala Gly

115 120 125

Arg Asp Leu Gln Leu Gln Glu Thr Tyr Leu Lys Val Leu Leu Gly Asn

130 135 140

Ser Ser Arg Ser Ser Ser Thr Asn Ala Ser Ser Thr Val Thr Asp Ser

145 150 155 160

Leu Leu Pro Ser Leu Val Leu Asn Leu Ser Ser Pro Glu Val Glu Asp

165 170 175

Ala Ser Lys Phe Ser Ala Pro Ala Val Val Glu Asn Asn Trp Phe Lys

180 185 190

Arg Ser Leu Pro Ser Lys Thr Trp Lys Leu Arg Thr Val Asp Ser Thr

195 200 205

Leu Ser His Glu Glu Arg Glu Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ala Val Arg

210 215 220

Ser Ala Phe Val Gln His Leu Leu Val Thr Thr Ile Phe Glu Asp

225 230 235

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggtaccat ggattccgac ctctggat 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgggatccct agtcttcaaa aatggtggtg 30