本發(fā)明涉及一種棉花的GhLMM基因，其編碼5-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)。利用首次在陸地棉中發(fā)現(xiàn)的類病變突變體Ghlmm，通過圖位克隆技術得到該基因。在Ghlmm突變體中，由于位于D亞組的GhLMM基因，其一個單核苷酸的SNP突變造成編碼區(qū)提前終止，功能喪失?？共⌒詸z測表明該突變體抗黃萎病性顯著提高。進一步通過PCR技術在陸地棉遺傳標準系TM-1A亞組和D亞組中獲得該基因的基因組序列，全長ORF序列及編碼的氨基酸序列。在四倍體棉花中，該基因含四個拷貝，利用生物技術調控該基因在四倍體棉花中表達劑量，可以提高棉花抗病性，屬于生物技術應用領域。
背景技術：
：細胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)是多細胞生物在信號分子的作用下由基因調控的細胞主動有序的死亡過程，是有機體生長發(fā)育和抵制外界脅迫的重要方式之一。根據(jù)誘導產(chǎn)生PCD的因素，可劃分為生長發(fā)育過程中的PCD和環(huán)境誘導的PCD。生長發(fā)育過程中的PCD是植物正常生長發(fā)育所必須的，其參與植物組織器官的分化和形態(tài)建成、保證功能性孢子和配子體的發(fā)育、生殖過程的完成。而環(huán)境誘導的PCD主要指鹽，干旱等非生物脅迫以及病原菌侵染等生物脅迫產(chǎn)生的超敏反應，通過受侵染部位的快速細胞死亡，起到隔離作用，達到保護臨近健康組織目的。在遇到病原菌等生物脅迫中，植物為了應對病菌的攻擊，進化出了復雜的信號和防衛(wèi)機制來保護自己。概括分為自身的基本抗性和病菌誘導的抗性兩大類。當病原菌侵染時，其表面的病原相關分子特征PAMP(pathogen-associatedmolecularpatterns)被植物特異的病原識別受體PRR(pathogenesis-relatedproteins)所識別，激發(fā)PAMP激活的免疫反應(PTI)。目前已鑒定出來的病菌相關分子包括，革蘭氏陰性菌的鞭毛蛋白，脂多糖真菌和卵菌的幾丁質和葡聚糖。PTI表現(xiàn)在植物利用自身固有的介質來抵抗外界病原物的入侵，如：細胞壁的蠟質，角質，小分子抗病物質(酚類化合物、富半胱氨酸抗微生物多肽以及相關的過氧化物酶)來破壞病原菌滲調蛋白和核糖體失活蛋白。PTI是抵御病菌侵染的第一道防線。當病菌突破植物的第一道防線之后，分泌效應蛋白進入植物體內，被植物的R蛋白識別后，觸發(fā)效應蛋白激活的免疫反應(ETI)。該防御體系又可分為局部抗性和系統(tǒng)獲得性抗性。其中，局部抗性是指超敏反應(HR)。當植物受到病菌的侵染后，在侵染部位或者附近迅速局部死亡，形成病斑。阻斷病菌營養(yǎng)供給，同時誘導周圍細胞產(chǎn)生抑制病原菌生長的物質，以達到限制病菌進一步增殖。在HR過程中會導致細胞程序性死亡，其過程在相關基因精準調控下完成。與局部抗性相對應的是系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)。在病菌侵染后的幾天到一周后，植株整體水平產(chǎn)生新的抗性，對病菌的再一次侵染會產(chǎn)生抵抗力。SAR的標志事件就是植株SA含量升高，PR基因表達量升高。研究表明，植物的抗病信號通路十分復雜，許多植物激素參與其中，如：SA，JA，乙烯，一氧化氮，ROS等。各種激素信號之間相互聯(lián)系，相互作用，在正常野生型中研究十分困難，利用突變體可加速抗病機制研究進程。類病變突變體是在沒有受到生物和非生物的脅迫下，植物自身產(chǎn)生類似病菌侵染的表型的突變體。類病變突變體上病斑的產(chǎn)生，類似于植物超敏反應的細胞死亡過程。因此，類病變突變體不僅是揭示細胞程序性死亡的有力工具，還是研究植物抗病信號通路和抗病分子機制的優(yōu)異材料。目前，至少60余種類病變突變體在玉米，水稻，大麥，擬南芥中發(fā)現(xiàn)。遺傳分析表明，大多數(shù)的類病變突變體都是隱性突變。通過正向遺傳學，導致突變體的一些基因已經(jīng)被克隆。其突變基因主要涉及：1、葉綠素的合成和降解過程。2、鞘脂類和氧化脂類等脂肪酸的代謝過程。3、植物的防衛(wèi)免疫通路。4、胞內運輸過程。5、核內信號的整合及調控基因表達過程(Bruggemanetal.,2015)。研究表明，雖然有少數(shù)類病變突變體對病菌更加敏感，大多數(shù)的類病變突變體表現(xiàn)為增強的病菌抗性。例如，葉綠素的合成和降解過程均會導致植株類病變表型。在植物四吡咯代謝通路中的基因突變會導致類病變突變體的形成，且植株抗病性增強。葉綠素a、b，亞鐵血紅素，血紅素都屬于四吡咯化合物，其正常的合成和代謝對光合作用，呼吸作用，氮硫同化等過程，意義重大。擬南芥rug1突變體，是由于膽色素原脫氨酶(PBGD)功能缺失，造成植物體內積累膽色素原(PBG)。表現(xiàn)為葉片形狀變化，伴有壞死斑產(chǎn)生。其開花期延遲，株高變矮，生長發(fā)育受到抑制。在rug1突變體中，體內ROS和SA含量增加，抗病相關基因表達升高(Quesadaetal.,2013)。擬南芥的LIN1編碼糞卟啉原氧化酶(CPO)，其lin1突變體的葉片和長角果上具有病斑。LIN1基因突變造成糞卟啉原的積累和ROS含量升高，組成型表達抗病相關基因，增強對病菌的抗性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該突變體與轉nahG擬南芥(不能積累SA的轉基因材料)雜交其病斑并沒有消失，但PR1基因的表達水平降低，說明lin1病斑的產(chǎn)生不依賴SA，但lin1中PR基因的高表達依賴SA(Sunetal.,2011)。FHY3和FAR1是擬南芥轉座酶派生的轉錄因子。擬南芥fhy3far1雙突變體葉片上具有自發(fā)形成的壞死斑，屬于類病變突變體。突變體植株矮小，生長發(fā)育受到影響。研究表明，fhy3far1突變導致其下游HEMB基因下調表達，引起ROS的增加。并且SA信號通路激活，PR基因上調表達，表現(xiàn)為抗性增強(Wangetal.2015)。玉米LES22編碼l尿卟啉原脫羧酶(UROD)，在les22突變體中，積累尿卟啉原，造成玉米葉片產(chǎn)生病斑，并且病斑的產(chǎn)生與光照和植物生長年齡相關(Huetal.,1998)。葉綠素代謝的缺陷同樣導致細胞死亡。當葉綠素降解過程中的酶被破壞之后，也會產(chǎn)生自發(fā)的細胞死亡的類病變表型。如：acd1突變體是因為破壞了脫鎂葉綠酸加氧酶(PAO)基因，造成了光敏的脫鎂葉綠酸a的積累，引起細胞死亡(Tanakaetal.,2003)。綜上所述，對類病變突變體的突變基因研究有利于揭示PCD與抗病作用機理，闡明抗病信號通路間相互關系，為植物抗病分子育種提供理論指導。棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，不僅提供天然纖維，也是重要的油料作物。在棉花的生長過程中會遭受很多病害的威脅，其中黃萎病是目前對棉花威脅最大的病害之一。感染黃萎病后，棉花葉片會黃化、萎蔫、脫落造成棉花產(chǎn)量品質下降，甚至絕收。目前我國黃萎病感染面積達到250萬公頃，造成幾十億的經(jīng)濟損失。我國發(fā)現(xiàn)的致病的黃萎病為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，它是一種土傳真菌。其發(fā)病過程由下向上，首先是葉片邊緣失水萎蔫，之后形成西瓜皮狀的葉上斑點，最后葉片焦枯脫落，變成光桿。針對黃萎病防治主要采用化學控制和培育高抗品種方法。但是由于黃萎病是通過植物的維管系統(tǒng)進行運輸，寄生在植物體內，外施農(nóng)藥不能有效的緩解黃萎病病害。植物死亡之后，黃萎病菌可以產(chǎn)生微菌核，它可以在土壤內存活十年之久。當植物根部受到損傷，產(chǎn)生滲出液，微菌核便可復蘇，通過傷口進入植物體內。目前只有熏蒸的方法可以殺死土壤中的黃萎病菌，但是土壤熏蒸對環(huán)境有極大的影響，并且耗費大量財力。所以培育抗黃萎病的棉花品種就顯得尤為重要。陸地棉是主要的栽培品種，全球90％以上種植的棉花都是陸地棉。但是陸地棉的黃萎病抗性差，并且陸地棉中缺少免疫或者高抗的抗源，這是一直困擾棉花育種家的一大難題。到目前為止，棉花中還沒有類病變突變體的報道。我們以異源四倍體陸地棉材料W0為受體，在組織培養(yǎng)的后代中發(fā)現(xiàn)了一個類病變突變體Ghlmm。該突變體表現(xiàn)為在植株的葉片局部自發(fā)形成黑色病斑，但對棉花的纖維產(chǎn)量和品質沒有顯著影響。遺傳分析表明，Ghlmm是由單基因控制的隱性性狀，定位到棉花的D5染色體上。精細定位和圖位克隆發(fā)現(xiàn)，Ghlmm是由于Gh_D05G2237編碼區(qū)單核苷酸突變，引起翻譯的多肽提前終止，造成功能缺失。Gh_D05G2237編碼5-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)，其功能是將2分子的5-氨基乙酰丙酸(ALA)轉換成1分子膽色素原(PBG)。在異源四倍體陸地棉中共有2個編碼ALAD基因，是部分同源基因。一個為定位在D亞基因組的Gh_D05G2237，命名為GhLMMD，另外一個為定位在A亞基因組，其部分同源基因Gh_A05G3720，命名為GhLMMA。在異源四倍體棉花中，每個基因含2個拷貝。通過接菌黃萎病抗性鑒定，結果表明，我們發(fā)現(xiàn)的Ghlmm突變體具有顯著提高的黃萎病抗性。棉花黃萎病危害巨大，治理困難，而占全球種植面積90％以上的陸地棉抗源匱乏。鑒于此，陸地棉突變體Ghlmm的發(fā)現(xiàn)及抗病分子機理研究，可以拓寬對棉花黃萎病抗性的認識，通過調控目標基因的表達，實現(xiàn)精確調控棉花生長和抗病之間的平衡，培育抗性顯著提高的新種質并在生產(chǎn)上應用，為棉花黃萎病抗性育種提供重要的指導作用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種棉花GhLMM基因在提高棉花抗病性及培育棉花新種質中的應用。利用GhLMMA或GhLMMD基因功能缺失突變體與常規(guī)種植的棉花品種雜交配置雜交種提高棉花的黃萎病抗性。以此基因為靶基因，通過反義RNA技術等基因工程方法，在一定范圍內下調GhLMM基因的表達，培育生長發(fā)育正常，且抗性顯著提高的棉花新種質并在生產(chǎn)上應用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種提高棉花抗黃萎病的方法。本發(fā)明的又一目的在于提供一種棉花GhLMM基因，并提供該基因在陸地棉遺傳標準系TM-1A亞組(GhLMMA)和D亞組(GhLMMD)的全長cDNAORF和基因組序列。另外還提供了上述棉花的GhLMM基因所編碼的蛋白。該基因在陸地棉遺傳標準系TM-1A亞組和D亞組中編碼的氨基酸序列。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的GhLMM基因在廣譜性提高棉花抗病性及培育棉花新種質中的應用。上述的應用，其在于：利用所述GhLMM基因的功能缺失突變體與常規(guī)種植的棉花品種雜交配置雜交種提高棉花的抗病性。上述的應用，其在于：以所述的GhLMM基因為靶基因，通過反義RNA技術等基因工程方法，在一定范圍內下調GhLMM基因的表達，培育生長發(fā)育正常，且抗性顯著提高的新種質并在生產(chǎn)上應用。一種提高棉花抗黃萎病的方法，在棉花中調控核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的GhLMM基因的表達劑量。一個能顯著提高棉花抗病性的GhLMM基因，該基因為(1)～(2)中的任意一種：(1)該基因在陸地棉遺傳標準系TM-1的基因組A亞組(GhLMMA)中核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)該基因在陸地棉遺傳標準系TM-1的基因組D亞組(GhLMMD)中核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。如(1)所述的基因GhLMMA，該基因具有如SEQIDNO.3所示的ORF序列；如(2)所述的基因GhLMMD，該基因具有如SEQIDNO.4所示的ORF序列。上述的GhLMM基因編碼的蛋白，其中基因GhLMMA編碼的蛋白具有如SEQIDNO.5所示的氨基酸序列；基因GhLMMD編碼的蛋白具有如SEQIDNO.6所示的氨基酸序列。含有上述GhLMM基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。上述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在提高棉花廣譜抗病性和培育棉花新種質中的應用。所述的抗病性為黃萎病抗病性。本發(fā)明的優(yōu)點表現(xiàn)在：(1)首次在棉花中發(fā)現(xiàn)類病變突變體Ghlmm并克隆其關鍵基因。到目前為止，棉花中還沒有類病變突變體的報道。我們以異源四倍體陸地棉材料W0為受體，在組織培養(yǎng)的后代中發(fā)現(xiàn)了一個類病變突變體Ghlmm。遺傳分析表明，該突變性狀是由單基因控制的隱性性狀。圖位克隆表明該突變性狀是由于異源四倍體棉花D亞組的GhLMMD基因編碼區(qū)發(fā)生SNP突變，導致翻譯提前終止，造成基因功能喪失，而A亞組的GhLMMA功能正常。Ghlmm突變體可以完成生長周期，與野生型相比，其纖維品質和產(chǎn)量無顯著差異。GhLMM編碼5‐氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)，其功能是將2分子的5‐氨基乙酰丙酸(ALA)轉換成1分子膽色素原(PBG)。在異源四倍體陸地棉中共有2個編碼ALAD基因，是部分同源基因。每個基因含2個拷貝，因此，異源四倍體棉花中編碼ALAD的基因共有四個拷貝。表達分析顯示，GhLMMA和GhLMMD在不同組織器官中表達水平一致，表明該基因行使功能的劑量效應。由于GhLMMA和GhLMMD核苷酸序列相似為98％，氨基酸序列相似性達99％。使用基因工程基因編輯技術很難創(chuàng)造單個亞組基因功能缺失的突變體。(2)類病變突變體Ghlmm是研究棉花抗病信號通路及分子機制的優(yōu)異材料，調控GhLMM表達可增強棉花抗病性。黃萎病抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，類病變突變體Ghlmm具有增強的黃萎病抗性。與正常材料W0相比，突變體中5‐氨基乙酰丙酸(ALA)積累，ROS和SA合成顯著增加，PR基因表達顯著提高。因此，研究Ghlmm突變體中差異表達基因，可以揭示其中的抗病信號通路和抗病的分子機制。調控GhLMM表達可增強棉花抗病性，為棉花抗病分子育種提供新思路和新基因。(3)研究GhLMM基因的劑量效應，可以實現(xiàn)植物生長和抗性之間的最佳平衡，達到精確調控育種。陸地棉野生型W0具有4個拷貝的GhLMM基因(AtAtDtDt，A亞組和D亞組中各含2個拷貝)，突變體具有兩個拷貝的GhLMM(AtAtdtdt)基因，用W0和Ghlmm突變體進行雜交可以獲得3個拷貝的F1(AtAtDtdt)。在多倍體中可以研究GhLMM的劑量效應，實現(xiàn)植物生長和抗性之間的最佳平衡。通過調控GhLMM基因的表達，控制GhLMM的劑量效應，可以為棉花的抗病育種提供新思路和新基因。以此基因為靶基因，通過反義RNA技術等基因工程方法，以農(nóng)桿菌侵染的手段得到轉基因純合材料，在一定范圍內下調GhLMM基因的表達，實現(xiàn)精確調控棉花生長和抗病之間的平衡，培育抗性顯著提高的棉花新種質并在生產(chǎn)上應用。附圖說明圖1Ghlmm突變體的精細定位和圖位克隆a：生長3個月大的突變體和野生型植株表型。Ghlmm突變體在棉花葉片自發(fā)形成病斑。b：Ghlmm突變體突變基因的精細定位。c：葉片中表達的12個候選基因在W0和Ghlmm中進一步定量驗證。d：Ghlmm突變體中GhLMMD在127bp處核苷酸由G變?yōu)門的單突變，導致翻譯提前終止。圖2在野生型W0中沉默Gh_D05G2254不能產(chǎn)生Ghlmm突變體表型a：在W0中沉默Gh_D05G2254后的表型。b：VIGS沉默后Gh_D05G2254表達的定量驗證。圖3在W0中沉默GhLMM產(chǎn)生Ghlmm突變體表型a：在W0中沉默GhLMM后的表型b：VIGS沉默GhLMM后表達的定量驗證，該基因在A、D亞組的部分同源基因其表達均下調c：VIGS沉默后ALA、過氧化氫、MDA的含量。圖4GhLMM基因的組織器官表達、亞細胞定位及其同源基因的系統(tǒng)進化分析a：GhLMM的組織器官表達特征。該基因在A、D亞組的部分同源基因其表達基本一致b：不同物種來源的GhLMM同源基因(ALAD基因)系統(tǒng)進化分析c：GhLMM基因的亞細胞定位。圖5GhLMMD基因的功能缺失導致突變體ALA含量升高，ROS含量增加。a：GhLMMA和GhLMMD基因在W0和Ghlmm之間的表達。b-d：W0和Ghlmm的ALAD酶活，ALA、PBG含量比較。e-f：W0和Ghlmm的過氧化氫和MDA含量比較。g：ROS染色。h：過氧化氫染色。圖6噴施20mM的LA導致W0表現(xiàn)出Ghlmm突變體表型。a：噴施20mM的LA(ALAD抑制劑)導致W0表現(xiàn)出Ghlmm突變體表型。b：噴施20mM的LA后會造成ALA積累。c：噴施20mM的LA后過氧化氫含量升高。圖7Ghlmm突變體的黃萎病抗性鑒定。a：Ghlmm黃萎病抗性鑒定。突變體受體陸地棉材料W0、感病陸地棉品種軍棉1號、抗病海島棉品種H7124作為對照。b：病級調查c：接病16天后第一片真葉的黃萎病相對含量。圖8接病16天后劈桿和病菌復蘇實驗。a：接病16天后子葉結向上1cm莖稈劈桿實驗和徒手切片實驗。b：接病16天后，第一片真葉和子葉結向上1cm處莖段，土豆培養(yǎng)基培養(yǎng)4天后病菌復蘇實驗。c：對照不處理莖稈劈桿實驗和徒手切片實驗。d：對照不處理葉片和莖段病菌復蘇實驗。圖9Ghlmm突變體SA含量升高，PR基因表達升高。a：Ghlmm和W0的SA含量b：PR基因在W0和Ghlmm之間的表達。c:轉錄組表達差異基因GO富集分析。圖10ROS和SA具有循環(huán)放大效應ROS誘導SA信號通路基因高表達導致SA含量增加。SA抑制過氧化氫酶酶活，導致ROS含量升高。a：SA信號通路基因EDS1、PAD4、PAL基因受過氧化氫誘導高表達。b：SA信號通路基因EDS1、PAD4、PAL基因在Ghlmm突變體中高表達。c：Ghlmm中CAT酶活受到抑制。d:用2-氨基茚滿-2磷酸(AIP)抑制Ghlmm的SA合成后，Ghlmm表型消失，ROS含量減少。e：AIP處理后Ghlmm和W0的SA含量減少。圖11抑制Ghlmm突變體中SA合成，PR基因表達降低抑制Ghlmm突變體SA合成后，與未抑制相比，PR基因表達降低。圖12PR基因受SA誘導表達PR基因受SA誘導后，表達量顯著升高。圖13利用不同濃度LA處理，模擬GhLMM基因在細胞死亡和誘導抗病基因表達的劑量效應a：0、1、5、10、20、30mMLA處理W0后葉片表型。b：不同濃度LA處理后ALA、過氧化氫、SA含量。c：不同濃度LA處理后PR基因的表達。圖14GhLMM基因在抗黃萎病中的劑量效應配置4拷貝材料W0(AtAtDtDt)，2拷貝材料Ghlmm突變體(AtAtdtdt)，以及3拷貝材料(W0×lmm)F1進行黃萎病抗性鑒定。a：W0、lmm、(W0×lmm)F1的黃萎病抗性鑒定結果。b：病級調查。圖15GhLMM基因劑量效應影響ALA、ROS、SA含量和PR基因的表達a：GhLMM基因在W0、(W0×Ghlmm)F1、Ghlmm中的表達模式。b：ALAD酶活，ALA、PBG的含量。c：過氧化氫、SA含量和CAT酶活。d:抗病基因PR基因的表達。圖16Ghlmm突變體用于棉花抗黃萎病育種利用Ghlmm突變體分別與TM-1，軍棉1號雜交后，其F1黃萎病抗性顯著提高。a：TM-1、(TM-1×Ghlmm)F1、軍棉1號、(軍棉1號×Ghlmm)F1的黃萎病抗性鑒定。b：病級調查。圖17調控GhLMM基因的劑量效應，實現(xiàn)植物生長和抗病的高效平衡a：4拷貝GhLMM基因W0(AtAtDtDt)植株生長正常，但是沒有ALA積累，抗病信號通路沒有被激活。b：3拷貝GhLMM基因(W0×Ghlmm)F1，ALA積累，抗病信號通路激活，植株表現(xiàn)正常生長和抗病性提高。c：2拷貝ALAD基因Ghlmm突變體，ALA大量積累，但表現(xiàn)葉片細胞死亡，同時ROS、SA含量顯著增加，抗病信號通路激活，抗病性顯著提高。d：利用VIGS沉默棉花GhLMM基因，植物的四吡咯合成受阻，缺少能量不能正常生長發(fā)育，進而植株死亡。具體實施方式(一)棉花類病變突變體Ghlmm的發(fā)現(xiàn)，精細定位和圖位克隆我們在陸地棉品種W0的組織培養(yǎng)再生苗中，發(fā)現(xiàn)一個類病變突變體(Lesionmimicmutant)。在沒有任何生物和非生物脅迫條件下，該突變體在葉片上自發(fā)形成病斑。我們將其命名為陸地棉類病變突變體Ghlmm。Ghlmm突變體可以完成正常的生長周期，與對照W0相比，其纖維品質和種子產(chǎn)量基本不受影響(表1)。將陸地棉類病變突變體Ghlmm與遺傳標準系TM-1雜交，F(xiàn)1植株葉片無病斑，表型為野生型。F1自交產(chǎn)生含763株的F2分離群體。在F2群體的苗期、蕾期、花鈴期三個生長發(fā)育時期進行葉片表型性狀調查，確定單株表現(xiàn)型。結果表明，在F2群體中209株表型為Ghlmm表型，554株為野生型?？ǚ街禐?.202，符合葉片正常和突變3:1分離比，說明Ghlmm突變體是隱性單基因控制的質量性狀。通過本實驗室構建的高密度遺傳連鎖圖譜，將GhLMM基因定位到D5染色體上標記NAU7928和S2393之間，兩個標記的物理距離為371kb。通過TM-1基因組測序結果發(fā)現(xiàn)此區(qū)間內共有25個開放閱讀框，其中，葉片中FPKM值大于1的有12個。通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，只有Gh_D05G2237和Gh_D05G2254在突變體中表達量顯著下降(圖1)。將兩個基因在TM-1，W0和Ghlmm中克隆發(fā)現(xiàn)，Gh_D05G2254沒有差異。利用VIGS沉默技術將Gh_D05G2254在W0中沉默，并不能產(chǎn)生Ghlmm表型(圖2)。而Gh_D05G2237在Ghlmm中127bp處有一單核苷酸突變，由G突變?yōu)門，Glu(GGA)突變?yōu)榻K止密碼子(TGA)，造成了基因的提前終止。進一步利用突變位點設計T能產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，而G不能產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的SNP引物。用763株F2群體進行擴增，發(fā)現(xiàn)所有的209株Ghlmm表型植株都具有擴增產(chǎn)物。利用VIGS沉默技術將Gh_D05G2237在W0中沉默，注射10天之后表現(xiàn)出Ghlmm表型，繼續(xù)培養(yǎng)植株不能產(chǎn)生新的幼葉繼而死亡，qPCR表明該基因在陸地棉A、D亞組的拷貝均被沉默(圖3)。綜上所述，我們確定Ghlmm突變體其突變表型是由于Gh_D05G2237中的單核苷酸突變導致該基因提前終止，造成功能失活。在陸地棉正常材料中該基因被定名為GhLMM，含2個部分同源基因。一個定位在A亞基因組，命名為GhLMMA(該基因的基因組序列如SEQIDNO.1所示，其cDNAORF序列如SEQIDNO.3所示，該基因編碼的蛋白質序列如SEQIDNO.5所示)。一個定位在D亞基因組，命名為GhLMMD(該基因的基因組序列如SEQIDNO.2所示，其cDNAORF序列如SEQIDNO.4所示，其cDNAORF序列如SEQIDNO.6所示)。GhLMM編碼5-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)，其功能是將2分子的5-氨基乙酰丙酸(ALA)轉換成1分子膽色素原(PBG)。研究所用引物列于表2。表1：受體W0和類病變突變體Ghlmm的纖維品質和產(chǎn)量比較表2：精細定位、克隆、功能驗證目標基因所用引物引物名稱引物序列(5'-3')用途S2470FTAAGTATCGTGGCCCATGGA精細定位S2470RTGTAACCCCATTGTGTCGCA精細定位S3183FTCGTGGCCCATGGATTAAACT精細定位S3183RACTGGACGAAGCCTTGACAT精細定位NAU7928FGGGTAAACAAACATTGCATC精細定位NAU7928RTCCATTCATTAGACTGCTACTTCTG精細定位S2393FAATGTGATGTAGCTTAGACCAACTTCCAACCTAC精細定位S2393RGCAAATATCCTGACATGAGAACATATGAATCCA精細定位S3184FACCAACCATGCAATAGTCCC精細定位S3184RGCAGAAGGGTTCGAGAAGCA精細定位S2450FGTTTAAGGTTCAATTCTGGTAGGACTTCAACCTTAT突變位點SNP引物S2450RTTGTCACAAATTCCTATCACATTACCCCCTATTT突變位點SNP引物S2657FTTTAAGGAACGAAAAAGAAATAGAGhLMM的cDNA序列克隆S2657RTCATAGAAGGAAAATCAGACCAAGGhLMM的cDNA序列克隆S2346FTTCATTGTGTACCCATTTCTTGTGhLMM基因組分段克隆-1S2346RCATTGTCATTGTAGGCTTCATCCGhLMM基因組分段克隆-1S2347FCAGGATGTTATAGGCTTGGATGGGhLMM基因組分段克隆-2S2347RGATTTGATAGGCGAAAAGGGATTGhLMM基因組分段克隆-2S2348FAGGTTTTACTTTCTTTTCACTTCCGhLMM基因組分段克隆-3S2348RCATTCTAACAACTAGCACTCTCGAGhLMM基因組分段克隆-3S2454FCAATGACAATGGTTTAGTGCCTGhLMMVIGS載體構建S2454RTTCTCTGTAATTTGCTGGGTTCGhLMMVIGS載體構建S4349FGTCGAGAGGGAATAACTGGGAGh_05D2254的cDNA序列克隆S4349RAGTCCAACCACCGTTGATGTTGh_05D2254的cDNA序列克隆S3649FCGGCCACTTAAATCCCTCCAGh_05D2254VIGS載體構建S3649RCTGAACCAAGCACTCAACCGGh_05D2254VIGS載體構建(2)GhLMM基因的特征及進化分析基于已釋放的棉花四倍體TM-1基因組序列數(shù)據(jù)，以及測序過的物種序列信息。利用PFAM網(wǎng)站http://pfam.janelia.org，下載種子文件(Pfam00490)。我們調查了藻類：衣藻、團藻，蕨類：卷柏，苔蘚：小立碗苔蘚，裸子植物：挪威云杉，單子葉植物：水稻、谷子、高粱、二穗短柄草雙子葉植物：擬南芥、大豆、葡萄、可可、楊樹以及三個棉種雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中GhLMM的同源基因(ALAD基因)。利用MEGA軟件，進行系統(tǒng)進化樹構建。在調查的所有物種中，ALAD基因數(shù)量最多的只有2條，不同來源的ALAD基因結構上十分相似。說明ALAD基因進化上十分保守，功能非常重要。通過設計GhLMM亞組?；亩恳?，以TM-1的根、莖、葉以及不同時期的胚珠、纖維的cDNA為模板，用定量PCR技術，對GhLMM基因在不同組織器官表達特征進行研究。GhLMM基因在供試的不同組織器官種均表達，在葉片和胚珠發(fā)育早期和纖維中表達量相對較高。設計異源四倍體陸地棉亞組專化引物(表3)，進行亞組基因表達分析。GhLMMA和GhLMMD在不同組織器官中表達水平一致，無明顯差異。構建GFP4亞細胞定位載體，利用農(nóng)桿菌注射煙草葉片的方法，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GhLMM基因的亞細胞定位，GhLMMA和GhLMMD均定位到葉綠體上(圖4)。表3：擴增所用引物引物名稱引物序列(5'-3')用途S2622FTGGTGAGAAGAGGTGAACTTGGTCCGGhLMM-Dt定量PCRS2622RAGGCTTATGAAGATGCGGACTACGAACAGGhLMM-Dt定量PCRS2706FTTATCCTTACATATTTTGCTCTACAAGCTGCAAGAGGhLMM-At定量PCRS2706RCTCCTCATCGTTTTAACAACTAGCACTCTCGAGhLMM-At定量PCRS2979FGAACGATAGGGTACCCCCGGGATGGCTTCCACAATTGTAAAGhLMM亞細胞定位S2979RGCCCTTGCTCACCATGGATCCCCTCTTCTCACCACATAAAGGhLMM亞細胞定位(3)類病變突變體的細胞程序性死亡機理的研究GhLMM基因編碼5-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)，是四吡咯化合物合成中的關鍵酶，其功能是將ALA轉換成PBG。我們推測Ghlmm突變體中編碼ALAD基因的GhLMM突變會造成ALA的積累。ALA積累過量后，會烯醇化產(chǎn)生ROS。ROS的累積會對植物細胞膜的脂類分子產(chǎn)生氧化脅迫造成植物細胞死亡。以W0和Ghlmm為研究材料，在棉花生長到兩葉一心時期取樣。檢測GhLMM基因的表達，發(fā)現(xiàn)W0和Ghlmm中GhLMMA表達并沒有差異，但是GhLMMD基因提前終止造成基因功能喪失，其表達量也極顯著下降。同時我們檢測了ALAD酶活，發(fā)現(xiàn)Ghlmm中具有ALAD酶活，但與野生型相比其酶活水平極顯著下降。說明GhLMMA具有ALAD酶活活性，在野生型材料中GhLMMA與GhLMMD轉錄水平相當，GhLMMA不能補償GhLMMD基因功能缺失。在Ghlmm中，ALAD底物ALA積累，產(chǎn)物PBG含量降低。ALA大量積累造成ROS含量升高，對植物細胞膜造成氧化損傷，MDA含量升高(圖5)。乙酰丙酸(LA)是ALAD的抑制劑，我們利用體外噴施LA抑制ALAD活性來模擬Ghlmm突變體GhLMM基因失活。噴施20mM的LA之后W0葉片中產(chǎn)生細胞死亡現(xiàn)象，并且ALA、過氧化氫含量升高。VIGS沉默GhLMM之后ALA、過氧化氫和MDA含量升高(圖6)。通過以上實驗表明植物體內ALA積累會造成ROS含量的增加，導致植物細胞死亡。綜上所述，引起Ghlmm突變體葉片細胞死亡表型的原因是由于ALA積累，ROS爆發(fā)對植物細胞膜的氧化損傷導致。(4)類病變突變體Ghlmm的抗病鑒定、抗病機理的研究用突變體Ghlmm和受體W0以及抗病材料H7124和感病材料軍棉1號作研究材料，對Ghlmm突變體的黃萎病抗性進行了鑒定。棉花種植16-18天后，植株處于2葉一心時期。用培養(yǎng)的黃萎病菌V991，20mL1×107的懸浮孢子液，撕底傷根的方式進行接病。接病后調查病級。在接病16天后W0和軍棉1號葉片表現(xiàn)出黃化萎蔫的表型，而Ghlmm和H7124沒有感病表型。提取棉花第一片真葉DNA，用黃萎病菌內標基因引物進行定量驗證，棉花的組蛋白3基因作為內標，檢測棉花葉片中黃萎病的相對含量，發(fā)現(xiàn)Ghlmm和H7124接病16天后，第一片真葉中基本檢測不到黃萎病，而W0和軍棉一號已有較高含量的黃萎病菌(圖7)。莖稈切片實驗發(fā)現(xiàn)W0和軍棉1號維管束變?yōu)樽睾谏?。取植株同一部位的莖段和第一片真葉，置于土豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)四天發(fā)現(xiàn)，W0和軍棉1號莖中和第一片真葉黃萎病菌菌斑明顯。而Ghlmm和H7124莖稈切片實驗和病菌復蘇實驗表明，在接病16天后，沒有明顯病菌侵染表型(圖8)。為了進一步揭示Ghlmm突變體抗病的分子機理，我們以W0和Ghlmm為研究材料，在棉花生長到兩葉一心時期取樣開展研究。SA含量升高是植物系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的必要條件，通過檢測植株SA含量，發(fā)現(xiàn)與對照相比，Ghlmm中SA含量顯著升高。SAR的標志是PR基因的高表達，且PR基因是植物抵抗病菌侵染的直接效應基因。在兩葉一心時期，取W0和突變體Ghlmm根，莖，葉檢測PR基因的表達特征。結果表明，Ghlmm葉片中PR基因表達量極顯著升高，與對照相比，PR1和PR5表達量差異百倍以上。在莖和根上，也檢測到PR基因的顯著高表達。為了在全基因組水平上揭示Ghlmm的抗病機理。我們提取W0和Ghlmm葉片RNA,進行轉錄組差異表達分析。根據(jù)測序結果，篩選表達差異基因，并進行GO富集。結果顯示Ghlmm中與脅迫，防衛(wèi)反應，植物免疫等相關基因被顯著富集(圖9)。為研究突變體中ROS爆發(fā)與SA信號的產(chǎn)生之間的關系，我們設計基因?；?表4)檢測了W0和Ghlmm的SA信號通路基因表達特征。發(fā)現(xiàn)EDS1、PAD4、PAL在Ghlmm中表達量顯著升高，并且這些基因受到ROS的誘導，說明ROS可以誘導SA的合成。過氧化氫酶CAT是SA的結合蛋白，SA可以抑制CAT的酶活，導致過氧化氫含量的升高。在Ghlmm中CAT酶活顯著下降。在突變體中ROS和SA形成了一個循環(huán)放大的效應。AIP可以抑制PAL的活性，抑制SA的合成。為了進一步研究突變體中ROS和SA的關系，我們用2-氨基茚滿-2磷酸(AIP)噴施W0和Ghlmm。噴施1mM的AIP之后，W0和Ghlmm的SA含量顯著下降，Ghlmm突變體葉片細胞死亡表型消失，并且與噴施前相比，ROS含量顯著下降(圖10)。同時我們檢測了AIP處理后PR基因的表達，發(fā)現(xiàn)PR基因表達也顯著下降(圖11)。由于PR基因受到SA誘導高表達(圖12)，研究表明Ghlmm中PR基因的表達是由于SA信號通路的激活引起的，且ROS與SA之間的循環(huán)放大效應導致細胞死亡和抗病基因的表達。表4：擴增所用引物(5)GhLMM基因在調控植物生長和抗病之間的劑量效應研究Ghlmm突變體葉片細胞死亡表型和抗病性的增加是由于受體W0的GhLMMD基因突變所導致。GhLMMA不能補償GhLMMD基因功能的喪失，說明二者之間的表型差異和抗病性差異是由于GhLMM基因的拷貝數(shù)不同，因此，GhLMM的功能特征具有劑量效應。為了研究GhLMM的劑量效應，我們設計了2個實驗。一、外施不同濃度LA抑制ALAD酶活，模擬不同程度的GhLMM表達抑制。在W0生長到兩葉一心時期，采用體外噴施的方法，噴施0、1、5、10、20、30mM的LA。我們發(fā)現(xiàn)噴施24小時后，20mM和30mM葉片表現(xiàn)出Ghlmm突變體表型，即葉片局部細胞褐化死亡，形成壞死斑。而10mM具有不明顯的細胞死亡現(xiàn)象。0、1、5mMLA噴施后，棉花葉片不形成壞死斑。通過對ALA、過氧化氫、SA含量的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著LA噴施濃度的增加，ALA、過氧化氫、SA的含量也隨著增加。并且PR基因的表達也隨著LA濃度的增加，表達量升高(圖13)。二、利用遺傳學方法，創(chuàng)制不同拷貝GhLMM基因的材料，調查其生長表型和抗病性。用四個GhLMM基因拷貝的W0(AtAtDtDt)和兩個GhLMM基因拷貝的Ghlmm(AtAtdtdt)，雜交產(chǎn)生三個GhLMM拷貝的(W0×Ghlmm)F1(AtAtDtdt)。對三個材料的黃萎病抗性進行了鑒定。結果顯示，(W0×Ghlmm)F1的黃萎病抗性處于W0和Ghlmm之間，接病28天之后其病級達60％，而W0病級超過95％，Ghlmm約為40％。接病28天后的劈桿實驗和病菌培養(yǎng)實驗同樣驗證了這一結果(圖14)。棉花生長到2葉一心時期，檢測三個材料中GhLMM基因的表達，(W0×Ghlmm)F1基因GhLMMD的表達處于三個材料中間。而GhLMMA的表達并沒有顯著差異。ALAD酶活檢測同樣得到了類似結果。隨著拷貝數(shù)的減少，ALA積累增多，PBG含量減少。過氧化氫的含量和SA含量也隨著GhLMM的拷貝數(shù)的減少而增多。(W0×Ghlmm)F1葉片中PR基因的表達也顯著高于W0，低于Ghlmm，處于中間水平，這與其抗病表現(xiàn)一致(圖15)。通過外施LA模擬實驗和不同拷貝GhLMM基因材料的生長和抗病性鑒定，表明GhLMM在調控植物生長和植物免疫中具有劑量效應。(6)Ghlmm突變體在棉花抗病育種上的應用陸地棉黃萎病抗性育種是困擾棉花育種家的一大難題，主要是因為陸地棉缺少黃萎病抗源。陸地棉突變體Ghlmm具有顯著升高的黃萎病抗性，并且其纖維品質和種子產(chǎn)量基本不受影響。與親本W(wǎng)0雜交產(chǎn)生的(W0×Ghlmm)F1也表現(xiàn)出了黃萎病抗病性的顯著提高。所以我們設想利用Ghlmm突變體進行雜交育種，改善已有的黃萎病抗性差的陸地棉品種。我們選擇了兩個感病品種：陸地棉標準系TM-1和軍棉1號，分別與Ghlmm進行雜交產(chǎn)生F1代，檢測其黃萎病抗性。通過鑒定發(fā)現(xiàn)，與感病親本相比，(TM-1×Ghlmm)F1、(軍棉1號×Ghlmm)F1都表現(xiàn)出了顯著提高的黃萎病抗性(圖17)。因此，Ghlmm突變體可有效用于黃萎病抗性育種。另外，以此基因為靶基因，通過反義RNA技術等基因工程方法，在一定范圍內下調GhLMM基因的表達，實現(xiàn)精確調控棉花生長和抗病之間的平衡，培育抗性顯著提高的新種質并在生產(chǎn)上應用。SEQUENCELISTING<110>南京農(nóng)業(yè)大學<120>能顯著提高棉花抗病性的GhLMM基因及其應用<130>2017<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>4642<212>DNA<213>陸地棉<221>GhLMM在陸地棉遺傳標準系TM-1的基因組A亞組中核苷酸序列<400>1tttcattgtgtacccatttcttgttttagctgatttgtgctgttattttagttagaattt60catcttttacgattgcagagatcgtgagaattttgtgtcatggcttccacaattgtaaat120gctccctgcacggttccttctgttaaaggttttgagactcaaaactacgttggtcttaga180ccaatttctagtttaaggttcaattctggtaggacttcaacctcaggacgttctcggggc240ctttttgtggtgagggcatgcgaaaggcatgatggacatgtgaaaaagattgaaatgagt300attgaagaatgtgaggctgctgttgtagctgggaatgcgcctgaagctcctccagttccc360cctaagccagctgctcctgttgggactcctgtgattaaaccttatgtgagtgtttgaaat420gaaatgataatattttatcttttgcccatattttacggtgcttgcttatttatgttcata480tgcaaatagggggtaatgtgataggaatttgtgacaaattgattgtgtttgagtggtttt540agaatgtctccgataagtgtttggtctattgaatggtgatttgttttagacttttatatg600tgtttgaaaattcacattcacaggtttaattttcttgttcgctgacatgaatttgattta660atcattaattgtttgttcatctcatctcatcaattcatgacattgaagtaaaatagtttt720aagttataatagaggttttgaggtcaattggtggacctctcctttctcctttgctcactc780ggtgtttgtttgtattagcaacttaccaggcgtcctcgtcgtaaccgtaagtcccctgca840ttgagagcatcattccaggaaacaagtatatctcctgcaaattttgtatatcctcttttt900attcatgaaggttggtattcatggatcttagtcctttctttttggtgaaataagttagat960attaaaagtggagcaattttaccaaagatcatgataagcgccctcaaatttgttacatga1020atattatattgttgcagttttcttttcttttccttttttgttgcgacttttgtgatactt1080ttctgtttactctctttcttaccttccagtacgtgcttacatctacttggtactgttccc1140ttgacctgcaggtcaggaggacacacccattggagctatgccaggatgttataggcttgg1200atggagacatggacttgttgaagaggtgatcttttgtattatgcatcctttttcataaac1260aatttgcatttgtccctcaaaactagttcccgggtgctgtatgtgttgttttaatgactt1320atctattttatgtaactgtatgatgataaacattctatttgatatcaaagttataaacat1380atacaagcatgttatatacttatttagtgtgtcaactgtgaagttgttttgaagtgtgca1440ttatctattgcaggtggcaaaggcctgggatgttggagttaatagtattgtgctcttccc1500caaagttccagatgctctgaaggttttgatctcccgctataatgctatttgcttcatatg1560ttgatgtatataattggttttttgcactttagtctcccacaggagatgaagcctacaatg1620acaatggtttagtgcctcgaacaattcgtctgcttaaggacaagttccctgaccttgtaa1680gtcaatgaagttcattcattgatttttatattgtttagtgcctccagccttatgaaatca1740tggtgatatcttatcggttttttaggttatctatacggatgttgctttagatccatactc1800ctcagatgggcatgatggtattgtcagagaagatggtaagacaagatatgcttcacacac1860ttttgcccgctaaaagaagagtatcttatttagaagacatgttttcaccttgttgaactg1920ttttttggtttgccacattgaaatacaagttaacttagaagaatgatacatgagctcttt1980cctaaaaaatgtcgtgtgcatactaattggtcaaaataaataatgttcttataaagtcat2040agaaatactaattgcttctttgtttttttaccctgtaggagtcataatgaatgatgagac2100agtgcatcaattatgtaagcaagcggtgtcccaggtaatttttgtagtttttttttttta2160aatatactcttaggcagaagtttactgtcttcataagagttctaaatgccataatggtga2220tgacttactgatgtttgttgtggtcactggtgtctcataaaaaaaaatcagtgaccttgt2280tcgcttttgttaaattcttctctcccctccccttgcttgtcttgatacatatccatggca2340taacttttaataaatactttgaggaactagtgtttcaaatgcttaaagcaagcaaaaact2400tgctgttacagctttaaatggctagtcagtgtgatgcttggagttttctaatcatttgaa2460tggatattggaggtctcctatgctcgtttgtgtcctattcttttttttgctagatttaac2520ttgattggacatgttttaatttttttgggtggtgtattcttaaaggctcgagctggagct2580gatgttattagtcccagtgatatgatggatggacgtgttggagctattcgtgctgccctt2640gattctgaaggctttcaccatgtttctatcatgtcctatacagcaaagtaatttcactat2700ctgcccccttgcattcctatagttgtttgtttgtaggtctaccagtttctaaaagtaggt2760ttgaagcatggtaacagatatatgattatgttaaaccaccgcaaaggttttactttcttt2820tcacttcctgaagaacttttgagaaagattattaagaagtcatgaagagttcaaagagaa2880attgagatgaaaacttcttactaatctgaattttacagccttattttccagctttatata2940cagaaaaaaatttaactataataagaaagaaaattttactattaaaactaaaatctctcc3000tatgaataaagaataaaatagctgtacctagtccactaattttgcagtattccgtccttc3060aaattagtctatcaaatcccttttcgcctatcaaatcttgagaatcttggaataagagtc3120ccaggtttccacacttgcccactatgcaagtagaatggtattattcagttgccttgctcg3180aaggcaatagtctttcttcatgttgttgtctaattgcataagacattatcatttttctta3240tcagttggtcactgaacactttagaaaaataaactatgttgacagaagttattctgagtt3300attcttggcggctgggtgaaatttattgacacagtttgtcattctctttttcttgggata3360acagatatgcaagttcattttatggccccttccgagaagcactggactctaacccacgct3420ttggagataaaaaaacgtatgaattcacttgcctgtactgtattttttgggctttcatgc3480gctctttttggtgcttacatttgattgttaatcttgtttgttaaaaacaggtatcagatg3540aacccagcaaattacagagaagcattagttgaggctcatgaagatgaggctgaaggtgct3600gacattctattggtcagtatgacgcttttaaggaattttgagttgtttttgttaatggct3660aagctcccatcatgctgaagtctctctaactggatcacaggtcaagcctggtctccctta3720tttggatatcattagacttctcagggatcaatctcctttgcctattgctgcctaccaggt3780attctcttaactttccgtgtcctgcattaactaatattcttggcattgttttcattgcaa3840cttgaaacctttcgataataattccccatggtccctggaaatgaaaatgaaaatgaaaat3900ttgaggcaacattcatatatattagtaattgttttgtcagttccagcactaggtccttag3960attcccccttttggaattgatgcccttagcaaaactattcttgacacgaaattatttata4020ttacatttttgttctttttagcgaaatcaggggattggtatttttaactacattgtctga4080ttcattcttgtagagtgtagttcattcttaataggc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