本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種烯鍵還原酶，及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在生物催化領(lǐng)域，高效催化的酶對催化反應(yīng)的進行是至關(guān)重要的。烯鍵還原酶(enoate reductases，ERs)作為一類受到廣泛關(guān)注的新型酶，能夠高選擇性地還原碳碳雙鍵，近年來對其高效催化酶源的研究成為熱點。帶有吸電子基團的飽和化合物是醫(yī)藥、激素、香料、以及農(nóng)藥生產(chǎn)等方面的重要物質(zhì)，常常需要由其α,β-不飽和化合物選擇性還原獲得，但吸電子基團易使烯烴鈍化，對其進行選擇性還原是一個富有挑戰(zhàn)性的課題?；瘜W(xué)合成中最常用過渡金屬及其絡(luò)合物對該類化合物還原，此法存在成本高，條件苛刻，產(chǎn)率低、會污染環(huán)境等缺點。研究表明，生物界中的烯鍵還原酶能夠還原碳碳雙鍵，且選擇性高，產(chǎn)率好，條件溫和，是一條環(huán)境友好的合成途徑。目前對于能夠進行高效催化的烯鍵還原酶種類研究還很少，幾乎沒有可以用于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的。

在工業(yè)上，紅球菌屬是一個非常具有商業(yè)價值的細(xì)菌類群，許多菌株參與了氨基酸如L2亮氨酸和L2苯丙氨酸的生產(chǎn)以及固醇類的轉(zhuǎn)化。目前紅球菌的研究主要集中在腈水解酶應(yīng)用上，應(yīng)用范圍窄。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種可用于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的烯鍵還原酶，包含所述烯鍵還原酶基因的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體或烯鍵還原酶重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體；本發(fā)明另一目的是提供一種制備重組烯鍵還原酶的方法；本發(fā)明還提供一種將烯鍵還原酶或重組烯鍵還原酶應(yīng)用于烯鍵的還原，例如α,β-不飽和化合物中C＝C雙鍵的還原，特別是α,β-不飽和化合物中C＝C雙鍵的不對稱還原。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，

一方面，本發(fā)明提供一種烯鍵還原酶基因，其堿基序列如SEQ ID No.1所示。

所述烯鍵還原酶基因制備步驟如下：通過引物，以紫紅色紅球菌Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895的基因組為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進行基因擴增得堿基序列如SEQ ID No.1所示的烯鍵還原酶基因。

一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明所述的烯鍵還原酶基因編碼的烯鍵還原酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

進一步地，本發(fā)明所述的烯鍵還原酶，所述的烯鍵還原酶的GenBank登錄號為：KT321320，下文也簡稱烯鍵還原酶為RhER 2718，其來源于紫紅色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 17895。

另一方面，本發(fā)明提供一種包含堿基序列如SEQ ID No.1所示的烯鍵還原酶基因的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體。

所述烯鍵還原酶重組表達(dá)載體的制備方法如下：將堿基序列如SEQ ID No.1所示的烯鍵還原酶基因通過酶切后連接于載體上，即可。所述的載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒pET28a(+)。

較佳的，可通過下述方法制得本發(fā)明的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體：將堿基序列如SEQ ID No.1所示的烯鍵還原酶基因和質(zhì)粒pET28a(+)用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接，即可得本發(fā)明的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體。

進一步地，本發(fā)明所述的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體，其骨架為pET28a(+)。

另一方面，本發(fā)明提供一種烯鍵還原酶重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其包含本發(fā)明所述烯鍵還原酶的基因、或本發(fā)明所述的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體。

進一步地，本發(fā)明所述的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體，制備步驟如下：首先，通過引物，以紫紅色紅球菌Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895的全基因組為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行基因擴增得堿基序列如SEQ ID No.1所示的烯鍵還原酶基因，之后連接于載體(所述的載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒pET28a(+))上得包含SEQ ID No.1所示的烯鍵還原酶基因的烯鍵還原酶重組表達(dá)載體；將本發(fā)明所述的烯鍵還原酶基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。

進一步地，本發(fā)明所述的烯鍵還原酶重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其中，所述的引物為：

上游引物為GGAATTCCATATGGTTGCAGTAAAGCCTT(如SEQ ID No.3所示)，

下游引物為CCCAAGCTTTTACGCCTTGGTATCAATAG(如SEQ ID No.4所示)。

另一方面，本發(fā)明提供一種烯鍵還原酶重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其通過將本發(fā)明所述的烯鍵還原酶基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。

進一步地，本發(fā)明所述的烯鍵還原酶重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其中，所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿足重組表達(dá)載體可穩(wěn)定的自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明的烯鍵還原酶基因可被有效表達(dá)即可；優(yōu)選地，所述的宿主微生物為大腸桿菌。

進一步地，本發(fā)明所述的烯鍵還原酶重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其中，進一步優(yōu)選地，所述的宿主微生物為大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。

一方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明所述烯鍵還原酶基因的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

進一步地，所述烯鍵還原酶基因通過導(dǎo)入宿主菌或細(xì)胞制得重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

一方面，本發(fā)明提供一種重組烯鍵還原酶的制備方法，其通過培養(yǎng)本發(fā)明所述的烯鍵還原酶重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組烯鍵還原酶。

所述重組烯鍵還原酶的制備方法中，所述培養(yǎng)的步驟的方法和條件沒有特殊限制，可以根據(jù)宿主類型和所選培養(yǎng)方法等因素的不同按本領(lǐng)域普通知識進行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要使重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體能夠生長并產(chǎn)生本發(fā)明的重組烯鍵還原酶即可。

進一步地，本發(fā)明所述的制備方法，將包含堿基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的烯鍵還原酶的重組大腸桿菌(重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體)接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

當(dāng)培養(yǎng)液的光密度OD₆₀₀達(dá)到0.5-0.6，在終濃度為0.1-1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的誘導(dǎo)下，即可高效表達(dá)重組烯鍵還原酶。

進一步地，本發(fā)明所述的制備方法，優(yōu)選培養(yǎng)液的光密度OD₆₀₀達(dá)到0.55時，在終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的誘導(dǎo)下，即可高效表達(dá)重組烯鍵還原酶。

進一步地，本發(fā)明所述的制備方法，所述誘導(dǎo)的時間優(yōu)選20-30℃，更優(yōu)選為22℃。所述誘導(dǎo)的時間優(yōu)選15-25h，更優(yōu)選20h。

進一步地，本發(fā)明所述的制備方法，所述的LB培養(yǎng)基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

進一步地，按照本發(fā)明所述的制備方法，高效表達(dá)重組烯鍵還原酶后，可按本領(lǐng)域常規(guī)方法收集待用，一般可為下述方法中任一種：(1)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞、洗滌、冷凍干燥、得凍干細(xì)胞，具體的操作步驟優(yōu)選：將培養(yǎng)液離心(轉(zhuǎn)速一般為8000-10000rpm)去除上清液，收集細(xì)胞，生理鹽水洗滌(優(yōu)選2次)，冷凍干燥，得凍干細(xì)胞。(2)將收集的培養(yǎng)液中的細(xì)胞進行細(xì)胞破壁處理、離心、取上清液、即得粗酶液，具體的操作步驟優(yōu)選：將收集的培養(yǎng)液中的細(xì)胞重新懸浮于本領(lǐng)域常用的pH 6.5-7.5的緩沖液(如磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選pH7.0，50mmol/L的磷酸-磷酸鉀緩沖液)中，進行細(xì)胞破壁。所述的細(xì)胞破壁的方法可采用常規(guī)方法，如超聲處理，優(yōu)選條件為功率400W，超聲4s，間歇6s，重復(fù)99輪。細(xì)胞破壁后的離心的速度較佳的為8000-10000rpm。(3)按方式(2)制備粗酶液，將粗酶液進一步冷凍干燥的粗酶液。

一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明所述的烯鍵還原酶或重組烯鍵還原酶在不對稱還原α,β-不飽和化合物中C＝C雙鍵中的應(yīng)用。

進一步地，本發(fā)明提供的應(yīng)用，其中，在輔酶NADH的存在下，在所述的烯鍵還原酶或在重組烯鍵還原酶的作用下，將作為底物的α,β-不飽和化合物進行不對稱還原反應(yīng)，制得帶吸電子基團的化合物(包括光學(xué)活性的帶吸電子基團的化合物)。所述的烯鍵還原酶或重組烯鍵還原酶作為催化劑還原α,β-不飽和化合物中C＝C雙鍵以制備帶吸電子基團的化合物。

進一步地，所述的α,β-不飽和化合物為α,β-不飽和酮類化合物或酮酯類化合物，進一步地優(yōu)選為在α位有取代基的α,β-不飽和化合物。所述的α,β-不飽和化合物在反應(yīng)液中的濃度較佳的為1-15mmol/L，優(yōu)選為10mmol/L。

進一步地，所述帶吸電子基團的化合物具有光學(xué)活性。

進一步地，本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述α,β-不飽和化合物的結(jié)構(gòu)式如式(I)或式(II)所示

其中，M為CR¹R²、NR³；

Q為C＝O、CR⁴R⁵；

R為氫、烷基或硝基；當(dāng)R為硝基時，Q為CH₂；

n為0、1、2；

R¹、R²各自獨立地為氫或烷基；

R³為芳基基團；

R⁴和R⁵各自獨立地為氫或烷基；

R⁶為取代或非取代烷基、烯基；

R⁷為氫或烷基。

進一步地，本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中R為氫、C_1-4烷基或硝基；當(dāng)R為硝基時，Q為CH₂；

n為0、1、2；

R¹、R²各自獨立地為氫或C_1-4烷基；

R³為取代或非取代C_6-12芳基；

R⁴和R⁵各自獨立地為氫或C_1-4烷基；

R⁶為取代或非取代C_1-4烷基、C_2-4烯基；

R⁷為氫或C_1-4烷基。

進一步地，本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中制備步驟如下：在pH 5-9、NADH輔酶、本發(fā)明所述的還原酶的條件下，將α,β-不飽和化合物中C＝C雙鍵進行不對稱還原，制得帶吸電子基團的化合物。

進一步地，本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，在制備步驟中，

α,β-不飽和化合物的濃度為1-15mmol/L；所述的還原酶或重組酶的用量為80-400μg/L；輔酶NADH的用量為10-15mmol/L；所述的磷酸鹽緩沖液濃度為50mmol/L，pH為5-9；所述的不對稱還原反應(yīng)的溫度為20-40℃。

進一步地，本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，在制備步驟中，

所述的α,β-不飽和化合物的濃度為10mmol/L；所述的還原酶或重組酶的用量為400μg/L；輔酶NADH的用量為12.5mmol/L；所述的磷酸鹽緩沖液濃度為50mmol/L，pH為7.0；所述的不對稱還原反應(yīng)的溫度為30℃。

進一步地，本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述的不對稱還原反應(yīng)的時間為反應(yīng)完全為準(zhǔn)。

按常規(guī)方法，所述的烯鍵還原酶或其重組酶可采用下述形式加入反應(yīng)體系：將粗酶液直接加入反應(yīng)體系，或者將懸浮或溶解有凍干細(xì)胞或粗酶粉的pH 5-9、優(yōu)選6-7的緩沖液加入反應(yīng)體系。所述的緩沖液種類可謂本領(lǐng)域常用的各種緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。所述的緩沖液的濃度可為50-100mmol/L。本發(fā)明優(yōu)選pH 7.0、50mmol/L的磷酸-磷酸鉀緩沖液。所述的烯鍵還原酶或其重組酶的量為催化有效量以上，一般為80-400μg/L，優(yōu)選200-400μg/L。

所述的不對稱還原反應(yīng)的溫度一般為20-40℃，優(yōu)選25-35℃。所述的不對稱還原反應(yīng)的時間以反應(yīng)完全為準(zhǔn)，一般為1-24小時。

本發(fā)明的重組還原酶的輔酶依賴類型為NADH，所述的輔酶NADH的量可為10-15mmol/L。

所述的不對稱還原反應(yīng)的溶劑體系可為通常的緩液體系。所述的緩沖液同前述。

不對稱還原反應(yīng)結(jié)束后，可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法從反應(yīng)液中提取(S)或(R)-型帶吸電子基團的飽和化合物。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明所用試劑盒原料均市售可得。

本發(fā)明使用的術(shù)語“烷基”或“烷基基團”，表示含有1至20個碳原子，飽和的直鏈或支鏈一價烴基基團，其中，所述烷基基團可以任選地被一個或多個本發(fā)明描述的取代基所取代。除非另外詳細(xì)說明，烷基基團含有1-20個碳原子。在一實施方案中，烷基基團含有1-12個碳原子；在另一實施方案中，烷基基團含有1-6個碳原子；在又一實施方案中，烷基基團含有1-4個碳原子；還在一實施方案中，烷基基團含有1-3個碳原子。

烷基基團的實例包含，但并不限于，甲基(Me、-CH₃)，乙基(Et、-CH₂CH₃)，正丙基(n-Pr、-CH₂CH₂CH₃)，異丙基(i-Pr、-CH(CH₃)₂)，正丁基(n-Bu、-CH₂CH₂CH₂CH₃)，異丁基(i-Bu、-CH₂CH(CH₃)₂)，仲丁基(s-Bu、-CH(CH₃)CH₂CH₃)，叔丁基(t-Bu、-C(CH₃)₃)，正戊基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)，2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₃)，3-戊基(-CH(CH₂CH₃)₂)；

術(shù)語“烯基”表示含有2-12個碳原子的直鏈或支鏈一價烴基，其中至少有一個不飽和位點，即有一個碳-碳sp²雙鍵，其中，所述烯基基團可以任選地被一個或多個本發(fā)明所描述的取代基所取代，其包括“cis”和“tans”的定位，或者"E"和"Z"的定位。在一實施方案中，烯基基團包含2-8個碳原子；在另一實施方案中，烯基基團包含2-6個碳原子；在又一實施方案中，烯基基團包含2-4個碳原子。烯基基團的實例包括，但并不限于，乙烯基(-CH＝CH₂)、烯丙基(-CH₂CH＝CH₂)等等；

術(shù)語“芳基”表示含有6-14個環(huán)原子，或6-12個環(huán)原子，或6-10個環(huán)原子的單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)的碳環(huán)體系，其中，至少一個環(huán)體系是芳香族的，其中每一個環(huán)體系包含3-7個原子組成的環(huán)，且有一個或多個附著點與分子的其余部分相連。術(shù)語“芳基”可以和術(shù)語“芳香環(huán)”交換使用。芳基基團的實例可以包括苯基、萘基和蒽。所述芳基基團可以獨立任選地被一個或多個本發(fā)明所描述的取代基所取代。

所述烷基基團為甲基(Me、-CH₃)，乙基(Et、-CH₂CH₃)，正丙基(n-Pr、-CH₂CH₂CH₃)，異丙基(i-Pr、-CH(CH₃)₂)，正丁基(n-Bu、-CH₂CH₂CH₂CH₃)；

所述烯基基團包含2-8個碳原子的直鏈或支鏈一價烴基，；

所述芳基基團包括苯基、萘基和蒽，所述芳基基團可以獨立任選地被一個或多個取代基所取代。

像本發(fā)明所描述的，本發(fā)明的化合物可以任選地被一個或多個取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像實施例里面特殊的例子，子類，和本發(fā)明所包含的一類化合物。應(yīng)了解“任選取代的”這個術(shù)語與“取代或非取代的”這個術(shù)語可以交換使用。一般而言，術(shù)語“取代的”表示所給結(jié)構(gòu)中的一個或多個氫原子被具體取代基所取代。除非其他方面表明，一個任選的取代基團可以在基團各個可取代的位置進行取代。當(dāng)所給出的結(jié)構(gòu)式中不只一個位置能被選自具體基團的一個或多個取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各個位置取代。取代基包括氫、烷基、烯基、鹵素、硝基、氰基、醛基、酮基等。

另外，需要說明的是，除非以其他方式明確指出，在本發(fā)明中所采用的描述方式“各…獨立地為”與“…各自獨立地為”和“…獨立地為”可以互換，均應(yīng)做廣義理解，其既可以是指在不同基團中，相同符號之間所表達(dá)的具體選項之間互相不影響，也可以表示在相同的基團中，相同符號之間所表達(dá)的具體選項之間互相不影響。

附圖說明

圖1為實施例2中重組烯鍵還原酶RhER 2718的粗酶液的聚丙烯凝膠電泳圖。

圖2為實施例2中純化后的重組烯鍵還原酶RhER 2718的聚丙烯凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

本發(fā)明所用試劑盒原料均市售可得，如質(zhì)粒pET28a(+)購買自德國默克，NADH購買自Sigma-Aldrich，所有化學(xué)品都購自Sigma-Aldrich(Schnelldorf、德國)且沒有進一步純化。

實施1大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a(+)-RhER 2718的構(gòu)建RhER 2718基因的擴增

根據(jù)如SEQ ID No.1所示的堿基序列，設(shè)計引物序列如下：

上游引物:GGAATTCCATATGGTTGCAGTAAAGCCTT

下游引物：CCCAAGCTTTTACGCCTTGGTATCAATAG

其中，上游引物下劃線部分為NdeI酶切位點，下游引物下劃線部分為HindIII酶切

位點。

以紫紅色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC 17895的全基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得RhER 2718基因。PCR體系為：2×Tag PCR MasterMix 15μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板2μL(0.1μg)和ddH₂O 11μL。PCR擴增步驟為：(1)95℃，預(yù)變性3min；(2)94℃，變性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸90s；其中步驟(2)～(4)循環(huán)30次；(5)72℃繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收700～900bp區(qū)間的目標(biāo)條帶。

1.重組表達(dá)載體，即重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-RhER 2718的制備

在37℃下，將所得PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII雙酶切12h；pET28a(+)載體用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII雙酶切12h得到線性pET28a(+)載體；將雙酶切后的PCR產(chǎn)物的基因片段與線性pET28a(+)載體用TADNA連接酶在4℃下連接過夜，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-RhER 2718。

2.重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，即大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a(+)-RhER 2718的構(gòu)建

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-RhER 2718轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上對陽性重組體進行篩選，挑取單克隆，培養(yǎng)重組菌，待質(zhì)粒擴增后提取質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，即獲得重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)pET28a(+)-RhER 2718，菌落PCR驗證陽性克隆。

實施例2重組烯鍵還原酶的制備

將實施例1中所得的大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)pET28a(+)-RhER 2718接種于含卡那霉素(終濃度50mg/L)的LB培養(yǎng)基(包含酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。再按1％(v/v)的接種量將種子液接種到裝有500mL相同的LB培養(yǎng)基的的2L三角瓶中，置37℃、180rpm搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD₆₀₀達(dá)到0.5-0.6時，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，22℃誘導(dǎo)20h。

將所得培養(yǎng)液在9000rpm下離心去除上清液，收集濕細(xì)胞。取部分濕細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，冷凍干燥，即得凍干細(xì)胞，備用。另取部分濕細(xì)胞懸浮于pH 7.0、50mmol/L的磷酸-磷酸鉀緩沖液中得懸浮液，在冰浴中超聲破碎，離心收集上清液，即為重組烯鍵還原酶的粗酶液。所得重組烯鍵還原酶的粗酶液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖分析具體結(jié)果如圖1所示。

質(zhì)粒pET28a(+)是一種帶有組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒，用該質(zhì)粒表達(dá)的烯鍵還原酶RhER2718帶有一個組氨酸標(biāo)簽，通過His trap Ni-NTA親和色譜柱、AKTAprime蛋白純化儀對目標(biāo)蛋白進行一步純化。所用洗脫液為磷酸-磷酸鉀緩沖液和咪唑的水溶液液。先把粗酶液進到高液體系，利用磷酸-磷酸鉀緩沖液洗脫，把其他酶洗脫下來，目標(biāo)酶因為有組氨酸標(biāo)簽會被吸附在鎳柱上，然后利用咪唑水溶液把目標(biāo)酶從鎳柱上洗脫下來，收集。收集的重組烯鍵還原酶的酶液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖分析，具體結(jié)果如圖2所示。

重組蛋白絕大部分以可溶性形式存在。聚丙烯酰胺凝膠電泳圖經(jīng)BandScan軟件分析得，表達(dá)的目的蛋白重組烯鍵還原酶RhER 2718約占粗酶液總蛋白的60％。

實施例3重組烯鍵還原酶的活力測定

重組烯鍵還原酶的還原反應(yīng)活力測定：反應(yīng)體系為1mL，包含pH 7.0、50mmol/L磷酸-磷酸鉀緩沖液，加入0.1mmol/LNADH，2mmol/L 2-甲基環(huán)戊烯酮，在30℃保溫2分鐘后加入適量由實施例2制備的重組烯鍵還原酶的粗酶液，迅速搖勻，檢測340nm處吸光值的變化。

酶活力的計算公式為：酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×1)；式中，EW為1min內(nèi)340nm處吸光度的變化；V為反應(yīng)液的體積，單位為mL；6220為摩爾消光系數(shù)，單位為L/(mol/cm)；1為光程距離，單位為cm。

烯鍵還原酶每單位酶活力定義為在上述條件下，每分鐘催化氧化1μmol NADH所需的酶量，蛋白含量采用Brandford法測定。結(jié)果為：重組烯鍵還原酶的還原反應(yīng)活性為0.92U/mg。

實施例4-14重組烯鍵還原酶催化還原α,β-不飽和化合物的C＝C雙鍵

在1.5mL磷酸-磷酸鉀緩沖液(50mmol/L、pH 7.0)中加入12.5mmol/LNADH和400μg/mL的重組烯鍵還原酶液，分別加入終濃度為10mmol/L的各種底物(結(jié)構(gòu)式如表1所示)，30℃下，1000rpm震蕩反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后加入等體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥過夜，通過氣相色譜(毛細(xì)管柱CP Sil 5CB或手性毛細(xì)管柱Mega-Dex Det Beta和CP-Chirasil-Dex CB)分析測定底物轉(zhuǎn)化率和還原產(chǎn)物的ee值，結(jié)果如表1所示。

轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物ee值的檢測方法如下：

實施例4-14使用氣相色譜(毛細(xì)管柱CP Sil 5CB)分析底物的轉(zhuǎn)化率，載氣氮氣，進樣口溫度280℃，檢測器FID溫度280℃。其他條件如下：

實施例4-9：柱溫50℃保留3min；以3℃/min升溫至65℃，保留1min；以30℃/min升溫至150℃，保留2min；以50℃/min升溫至250℃，保留1min；以50℃/min升溫至270℃，保留1min；以50℃/min升溫至330℃，保留1min。

實施例10：柱溫50℃保留3min；以3℃/min升溫至60℃，保留3min；以3℃/min升溫至70℃，保留1min；以30℃/min升溫至150℃，保留2min；以50℃/min升溫至270℃，保留1min；以50℃/min升溫至330℃，保留1min。

實施例11：柱溫60℃保留1min；以10℃/min升溫至65℃，保留10min；以30℃/min升溫至135℃，保留2min；以35℃/min升溫至330℃，保留2min。

實施例12：柱溫50℃保留1min；以30℃/min升溫至90℃，保留20min；以50℃/min升溫至250℃，保留1min；以50℃/min升溫至330℃，保留1min。

實施例13：柱溫50℃保留1min；以30℃/min升溫至150℃，保留2min；以30℃/min升溫至180℃，保留5min；以30℃/min升溫至250℃，保留1min；以30℃/min升溫至270℃，保留1min；以30℃/min升溫至330℃，保留1min。

實施例14：使用氣相色譜(手性毛細(xì)管柱CP-Chirasil-Dex CB)分析轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值，載氣氮氣，進樣口溫度280℃，檢測器FID溫度280℃：柱溫120℃保留3min；以10℃/min升溫至150℃，保留4min；以15℃/min升溫至225℃，保留1min。

實施例7和實施例10使用氣相色譜(手性毛細(xì)管柱Mega-Dex Det Beta)分析產(chǎn)物ee值，載氣氮氣，進樣口溫度280℃，檢測器FID溫度280℃：柱溫75℃保留2min；以10℃/min升溫至110℃，保留7min；以30℃/min升溫至230℃，保留2min。

表1：重組烯鍵還原酶催化還原α,β-不飽和化合物的C＝C雙鍵的結(jié)果

從上表可知，本發(fā)明提供和制備的烯鍵還原酶或重組烯鍵還原酶可作為催化劑應(yīng)用于共軛C＝C雙鍵的不對稱還原，適用的化合物范圍廣，具有優(yōu)異的催化活性，可獲得高轉(zhuǎn)化率、高光學(xué)純度的帶吸電子基團飽和化合物，且反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好，具有很好的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)99％，還原產(chǎn)物的ee可達(dá)到100％。

以上僅為本實用新型的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本實用新型，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本實用新型可以有各種更改和變化。凡在本實用新型的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大學(xué)

<120> 一種烯鍵還原酶及其制備方法和應(yīng)用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<213> Rhodococcus rhodochrous

<400> 1

gtgagtgtgt tgttcgagcc tttgaccctg cgtggcgtca ccatcccgaa ccgcgtctgg 60

atggcaccga tgtgccagta ctcggccgac gtcatcggcg accaggtcgg agtgcccaac 120

gagtggcatc gcacgcatct ggtgagccgt gcaatcggcg gcaccggcct gattctcacc 180

gaggcgacgg ccgtcagtcc cgaaggccgg atatcggcag ctgatctggg gatttggaac 240

gacacgcagg cgcaagcctt cgccgagatc aacgcgcaac tcgcgtactt cggcgcagtg 300

cccggaatcc agttggcgca cgccggacga aaagcgtcga cgcaggttcc gtggcgcggc 360

ggcaagagcc tgcccgccga cgaccgactc tcgtggcaga cggttgcccc gagcgcggtt 420

ccgttcggtc accttgccga tccggtcgag ctcaccacgg agggcatcga gaaggtcgtc 480

gcggacttcg cagcggcggc tacccgcgca ttgaaggccg aattcaaggt cgtggaaatt 540

cacgcggccc acggatacct gatccatcag ttcctctccc ccgagagcaa caagcgaacg 600

gaccgctacg gaggcagctt cgagaaccgc attcgattgc tcctcgaaat cctgacagca 660

gtccgcgagg tgtggccggc cgagctaccg ctcttcgtcc gggtctcggc gaccgattgg 720

ctgacggaag agcgtgggct cgaggtcgac agctggaccg cggatcagac cgttgccctg 780

gccaacatcc tctccgatta cggggtcgat ctcgtcgacg tctccaccgg cggcaattca 840

ccggcggcac agattccggt ggaaccggga taccaggttc cgttcgcccg tcgcctgcag 900

aacgagagcc tgctaccggc cgccgccgtc ggcctcatca ccgaacccga acaggccgag 960

aagatcgtcg aagacggaag cgcagtggcg gtgctcctcg gccgcgaact gttgcgtgat 1020

ccgtactggg cgcgccgggc ggcacgggaa ctgaacgccg aggtcggacc acatatcccg 1080

tcgcagtacg cccgcgcctt ctag 1104

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> Rhodococcus rhodochrous

<400> 2

Met Ser Val Leu Phe Glu Pro Leu Thr Leu Arg Gly Val Thr Ile Pro

1 5 10 15

Asn Arg Val Trp Met Ala Pro Met Cys Gln Tyr Ser Ala Asp Val Ile

20 25 30

Gly Asp Gln Val Gly Val Pro Asn Glu Trp His Arg Thr His Leu Val

35 40 45

Ser Arg Ala Ile Gly Gly Thr Gly Leu Ile Leu Thr Glu Ala Thr Ala

50 55 60

Val Ser Pro Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ala Asp Leu Gly Ile Trp Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gln Ala Gln Ala Phe Ala Glu Ile Asn Ala Gln Leu Ala Tyr

85 90 95

Phe Gly Ala Val Pro Gly Ile Gln Leu Ala His Ala Gly Arg Lys Ala

100 105 110

Ser Thr Gln Val Pro Trp Arg Gly Gly Lys Ser Leu Pro Ala Asp Asp

115 120 125

Arg Leu Ser Trp Gln Thr Val Ala Pro Ser Ala Val Pro Phe Gly His

130 135 140

Leu Ala Asp Pro Val Glu Leu Thr Thr Glu Gly Ile Glu Lys Val Val

145 150 155 160

Ala Asp Phe Ala Ala Ala Ala Thr Arg Ala Leu Lys Ala Glu Phe Lys

165 170 175

Val Val Glu Ile His Ala Ala His Gly Tyr Leu Ile His Gln Phe Leu

180 185 190

Ser Pro Glu Ser Asn Lys Arg Thr Asp Arg Tyr Gly Gly Ser Phe Glu

195 200 205

Asn Arg Ile Arg Leu Leu Leu Glu Ile Leu Thr Ala Val Arg Glu Val

210 215 220

Trp Pro Ala Glu Leu Pro Leu Phe Val Arg Val Ser Ala Thr Asp Trp

225 230 235 240

Leu Thr Glu Glu Arg Gly Leu Glu Val Asp Ser Trp Thr Ala Asp Gln

245 250 255

Thr Val Ala Leu Ala Asn Ile Leu Ser Asp Tyr Gly Val Asp Leu Val

260 265 270

Asp Val Ser Thr Gly Gly Asn Ser Pro Ala Ala Gln Ile Pro Val Glu

275 280 285

Pro Gly Tyr Gln Val Pro Phe Ala Arg Arg Leu Gln Asn Glu Ser Leu

290 295 300

Leu Pro Ala Ala Ala Val Gly Leu Ile Thr Glu Pro Glu Gln Ala Glu

305 310 315 320

Lys Ile Val Glu Asp Gly Ser Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Arg Glu

325 330 335

Leu Leu Arg Asp Pro Tyr Trp Ala Arg Arg Ala Ala Arg Glu Leu Asn

340 345 350

Ala Glu Val Gly Pro His Ile Pro Ser Gln Tyr Ala Arg Ala Phe

355 360 365

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

ggaattccat atggttgcag taaagcctt 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

cccaagcttt tacgccttgg tatcaatag 29