專利名稱：：酶促還原烯衍生物的方法酶促還原烯衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于酶促還原通式(1)的烯衍生物的方法。發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供用于從通式(1)的不飽和烯衍生物，尤其以高化學(xué)產(chǎn)率和極好的立體選擇性酶促制備通式(2)的化合物的方法。通過使用還原酶YqjM、OPRl、OPR3及其功能等同物還原通式(1)的烯衍生物來解決上述目的。本發(fā)明涉及通過在還原酶的存在下還原通式(1)的化合物，從通式(1)的不飽和烯衍生物酶促制備通式(2)的化合物的方法，A是硝基(-n02)、酮基(-CRO)、醛基(-CHO)、羧基(-COOR)，R=H或任選取代的C廣CV烷基，R1、R2和R3相互獨(dú)立地是H、d-C6-烷基、CVC6-烯基、羧基，或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)的芳族或非芳族基團(tuán)，或者r1連接到W上，以成為4-8元環(huán)的一部分，或者r1連接到r上，以成為4-8元環(huán)的一部分，條件是r1、J^和rS不相同，所述還原酶(i)包發(fā)明概述發(fā)明詳述其中含多肽序列SEQIDNO:1、2或3中的至少一種或(ii)具有與SEQIDNO:1、2或3有至少80%同一性的功能上等同的多肽序列。原則上，本發(fā)明的方法可使用純化或濃縮的酶本身和天然或重組表達(dá)該酶的微生物，或使用來自其的細(xì)胞勻漿來進(jìn)行。除非另有說明，-CrCV烷基具體指甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基，及對應(yīng)的單分支或多分支類似物，如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基或新戊基；尤其優(yōu)選CpCV烷基；-CVC6-烯基具體指具有2至6個碳原子的上述烷基的單不飽和類似物，尤其優(yōu)選對應(yīng)的CrC4-烯基，-羧基具體指COOH基，-碳環(huán)和雜環(huán)的芳基或非芳基環(huán)具體指具有3至12個碳原子，并且適當(dāng)時具有1至4個雜原子，如N、S和O，尤其是N或O的任選稠環(huán)?？商峒暗膶?shí)例是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基，其單不飽和類似物或多不飽和類似物，如環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)己二烯基，環(huán)庚二烯基；苯基和萘基；和具有選自O(shè)、N和S的1至4個雜原子的5元至7元飽和或不飽和雜環(huán)基，其中所述雜環(huán)可任選地稠合到其它雜環(huán)或碳環(huán)上。應(yīng)特別提及衍生自吡咯烷、四氫呋喃、哌啶、嗎啉、吡p各、吹喃、漆汾、吡唑、咪唑、^惡唑、漆唑、吡，定、吡喃、嘧"定、歧-秦、吡溱、苯并呋喃、吲味及喹啉的雜環(huán)基。所述環(huán)狀基及上述烷基和烯基可任選地被取代一次或更多次，例如1、2或3次。應(yīng)提及的合適取代基的實(shí)例卣素，特別是F、Cl、Br;-OH、-SH、-N02、-NH3、-S03H、C,-Cr烷基和C2-Cr烯基、d-Cr烷氧基；和羥基-d-CV烷基；其中所述烷基和烯基如上文定義，并且所述烷氧基來自上文定義的對應(yīng)烷基。R1和R3基彼此之間也可直接連接，以與待還原雙鍵一起形成4-8元環(huán)，優(yōu)選5-或6-元環(huán)，例如環(huán)戊烯或環(huán)己烯結(jié)構(gòu)，其也可任選地被例如烷基，優(yōu)選甲基取代。R1和R基彼此之間也可直接連接，以與待還原雙鍵一起形成4-8元環(huán)，優(yōu)選5-或6-元環(huán)，例如環(huán)戊烯或環(huán)己烯結(jié)構(gòu)，其也可任選地被例如烷基，優(yōu)選曱基取代。上述4-8元環(huán)可以是碳環(huán)(即僅是碳原子形成環(huán))和雜環(huán)(即雜原子，如()；S;N存在于該環(huán)中)。如需要，這些碳環(huán)或雜環(huán)也仍可被取代，即氫原子被雜原子置換。例如，認(rèn)為N-苯基琥珀酰亞胺(參閱下文的底物3)是這種取代的雜環(huán)，其為W和R形成環(huán)的結(jié)果。本發(fā)明特別有益的實(shí)施方案包含將以下底物(通式1的化合物)酶促還原成通式(2)的對應(yīng)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明方法可特別用通式(1)的化合物進(jìn)行，其中A是醛基或酮基，并且R'或R2是曱基。適合于本發(fā)明方法的還原酶(其有時也稱作烯酸(enoate)還原酶)具有如SEQIDNO:1、2或3中給出的多肽序列或具有與SEQIDNO:1、2或3至少80%,例如至少90%,或至少95%并尤其至少97%、98%或99%同一性的多肽序列。已知具有SEQIDNO:1的多肽名為來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的YqjM(UniprotKB/Swissprot登錄號P54550)。具有SEQIDNO:2的多肽由番^OPR1基因(UniprotKB/Swissprot登錄號Q9XG54)編碼。具有SEQIDNO:3的多肽由番茄OYPR3基因(UniprotKB/Swissprot登錄號Q9FEW9)編碼。為了此處描述的目的，通過Wisconsin大學(xué)GeneticsComputerGroup(GCG)的"GAP"計(jì)算機(jī)程序并且使用版本10.3(其使用GCG推薦的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù))來確定序列同一性。可通過技術(shù)人員已知的定向誘變或隨機(jī)誘變方法從SEQIDNO:1、2或3開始獲得此類還原酶。然而，備選可能性是也可以在微生物中，優(yōu)選在那些Alishewanella、交替球菌屬(Alterococeus)、Aquamonas、Aranieola、殺雄菌屬(Arsenophonus)、Azotivirga、Brenneria、對蟲體內(nèi)共生體(Buchnera)(蟲牙蟲P-內(nèi)共生體(aphidP-endosymbionts))、布戴約維采菌屬(Budvicia)、布丘氏菌屬(Buttiauxella)、CandidatusPhlomobacter、西地西菌屬(Cedecea)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、I)ickeya、愛德華菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、愛文菌屬(Ewingella)、Grimontella、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)、勒克菌屬(Leclercia)、勒米諾菌屬(Leminorella)、米勒菌屬(Moellerella)、摩根菌屬(Morganella)、肥桿菌屬(Obesumbacterium)、泛菌屬(Pantoea)、果股桿菌屬(Pectobacterium)、發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、布拉格菌屬(Pragia)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、拉恩菌屬(Rahnella)、Raoultella、沙門氏菌屬(Salmonella)、Samsonia、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、Sodalis、塔特姆菌屬(Tatumella)、特拉布斯氏菌屬(Trabulsiella)、魏格沃菌屬(Wigglesworthia)、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)或約克氏菌屬(Yokenella)中搜索催化上述模式反應(yīng)并且其氨基酸序列已與SEQIDNO:1、2或3具有所需序列同一性的還原酶或通過誘變方法獲得的還原酶。所述還原酶可以以純化的或部分純化的形式或另外以孩支生物本身的形式使用。用于從微生物中獲得并純化脫氫酶的方法為技術(shù)人員所熟知。利用還原酶的對映選擇性還原反應(yīng)優(yōu)選在存在合適輔因子(也稱作共底物)的情況下發(fā)生。通常用于酮的還原反應(yīng)的輔因子是NADH和/或NAI)PH。此外還原酶可用作內(nèi)在包含輔因子的細(xì)胞系統(tǒng)，或可加入備選的氧化還原介體(A.Schmidt,F.Hollmann和B.Biihler"OxidationofAlcohols",K.Drauz和H.Waldmann,EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis2002，第III巻，991-1032，Wiley-VCH，Wdnheim)。生，所述還原劑在還原反應(yīng)過程中再生氧化的輔因子。合適還原劑的實(shí)例是糖，特別是己糖，如葡萄糖、甘露糖、果糖和/或可氧化醇，尤其是乙醇、丙醇或異丙醇，和曱酸、亞磷酸或分子氫。為了氧化還原劑，和與之相關(guān)的再生輔酶，加入第二種脫氫酶是可能的，例如當(dāng)使用葡萄糖作為還原劑時，加入葡萄糖脫氫酶，或當(dāng)使用曱酸作為還原劑時，加入曱酸脫氫酶。其可作為游離酶或固定化酶使用，或以游離或固定化細(xì)胞的形式使用。其制備可分別進(jìn)行，或通過在(重組)還原酶菌林中的共表達(dá)來進(jìn)行。要求保護(hù)的方法的優(yōu)選實(shí)施方案是通過酶系統(tǒng)再生輔因子，在所述酶系統(tǒng)中使用第二種脫氫酶，特別優(yōu)選葡萄糖脫氫酶。10進(jìn)一步有利的是加入促進(jìn)還原反應(yīng)的其它添加物，例如金屬鹽或螫合劑，例如EDTA。根據(jù)本發(fā)明所用的還原酶可以以游離或固定化形式使用。固定化酶指固定在惰性栽體上的酶。在EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-A上的酶。這些出版物的公開內(nèi)容在此方面以其整體引入作為參考。合適的載體材料包括，例如粘土、粘土礦物如高嶺土、硅藻土、珍珠巖、二氧化硅、氧化鋁、碳酸鈉、碳酸鈣、纖維素粉、陰離子交換材料、合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、酚醛樹脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烴如聚乙烯和聚丙烯。載體材料通常以細(xì)分的微粒形式使用，以制備載體結(jié)合的酶，優(yōu)選多孔形式。所述載體材料的顆粒大小通常不超過5mm，特別不超過2mm(分級曲線)。在使用脫氫酶作為全細(xì)胞催化劑上選擇游離或固定化形式是類似可能的。載體材料的實(shí)例是藻酸鈣和角叉藻聚糖。酶和細(xì)胞也可以直接與戊二醛交聯(lián)(交聯(lián)產(chǎn)生CLEAs)。相應(yīng)和其它固定方法描述于例如J.Lalonde和A.Margolin"ImmobilizationofEnzymes",K.Drauz和H.Waldmann,EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis2002，第III巻，991-1032，Wiley畫VCH,Weinheim中。反應(yīng)可在水性反應(yīng)介質(zhì)或非水性反應(yīng)介質(zhì)或2相系統(tǒng)或(微)乳劑中進(jìn)行。所述水反應(yīng)介質(zhì)為優(yōu)選的緩沖溶液，其通常具有4到8，優(yōu)選5到8的pH。水性溶劑除水以外可額外地包含至少一種醇，例如乙醇或異丙醇，或二甲基亞砜。非水性反應(yīng)介質(zhì)指，基于液態(tài)反應(yīng)介質(zhì)的總重量以重量計(jì)包含少于1%，優(yōu)選少于0.5%的水的反應(yīng)介質(zhì)。所述反應(yīng)可特別在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。合適的有機(jī)溶劑是，例如優(yōu)選具有5到8個碳原子的脂族烴，如戊烷、環(huán)戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷、辛烷或環(huán)辛烷，優(yōu)選具有1或2個碳原子的卣代脂族烴，如二氯甲烷、氯仿、四氯曱烷、二氯乙烷或四氯乙烷，芳族烴，如苯、曱苯、二曱苯、氯苯或二氯苯，優(yōu)選具有4到8個碳原子的脂族非環(huán)狀和環(huán)狀醚或醇，如乙醇、異丙醇、二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、二丁基醚、四氫呋喃，或酯類，如乙酸乙酯或乙酸正丁酯，或酮類，如甲基異丁基酮或二嗜、烷或其混合物。特別優(yōu)選使用上述醚，尤其是四氫呋喃。利用還原酶的還原反應(yīng)例如可在水性有機(jī)反應(yīng)介質(zhì)，例如任何混合比例(例如1:99到99:1或10:90到90:10)的水/異丙醇或水性反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。在酶促還原反應(yīng)中，底物(1)優(yōu)選以0.1g/1到500g/1，特別優(yōu)選1g/1到50g/1的濃度使用，并且可連續(xù)或不連續(xù)加入。酶促還原反應(yīng)通常在低于所用還原酶的失活溫度并高于-10。C的反應(yīng)溫度下進(jìn)行。其特別優(yōu)選在0到100。C的范圍內(nèi)，特別在15到60。C的范圍內(nèi)，并尤其在20到40。C的范圍內(nèi)，例如約30。C。本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括在存在二價金屬離子，特別是在存在Ca、Mg、Mn、Zn、Ni、Fe、Mo離子下進(jìn)行反應(yīng)。有利地，選擇堿土金屬離子的濃度大概與待使用的底物(通式I的烯衍生物)的濃度相同。關(guān)于底物，特別是如果所述底物因其結(jié)構(gòu)能夠絡(luò)合金屬離子，例如在二羧酸衍生物的情況下，建議加入等摩爾濃度的二價金屬離子?？赡艿姆椒ɡ缡?，例如通過攪拌或搖動充分混合底物(1)和還原酶、溶劑、適當(dāng)時輔酶，適當(dāng)時第二種脫氫酶，以再生所述輔酶和/或其它還原劑。然而，在反應(yīng)器，例如在柱中固定所述還原酶，并使包含底物和適當(dāng)時輔酶和/或共底物的混合物穿過所述反應(yīng)器也是可能的。為此，使所述混合物循環(huán)通過所述反應(yīng)器直至實(shí)現(xiàn)想要的轉(zhuǎn)化是可能的。還原反應(yīng)通常進(jìn)行直至基于混合物中存在的底物的轉(zhuǎn)化為至少70%，特別優(yōu)選至少85%，并特別至少95%。反應(yīng)的進(jìn)程，即雙鍵的順序還原隨后可以是常規(guī)方法，如氣相色謙或高壓液相色譜。明確^Hf的酶的"功能等同物"或類似物在本發(fā)明上下文中是與所述酶不同但仍然具有想要的生物活性(例如底物特異性)的多肽。因此，"功能等同物"指酶，其例如催化模式反應(yīng)并具有包含SEQIDNO:l、2或3下列出的氨基酸序列之一的酶的活性的至少20%，優(yōu)選50%，特別優(yōu)選75%,十分特別優(yōu)選90%。功能等同物此外在pH4到IO之間優(yōu)選是穩(wěn)定的，并有利地具有pH5到8之間的最適pH，和20。C到80°C的范圍內(nèi)的最適溫度。根據(jù)本發(fā)明"功能等同物"還特別指突變體，其具有不同于上述氨基酸序列的至少一種序列位置中特別提及的氨基酸的氨基酸，但仍然具有一種上述生物活性。"功能等同物，，因此包含通過一個或更多氨基酸添加、替代、缺失和/或倒位獲得的突變體，所述修飾可能在任何序列位置中發(fā)生，只要它們導(dǎo)致產(chǎn)生具有本發(fā)明性質(zhì)譜的突變體。特別是當(dāng)反應(yīng)模式在突變體和未修飾多肽之間在性質(zhì)上一致時，即例如相同底物以不同速率轉(zhuǎn)化時，也存在功能等同物。合適的氨基酸替代的實(shí)例見于下表原始?xì)埢娲鷮?shí)例AIaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGinAsnGluAspGlyProHisAsn;GinlieLeu;ValLeuHe;ValLysArg;Gin;GluMetLeu;liePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrValTyrTrp;Phelie;Leu"功能等同物"在上文意義上也是所描述多肽和"功能衍生物"的"前體"。"前體，，在該上下文中是具有或不具有期望生物活性的多肽的天然前體或合成前體。也可在已知技術(shù)的幫助下，在功能氨基酸側(cè)基或在它們的N或C末端上制備本發(fā)明多肽的"功能衍生物"。此類衍生物包含例如羧酸基團(tuán)的脂族酯類、通過與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)所獲得的羧酸基的酰胺類；通過與?；磻?yīng)所制備的游離氨基的N-酰基衍生物；或通過與?；磻?yīng)所制備的游離羥基的O-?；苌?。在蛋白質(zhì)糖基化是可能的情況下，本發(fā)明的"功能等同物"包含上文中以去糖基化或糖基化形式，和通過改變糖基化模式獲得的修飾形式所指定類型的蛋白質(zhì)。"功能等同物"當(dāng)然也包含從其它生物和天然發(fā)生的變體中獲得的多肽。例如，通過比較序列確定同源序列區(qū)的范圍，并基于本發(fā)明特殊需要確定等同酶是可能的。"功能等同物"也包含片段，優(yōu)選本發(fā)明多肽的獨(dú)立結(jié)構(gòu)域或序列基序，其具有例如期望的生物學(xué)功能。"功能等同物"還是融合蛋白，其包含上述多肽序列或來自其的功能等同物之一，和功能上與其不同并且為功能性N或C末端連接(即具有融合蛋白部分的可忽略的相互功能損傷)的至少一種其它異源序列。此類異源序列的非限制性實(shí)例是，例如信號肽或酶?？赏ㄟ^篩選突變體(例如截短突變體)的組合文庫來鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的同源物。例如，可通過在核酸水平上組合突變，例如通過酶促連接合成寡核苷酸的混合物來產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的多樣化文庫。有多種方法可用于從簡并寡核苷酸序列制備潛在同源物的文庫。簡并基因序列的化學(xué)合成可在I)NA自動合成儀中進(jìn)行，并且所合成的基因然后可連接到合適的表達(dá)栽體上。使用簡并組的基因使得在一個混合物中提供編碼期望組的潛在蛋白質(zhì)序列的全部序列成為可能。用于合成簡并寡核苷酸的方法為技術(shù)人員所知(例如Narang,S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等，(1984)Science198:1056;Ike等(1983)NucleicAcidsRes.11:477)。用于篩選已經(jīng)通過點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物，和用于篩選具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物的cDNA文庫的幾種技術(shù)為本領(lǐng)域已知。這篩選。用于篩選大的基因文庫(其進(jìn)行高通量分析)的最常用技術(shù)包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中、轉(zhuǎn)化具有所得載體文庫的合適細(xì)胞并在檢測期望活性便于分離編碼基因的載體的條件下表達(dá)所述組合基因，所述基因的產(chǎn)物已被檢測。增加文庫中功能突變體頻率的技術(shù)遞歸總體誘變(Recursiveensemblemutagenesis)(REM)可用于與篩選試驗(yàn)組合以鑒定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等(1993:ProteinEngineering6(3》327-331)。本發(fā)明還涉及核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，其編碼具有本發(fā)明還原酶活性的酶。優(yōu)選編碼例如示于SEQII)NO:l、2或3特征性部分序列的氨基酸序列的核酸序列。此處提及的所有核酸序列可以以本身已知的方式通化學(xué)合成從過核苷酸結(jié)構(gòu)單元制備，例如通過雙螺旋的各重疊互補(bǔ)核酸結(jié)構(gòu)單元的片段縮合來制備。寡核苷酸的化學(xué)合成可以例如以已知方式通過亞磷酰胺方法進(jìn)行(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,896—897頁)。使用DNA聚合酶的Klenow片段加入合成的寡核普酸并填補(bǔ)缺口和連接反應(yīng)，和一般的克隆方法描述于Sambrook等(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)-險室出版。用于進(jìn)行本發(fā)明酶促還原方法的其它實(shí)施方案本發(fā)明方法中pH有利地保持在pH4到12，優(yōu)選pH4.5到9，特別優(yōu)選pH5到8之間。最小實(shí)現(xiàn)98%ee。為本發(fā)明方法使用包含核酸、核酸構(gòu)建體或編碼還原酶的載體的生長細(xì)胞是可能的。使用靜息細(xì)胞或破裂細(xì)胞也是可能的。破裂細(xì)胞指，例如，通過例如溶劑處理已經(jīng)變得可滲透的細(xì)胞，或通過酶處理，通過機(jī)械處理(例如弗氏壓碎器或超聲)或通過任何其它方法已經(jīng)崩解的細(xì)胞。以該方式獲得的粗提物有利地適合于本發(fā)明的方法。純化的或部分純化的酶也可用于所述方法。固定化微生物或酶也同樣合適，并且可有利地用于反應(yīng)中。可分批、半分批或持續(xù)進(jìn)行本發(fā)明的方法。如Biotechnology,第3巻，第二版，Rehm等編輯(1993),尤其是第II章中描述，可在生物反應(yīng)器中有利地進(jìn)行所述方法。在本發(fā)明方法中制備的產(chǎn)物可通過技術(shù)人員熟悉的方法從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并且如果需要可進(jìn)行純化。這些方法包括蒸餾法、色鐠法、萃取法和結(jié)晶法。根據(jù)需要，可通過組合多種所述方法顯著提高所述產(chǎn)物的純化。以下實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明，而不在限制本發(fā)明。在該上下文中將參考附圖，其顯示實(shí)驗(yàn)部分不對稱生物還原反應(yīng)的常用方案根據(jù)以下常用方案使用分離的酶YqjM、OPRl、OPR3進(jìn)行底物的不對稱生物還原反應(yīng)。由于在水中溶解性差，所以N-苯基-2-曱基馬來酰亞胺作為DMF中的10。/。溶液加入(終濃度1%)。向Tris緩沖液，50mMpH7.5(0.8ml)中的底物(5mM)溶液中加入酶制劑(100-200ng)及NADH或NADPH輔因子(15mM)，并且反應(yīng)在3()。C搖動下(140rpm)進(jìn)行。48小時后，用乙酸乙酉旨萃取反應(yīng)混合物，并通過GC分析反應(yīng)產(chǎn)物。當(dāng)使用輔因子再循環(huán)系統(tǒng)時選擇以下程序NADH/FDH系統(tǒng)16頁在已加入酶(100-200照)后，將50mMTris緩沖液pH7.5(0.8ml)中的底物(5mM)、被氧化的輔因子NAD+(100nM)、甲酸銨(20mM)的混合物與FDH(10u)混合，并且所述反應(yīng)在30。C(140rpm)進(jìn)行48小時。NADH/GDH在已加入酶(100-200jug)后，將50mMTris緩沖液pH7.5(0.8ml)中的底物(5mM)、被氧化的輔因子NAD+(100pM)、葡萄糖(20mM)的混合物與(D)-GDH(10u)混合，并且所述反應(yīng)在30°C(140rpm)進(jìn)4亍48小時。NADPH/G6PDH在已加入酶(100-200pg)后，將50mMTris緩沖液pH7.5(0.8ml)中的底物(5mM)、被氧化的輔因子NADP+(10)、葡萄糖6-磷酸(20mM)的混合物與G6PDH(10u)混合，并且所述反應(yīng)在30。C(140rpm)進(jìn)行48小時。以H2為載氣(14.5psi)在Varian3800氣相色語儀中進(jìn)行GC-FID分析。l-硝基-2-苯基丙烯轉(zhuǎn)化的測定使用6%的氰基丙基苯基聚硅氧烷(cyanopropylphenylpolysiloxane)相毛細(xì)管柱(VarianCP-1301,30m，0.25mm，0.25pm薄膜)以30:1的分流比通過GC-FID分析所獲得的產(chǎn)物。程序120。C/分鐘至180。C，20。C/分鐘至220。C,保持2分鐘。停留時間如下學(xué)烯(內(nèi)標(biāo))3.81分鐘，l-硝基-2-苯基丙烷8.87分鐘，l-硝基-2-苯基丙烯Z/E9.55/10.27分鐘。確定對映體過量和絕對構(gòu)型使用環(huán)糊精結(jié)合的二曱基聚硅氧烷相毛細(xì)管柱(CP畫Chirasil-DEXCB，25m，0.32mm，0.25拜薄膜)以25:1的分流比確定對映體過量。溫度程序105。C保持5分鐘，1。C/分鐘至120。C，保持6分鐘，20。C/分鐘至180°C，保持2分鐘。停留時間如下(S)-和(R)-l-硝基-2-苯基丙烷分別為12.06和12.57分鐘。通過共注射獨(dú)立合成的參考樣品來確定l-硝基-2-苯基丙烷的絕對構(gòu)型(丄Org.Chem.1989，54，1802-1804)。檸檬醛轉(zhuǎn)化的測定使用聚乙二醇相毛細(xì)管柱(VarianCP-Wax52CB,30m,0.25mm,0.25pm薄膜)以20:1的分流比通過GC-FID分析所獲得的產(chǎn)物。程序100。C保持2分鐘，15。C/分鐘至240°C,保持10分鐘。停留時間如下香茅醛5.21分鐘，1-辛醇(內(nèi)標(biāo))5.83分鐘，香葉醛7.53分鐘。確定對映體過量和絕對構(gòu)型使用修飾的p-環(huán)糊精毛細(xì)管柱(hydrodex-P-TBDAc，25m，0.25mm)確定香茅醛的對映體過量。溫度程序40。C保持2分鐘，4。C/分鐘至120。C,保持1分鐘，20。C/分鐘至180。C，保持3分鐘。停留時間如下(S)-和(R)-香茅醛分別為19.84和19.97分鐘。通過共注射具有已知絕對構(gòu)型的市售參考樣品來確定香茅醛的絕對構(gòu)型。N-苯基-2-甲基馬來酰亞胺轉(zhuǎn)化的測定使用6%的氰基丙基苯基聚硅氧烷相毛細(xì)管柱(VarianCP-1301，30m,0.25mm，0.25pm薄膜)以30:1的分流比通過GC-FID分析所獲得的產(chǎn)物。程序110。C保持2分鐘，30。C/分鐘至210。C，保持6分鐘。停留時間如下芋烯(內(nèi)標(biāo))3.69分鐘，N-苯基-2-曱基馬來酰亞胺8.77分鐘，N-苯基-2-甲基琥珀酰亞胺9.89分鐘。確定對映體過量和絕對構(gòu)型使用ChiralcelOD-H柱和正庚烷/乙醇95:5的溶液作為洗脫液在Shimadzu手性HPLC上確定對映體過量。80pl在18°C進(jìn)行等度洗脫33分鐘。停留時間如下(S)-和(R)-N-苯基-2-甲基琥珀酰亞胺分別為27.0和29.1分鐘。通過CD光譜學(xué)來確定l-N-苯基-2-曱基琥珀酰亞胺的絕對構(gòu)型U.Mol.Catal.B:Enzym2005,32，131-134)。環(huán)烯酮類轉(zhuǎn)化的測定使用6%的氰基丙基苯基聚硅氧烷相毛細(xì)管柱(VarianCP-1301,30m，0.25mm,0.25|iim薄膜)以30:1的分流比通過GC-FID分析所獲得的產(chǎn)物。程序80。C保持10分鐘，30。C/分鐘至200°C，保持3分鐘。停留時間分別如下2-甲基環(huán)戊酮4.27分鐘，3-甲基環(huán)戊酮4.44分鐘，2-曱基2-環(huán)戊烯-l-酮5.82分鐘，3-曱基環(huán)己酮7.27分鐘，(R)-芋烯(內(nèi)標(biāo))8.59分鐘，3-曱基2-環(huán)戊烯-l-酉同8.77分鐘，3-曱基2-環(huán)己烯-1-酮11.77分鐘。確定對映體過量和絕對構(gòu)型使用改進(jìn)的p環(huán)糊精毛細(xì)管柱(ChiraldexB-TA，40m，0.25mm)以25:1的分流比確定對映體過量。溫度程序80。C保持17分鐘，30°C分鐘至180°C，保持2分鐘。停留時間如下(S)-和(R)-3-曱基環(huán)戊酮8.08和8.29分鐘，(R)-和(S)-2-曱基環(huán)戊酮6.55和6.77分鐘，(R)-和(S)-3-甲基環(huán)己酮13.96和15.09分鐘。通過共注射具有已知絕對構(gòu)型的市售參考樣品來確定3-甲基環(huán)戊酮及3-曱基環(huán)己酮的絕對構(gòu)型。通過共注射具有已知絕對構(gòu)型的獨(dú)立合成的參考樣品來確定2-甲基環(huán)戊酮的絕對構(gòu)型(Tetrahedron:Asymmetry2001,12，1479-1483)。權(quán)利要求1.從通式(1)的不飽和烯衍生物酶促制備通式(2)的化合物的方法，該方法通過在還原酶的存在下還原通式(1)的化合物完成，其中A是硝基(-NO2)、酮基(-CRO)、醛基(-CHO)、羧基(-COOR)，R＝H或任選取代的C1-C6-烷基，R1、R2和R3相互獨(dú)立地是H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、羧基，或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)的芳族或非芳族基團(tuán)，或者R1連接到R3上，以成為4-8元環(huán)的一部分，或者R1連接到R上，以成為4-8元環(huán)的一部分，條件是R1、R2和R3不相同，所述還原酶(i)包含多肽序列SEQIDNO1、2或3中的至少一種，或(ii)具有與SEQIDNO1、2或3有至少80％同一性的功能上等同的多肽序列。2.權(quán)利要求1的方法，其中使用NADPH或NADH作為輔因子進(jìn)行所述還原反應(yīng)。3.權(quán)利要求2的方法，其中酶促再生所述輔因子。4.權(quán)利要求3的方法，其中通過葡萄糖脫氫酶或曱酸脫氫酶或仲醇再生所述輔因子。5.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，其中在水性、水-醇性或醇性反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行所述還原反應(yīng)。6.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，其中所述還原酶已經(jīng)被固定化。7.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，其中所述酶選自枯草芽孢桿菌和番茄的還原酶。其中8.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，其中通式(1)的化合物發(fā)生反應(yīng)，其中W是曱基，并且A是酮基。9.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)在0到45。C的溫度范圍和/或6到8的pH范圍內(nèi)進(jìn)4亍。10.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)在二價金屬離子存在下進(jìn)行。11.通過前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法制備的通式(2)化合物作為化學(xué)或酶促藥物合成的中間體的用途。全文摘要公開了通過在還原酶的存在下還原通式(1)的化合物，從通式(1)的不飽和烯衍生物酶促制備通式(2)的化合物的方法，所還原酶包含多肽序列SEQIDNO1、2或3的至少一種序列，或具有與SEQIDNO1、2或3有至少80％同一性的功能上等同的多肽序列。文檔編號C12P7/24GK101528937SQ200780039306公開日2009年9月9日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日發(fā)明者B·豪爾,K·費(fèi)伯,M·哈爾,R·施蒂默爾,T·弗里德里希申請人:巴斯夫歐洲公司