本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及高催化效率的纖維素酶突變體及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

纖維素酶是將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖的一組復(fù)雜酶系的總稱，又稱纖維素酶系,根據(jù)其中各酶功能的差異，主要被分為3大類：內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。纖維素酶已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開(kāi)采、精細(xì)化工及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

不同的微生物產(chǎn)生的纖維素酶，其結(jié)構(gòu)和功能差異較大，自然界中存在的纖維素資源來(lái)源復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)和功能差異較大，不同來(lái)源的纖維素酶對(duì)它們的降解效果也不盡相同，針對(duì)不同來(lái)源的纖維素尋找降解效果較高的纖維素酶，是當(dāng)前纖維素酶領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。雖然許多纖維素酶被克隆分離及性質(zhì)測(cè)定，但這些酶的性質(zhì)特征，均存在一些缺陷，例如，ph作用范圍不合適，熱穩(wěn)定性差，表達(dá)量低等，均不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。因此人們希望能夠找到新的能夠滿足實(shí)際應(yīng)用需求的纖維素酶，從而能夠進(jìn)一步推廣纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用。

高比活、高催化效率的纖維素酶工程菌株的獲得主要通過(guò)誘變、篩選和酶分子改良獲得。誘變分為自然突變和人工誘變，自然突變成功的幾率非常小，人工誘變的工作量較大且有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質(zhì)難以控制。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種高催化效率纖維素酶突變體，將來(lái)源于gloeophyllumtrabeumcbs900.73五家族的低催化效率纖維素酶gtcel5第233位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述維素酶突變體基因的重組載體。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述維素酶突變體基因的重組菌株。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述纖維素酶突變體的氨基酸序列為氨基酸序列如seqidno.1所示的纖維素酶gtcel5的第233位天冬酰胺突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼?/p>

野生型低催化效率的纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

高催化效率的纖維素酶突變體的氨基酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

所述野生型低催化效率纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

所述高催化效率纖維素酶突變體的氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述高催化效率纖維素酶突變體的氨基酸序列如seqidno.3所示。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，制備所述高催化效率纖維素酶突變體的方法包括以下步驟：

1)采用over-lappcr的方法擴(kuò)增高催化效率纖維素酶酶突變體序列片段；

2)將催化效率纖維素酶突變體序列片段克隆到表達(dá)載體ppic9r上，重組載體命名ppic9r-gtcel5-n233a,ppic9r-gtcel5-n233g；

3)將突變體重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得突變株，優(yōu)選為gs115/gtcel5-n233a,gs115/gtcel5-n233g；

本發(fā)明提供的纖維素酶突變體催化效率高，在此改造條件下，兩種突變體比活力達(dá)到野生型的比活力125％-172％；催化效率達(dá)到野生型的催化效率133％-141％；酶促反應(yīng)最適ph值不變。相對(duì)于盲目篩菌或人工(自然)誘變等手段，酶分子改良縮短了酶學(xué)性質(zhì)改造時(shí)間。使該高催化效率纖維素酶突變體具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶突變體基因的重組載體，優(yōu)選為ppic9r-gtcel5-n233a,ppic9r-gtcel5-n233g。將本發(fā)明的纖維素酶突變體基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將纖維素酶基因插入到質(zhì)粒ppic9r上的ecori和noti限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒ppic9r-gtcel5-n233a,ppic9r-gtcel5-n233g。

本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株gs115/gtcel5-n233a,gs115/gtcel5-n233g。

本發(fā)明還提供了一種制備高催化效率纖維素酶突變體的方法，包括以下步驟：

1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組纖維素酶的表達(dá)；

3)回收并純化所表達(dá)的高催化效率纖維素酶。

其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞gs115，得到重組菌株gs115/gtcel5-n233a,gs115/gtcel5-n233g。

本發(fā)明還提供了上述高催化效率纖維素酶突變體的應(yīng)用。運(yùn)用基因工程手段來(lái)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶。

本發(fā)明提供了兩個(gè)新的高催化效率纖維素酶基因，可作應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶。

附圖說(shuō)明

圖1顯示在畢赤酵母中表達(dá)的重組野生型和突變體纖維素酶的sds-page分析，其中，(a)：在畢赤酵母中表達(dá)的重組野生型纖維素酶的sds-page分析，其中，m:低分子量蛋白質(zhì)marker；1:野生型gtcel5原酶液；2：野生型gtcel5純化后酶液；3：野生型gtcel5endoh脫糖基處理后酶液；(b)：在畢赤酵母中表達(dá)的重組高催化效率纖維素酶突變體的sds-page分析，m:低分子量蛋白質(zhì)marker；1:突變體gtcel5-n233a純化后酶液；2：突變體gtcel5-n233g純化后酶液；

圖2顯示野生型纖維素酶和突變體的酶學(xué)性質(zhì)；a:最適ph；b:ph穩(wěn)定性；c:最適溫度；d:溫度穩(wěn)定性；

圖3顯示野生型纖維素酶和高催化效率纖維素酶突變體的比活。

具體實(shí)施方式

試驗(yàn)材料和試劑

1、菌株及載體：表達(dá)宿主pichiapastorisgs115，表達(dá)質(zhì)粒載體ppic9r為本實(shí)驗(yàn)室保存。

2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購(gòu)自fermentas公司，連接酶購(gòu)自invitrogen公司，羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，大麥葡聚糖(barleyβ-glucan)購(gòu)自sigma公，地衣多糖(lichenan)購(gòu)自megazyme公司，其它都為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到)。

3、培養(yǎng)基：

(1)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：30g/l麥麩，30g/l玉米芯粉，30g/l豆粕，5g/l大麥葡聚糖，5g/l(nh4)so4，1g/lkh2po4，0.5g/lmgso4·7h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，0.2g/lcacl2于1l去離子水中，121℃，15磅條件下滅菌處理20min

(2)大腸桿菌培養(yǎng)基lb(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126naci，ph7.o)。

(3)ypd培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖

(4)md固體培養(yǎng)基：2％葡萄糖，1.5％瓊脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin

(5)bmgy培養(yǎng)基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。

(6)bmmy培養(yǎng)基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均與bmgy相同，ph4.0。

實(shí)施例1高催化效率纖維素酶突變體編碼基因gtcel5-n233a,gtcel5-n233g的克隆

以ppic9r-gtcel5質(zhì)粒為模板，采用over-lappcr的方法擴(kuò)增高催化效率纖維素酶突變體編碼基因gtcel5-n233a和gtcel5-n233g。

表1.高催化效率纖維素酶突變體gtcel5-n233a和gtcel5-n233g所用特異性引物

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實(shí)施例2高催化效率纖維素酶突變體的制備。

將表達(dá)載體ppic9r進(jìn)行雙酶切(ecori+noti)，同時(shí)將編碼高催化效率纖維素酶突變體的基因gtcel5-n233a，gtcel5-n233g雙酶切(ecori+noti)，切好的編碼成熟高催化效率纖維素酶突變體的基因片段(去除信號(hào)肽片段)與表達(dá)載體ppic9r連接，獲得含有高催化效率纖維素酶突變體基因的重組質(zhì)粒ppic9r-gtcel5-n233a,ppic9r-gtcel5-n233g并轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115，獲得重組酵母菌株gs115/gtcel5-n233a,gs115/gtcel5-n233g。

取含有重組質(zhì)粒的gs115菌株，接種于300mlbmgy培養(yǎng)基的1l三角瓶中，置于30℃，220rpm搖床培養(yǎng)48h；后將培養(yǎng)液3000g離心5min，棄上清，沉淀用100ml含有0.5％甲醇的bmmy培養(yǎng)基重懸，并再次置于30℃，220rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔12h補(bǔ)加0.5ml甲醇，使菌液中的甲醇濃度保持在0.5％，同時(shí)取上清用于酶活性檢測(cè)。

sds-page結(jié)果(圖1)表明，重組纖維素酶在畢赤酵母中得到了表達(dá)。所表達(dá)的纖維素酶經(jīng)過(guò)純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白的95％以上。重組高催化效率纖維素酶突變體最適ph為4.0，與野生型的一致，最適溫度為60℃，較野生型降低了10℃，但是比活力達(dá)到野生型提高125％-172％倍；催化效率達(dá)到野生型133％-141％。

實(shí)施例3重組高催化效率纖維素酶突變體和母本野生型的活性分析

一、dns法：具體方法如下：在給定的ph、溫度條件下，1ml的反應(yīng)體系包括100μl適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?00μl底物，反應(yīng)10min，加入1.5mldns終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測(cè)定od值。纖維素酶活性單位定義：在一定條件下，每分鐘分解羧甲基纖維素生成lμmol還原糖所需的酶量為1個(gè)活性單位(u)。

二、重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型的性質(zhì)測(cè)定

1、重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型的最適ph測(cè)定方法如下:

將實(shí)施例2純化的重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型在不同的ph下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適ph。底物cmc-na用不同ph的0.1mol/l檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中70℃下進(jìn)行纖維素酶酶活力測(cè)定。結(jié)果(圖2，a)表明，重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型的最適反應(yīng)ph一致，均為ph4.0,符合不改變最適ph值提高催化效率的目的。

將酶液在不同ph值的緩沖液中于37℃下處理60min，再測(cè)定酶活性以研究酶的ph穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖2，b)，在ph3.0-ph12.0之間，突變體和野生型均能夠維持50％以上的酶活力。gtcel5-n233g在ph2.0下的相對(duì)酶活剩余80％以上高于野生型，說(shuō)明具有相對(duì)優(yōu)良的ph穩(wěn)定性。

2、重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型的最適溫度測(cè)定方法如下:

重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型的最適溫度的測(cè)定為在0.1mol/l檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(ph4.0)緩沖液體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖2，c)表明,重組高催化效率纖維素酶突變體(60℃)較野生型(70℃)的最適溫度降低了10℃。

耐溫性測(cè)定為纖維素酶在60℃和70℃下處理不同時(shí)間，再在最適溫度下進(jìn)行酶活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明：重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型在60℃下處理60min，均剩余酶活在90％以上。在70℃下處理10min,gtcel5-n233a的熱穩(wěn)定性降低。(圖2，d)。

3、重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型比活測(cè)定方法如下：

選取不同的底物1％cmc-na、1％barleyβ-glucan、作為底物，在最適條件下反應(yīng)10min,進(jìn)行纖維素酶酶活力測(cè)定。重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型比活力如圖3所示。重組高催化效率纖維素酶突變體比活力達(dá)到野生型125％-172％。

4、重組高催化效率纖維素酶突變體和野生型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定方法如下:

測(cè)定反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)時(shí)間，確定測(cè)定km及vmax的反應(yīng)時(shí)間為5min。用不同濃度的cmc-na(1–10mgml^–1)為底物，在最適條件(溫度、ph)下測(cè)定酶活性，計(jì)算出相應(yīng)的反應(yīng)速度，利用grafit7軟件計(jì)算km值及vmax。以cmc-na為底物時(shí)，重組高催化效率纖維素酶突變體和母本野生型在最適條件下的km、vmax、kcat、kcat/km值分別如表2所示。重組高催化效率纖維素酶突變體的催化效率達(dá)到野生型133％-142％。

表2以cmc-na為底物時(shí)，重組高催化效率維素酶突變體和野生型動(dòng)力學(xué)參數(shù)

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所

<120>高催化效率的纖維素酶突變體及其基因和應(yīng)用

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<213>gloeophyllumtrabeum

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