本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種半纖維素酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在植物體的生命過程中，細(xì)胞的分離擔(dān)任著非常重要的角色：從種子萌發(fā)，到塑造植物體的形態(tài)，從花藥開裂傳播花粉，到果實(shí)開裂種子散發(fā)，都跟細(xì)胞在微觀和宏觀程度上“分離”密切相關(guān)。許多種類的果實(shí)(例如：角果、蒴果、蓇葖果、莢果等)在其發(fā)育的后期階段，都會發(fā)生特殊類型的細(xì)胞的分化以及一系列與其緊密相關(guān)的分子和生化事件，最終使得成熟的果實(shí)開裂，并釋放出種子，從而有利于擴(kuò)大后代植株的生長范圍，為繁榮種族以及提高植物的適應(yīng)性提供了條件和保證。
果實(shí)的開裂伴隨著種子的傳播，是植物完成生命的延續(xù)和種族的繁衍的重要途徑。然而，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，農(nóng)作物因氣候變化而導(dǎo)致果莢過早開裂往往直接影響作物的收成，造成大量浪費(fèi)。例如油料作物歐洲油菜的年產(chǎn)量，由于果實(shí)開裂而造成的損失平均每年可達(dá)20％，在不利的天氣條件下?lián)p失可達(dá)50％(childr.d.etal.,1998,ethylenebiosynthesisinoilseedrapepodsinrelationtopodshatter.journalofexperimentalbotany49:829–838)。同時(shí)，果實(shí)開裂也會限制油料作物種子的進(jìn)一步發(fā)育，影響種子的含油量(jenkinse.etal.,1999,dehiscence-relatedexpressionofanarabidopsisthalianageneencodingapolygalacturonaseintransgenicplantsofbrassicanapus.plant,cellandenvironment22:159-167.)。另外，因果實(shí)開裂而散發(fā)的種子還會對其他農(nóng)作物和環(huán)境造成污染(spencej.etal.,1996,‘podshatter’inarabidopsisthaliana,brassicanapusandb.juncea.journalofmicroscope181:195-203)。由此可見，研究果實(shí)開裂對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著直接而深遠(yuǎn)的影響。
擬南芥是植物學(xué)研究常用的模式植物，與傳統(tǒng)油料作物油菜等同科，其果莢發(fā)育與開裂與傳統(tǒng)油料作物具有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。與傳統(tǒng)油料作物相比具有生長周期短(2個(gè)月可以完成一次生命周期)，基因已全部測序完畢(基因序列清楚)，各種相關(guān)研究資料非常豐富等優(yōu)勢，很多油料作物品種的改良的方法和思路都來源于擬南芥的相關(guān)研究。如調(diào)控?cái)M南芥果莢開裂的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子fruitful(ful)，有研究表明，通過用35s啟動子替換編碼該轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動子，使該基因異位表達(dá)可導(dǎo)致擬南芥的果莢成熟后不開裂(ferrándizc.etal.,2000,redundantregulationofmeristemidentityandplantarchitecturebyfruitfull,apetala1,andcauliflower.development127:725-734)。而后期在歐洲油菜的研究中，科學(xué)家通過同源比對的方法獲得了歐洲油菜的ful同源基因，并通過相同的方法使該基因異位表達(dá)，從而篩選出歐洲油菜果實(shí)不開裂品系(qstergaardl.etal.,2005,podshatter-resistantbrassicafruitproducedbyectopicexpressionofthefruitfullgene.plantbiotechnologyjournal4:45-51)。由此可見研究擬南芥的果莢開裂的機(jī)理，可為其他植物(特別是油料作物)研究提供有力指導(dǎo)和強(qiáng)大的理論依據(jù)。
纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶是降解細(xì)胞壁的主要的三種酶(pattersons.,2001,cuttingloose,abscissionanddehiscenceinarabidopsis.plantphysiology126:494-500；robertsj.a.etal.,2000,cellseparationprocessesinplants:models,mechanismsandmanipulation.annalsofbotany86:223-235)。而植物器官的脫落和分離的過程往往伴隨著開裂區(qū)細(xì)胞的細(xì)胞壁降解。有研究表明在果莢成熟衰老過程中往往伴隨著在開裂區(qū)細(xì)胞的纖維素酶活性的增強(qiáng)且有十分明顯的特異性(meakinandroberts，1990,dehiscenceoffruitinoilseedrape(brassicanapusl.).i.anatomyofpoddehiscence.journalofexperimentalbotany41:1003-1011)；果膠酶伴隨的果莢成熟衰老的活性變化雖然不大且無特異性，但是突變編碼果膠酶的基因(adpg1和adpg2)卻導(dǎo)致果莢無法開裂(ogawam.etal.,2009,rabidopsisdehiscencezonepolygalacturonase1(adpg1),adpg2,andquartet2arepolygalacturonasesrequiredforcellseparationduringreproductivedevelopmentinarabidopsis.plantcell21:216-233)。然而參與果莢開裂的纖維素酶基因和半纖維素酶基因仍然未知，鑒定出擬南芥果莢開裂相關(guān)的纖維素酶和半纖維素酶將豐富對果莢開裂過程中細(xì)胞壁降解過程的理解，并有機(jī)會發(fā)現(xiàn)新的影響果實(shí)開裂的基因和表型，進(jìn)而對油菜新品種的選育提供新的研究方向和思路，從而增加油菜的產(chǎn)量。與通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子來獲得不開裂的油菜品系相比，通過調(diào)控下游酶類所獲得不開裂品系更有具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子是通過調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)來影響整個(gè)果莢開裂區(qū)的形成，因而調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子所產(chǎn)生的品系一般都會導(dǎo)致果實(shí)完全不裂，在生產(chǎn)上反而會因?yàn)樵黾庸ぷ髁慷黾映杀?，與開裂帶來的減產(chǎn)所造成的損失相比得不償失。而調(diào)控下游細(xì)胞壁水解酶所產(chǎn)生的品系只會影響一個(gè)基因表達(dá)情況，并不會對整個(gè)果莢開裂區(qū)形成造成巨大的影響，因此一般只會導(dǎo)致果實(shí)開裂的推遲和開裂率降低，并不會導(dǎo)致果實(shí)完全不裂。這樣既可以減少開裂造成的損失，又不會增加生產(chǎn)的成本，因此更具有現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義和前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種半纖維素酶，該半纖維素酶對植物角果開裂具有調(diào)控作用。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述半纖維素酶的編碼基因。
本發(fā)明的又一目的在于提供所述半纖維素酶的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種半纖維素酶，名稱為man7，來源于擬南芥(arabidopsisthaliana)，其氨基酸殘基序列為(a)或(b)所示：
(a)如seqidno：1所示的氨基酸殘基序列；
(b)對如seqidno：1所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過1個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物角果開裂具有調(diào)控作用的氨基酸序列。
其中，序列表中的seqidno:1由431個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量為51kda。
上述(a)和(b)中的半纖維素酶可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到；(b)中man7的編碼基因可通過將序列seqidno:1中的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變得到。
所述的半纖維素酶的編碼基因，其核苷酸序列為(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)如seqidno：2所示的多核苷酸；
(b)編碼如seqidno：1所示的氨基酸的多核苷酸；
(c)與seqidno：2所示的核苷酸序列具有80％以上的同源性且對植物角果開裂具有調(diào)控作用的核苷酸序列；
(d)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與seqidno：2限定的dna序列雜交的核苷酸序列。
其中，序列表中的seqidno：2由2642個(gè)堿基組成。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組微生物、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述重組載體為將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體pcambia1305.1的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。
所述的重組微生物為將所述重組載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌得到的重組微生物。
所述的半纖維素酶在調(diào)控植物角果開裂基因中的應(yīng)用。
所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物，優(yōu)選為擬南芥或油菜品種。
所述的植物也可以是不開裂的角果品系。
所述的半纖維素酶在調(diào)控植物角果開裂基因中的應(yīng)用，是根據(jù)所述的半纖維素酶的基因序列，使用rna干擾(rnaintrference，rnai)、反義rna(anti-senserna)、過表達(dá)負(fù)顯性(dominantnegative，dn)、crispr/cas9基因編輯技術(shù)使正常植物中半纖維素酶編碼基因man7的同源基因的功能喪失或表達(dá)量下降，從而實(shí)現(xiàn)推遲植物角果開裂和降低植物角果開裂率。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
1、(1)本發(fā)明通過現(xiàn)有反向遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)，分析目前數(shù)據(jù)庫所含半纖維素酶基因的相關(guān)信息數(shù)據(jù)，闡明了半纖維素酶基因參與調(diào)控角果發(fā)育和開裂的機(jī)理，并加以qpcr測定擬南芥角果不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化，獲的具體參與角果發(fā)育和開裂過程的半纖維素酶編碼基因man7；(2)本發(fā)明通過突變株角果開裂區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析和相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析驗(yàn)證了該基因的功能，提供的半纖維素酶基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值，是根據(jù)所述基因序列信息利用rna干擾(rnai)、反義(rnaanti-sencserna)、過表達(dá)負(fù)顯性(dominantnegative,dn)或crispr/cas9基因編輯技術(shù)使正常植物中半纖維素酶編碼基因man7的同源基因的功能喪失或表達(dá)量下降，從而實(shí)現(xiàn)推遲植物角果開裂和降低植物角果開裂率的方法。
2、本發(fā)明的基因被突變或被抑制表達(dá)后可顯著推遲角果的開裂時(shí)間，同時(shí)降低植物角果的開裂率，從而減少由于環(huán)境因素導(dǎo)致相關(guān)作物角果提前開裂導(dǎo)致種子減產(chǎn)和造成土地污染的損失，進(jìn)而保證作物種子的高產(chǎn)出，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
附圖說明
圖1是實(shí)施例2中的溶解曲線圖，其中，圖a表示溶解峰，圖b表示溶解曲線。
圖2是實(shí)施例2中半纖維素酶基因man7在不同發(fā)育時(shí)期的果莢的定量pcr表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，其中，6d、8d、10d、12d表示開花后的天數(shù)；18a表示半黃果莢；18b表示全黃的果莢。
圖3是實(shí)施例3中半纖維素酶基因man7的基因示意圖以及里面兩種半纖維素酶突變株的材料的插入位點(diǎn)的確立的電泳結(jié)果圖；其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突變型。
圖4是實(shí)施例4中半纖維素酶基因man7的突變株man7-1和man7-3純合子材料的t-dna插入突變位點(diǎn)示意圖。
圖5是實(shí)施例5中半纖維素酶基因man7的突變株man7-1和man7-3純合子材料的成熟果莢中man7基因的表達(dá)與野生型的對比結(jié)果圖，其中，col-0表示野生型。
圖6是實(shí)施例6中野生型和半纖維素酶man7突變株果莢從開花到變黃所需天數(shù)的統(tǒng)計(jì)比較圖，其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突變型。
圖7是實(shí)施例7中野生型和半纖維素酶突變株開裂率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突變型，18期表示擬南芥黃果莢，19期表示果實(shí)發(fā)育至剛變褐的果莢。
圖8是實(shí)施例8中半纖維素酶突變株man7-1和man7-3純合子材料在果莢半黃、全黃黃、開裂等階段的結(jié)構(gòu)變化圖，其中，col-0表示野生型，man7-1和man7-3表示突變型；18a表示半黃果莢；18b表示全黃的果莢；19a表示干褐的果莢。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1纖維素酶man7基因的克隆：
擬南芥半纖維素酶的基因全長dna序列的獲得，包括以下步驟：
1.在tair數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)中以cellulase(纖維素酶)作為關(guān)鍵字進(jìn)行搜索，并將搜索所得基因的cdna序列分別在tair數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對，取比對結(jié)果中e-value小于0.01的所有的基因作為候選基因(共39個(gè))。
2.將所得的候選基因分別在tair數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)芯片(microarrayexpression)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，將有在花發(fā)育15期心皮表達(dá)的基因保留，其余的剔除(剩下22個(gè))。
3.將剩下的候選基因輸入atted-ii數(shù)據(jù)庫(http://atted.jp)中進(jìn)行相關(guān)共表達(dá)基因查詢。在查詢所得的300個(gè)相關(guān)基因中尋找跟果莢發(fā)育與開裂相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(如shp1，shp2，alc等)，能與果莢發(fā)育與開裂相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有共表達(dá)結(jié)果的候選基因留下，其余的剔除(剩余6個(gè))。
4.以不開裂的轉(zhuǎn)錄因子突變株(果莢不開裂轉(zhuǎn)錄因子突變體ind-7)和wt(野生型col-0)為材料，進(jìn)行定量pcr檢測剩余的候選基因是否在兩種材料中出現(xiàn)差異，其中wt中表達(dá)量比不開裂突變株高的保留，其余的剔除(剩余兩個(gè))。其中，果莢不開裂轉(zhuǎn)錄因子突變體ind-7通過如下方法獲得：
根據(jù)文獻(xiàn)(liljegren,s.j.,roeder,a.h.,kempin,s.a.,gremski,k.,
ind鑒定上游引物：5’-cacccatacaatcttggatcg-3’；
ind鑒定下游引物：5’-tgttctggttgggttcaaaag-3’；
salk_058083插入引物：5’-tggttcacgtagtgggccatcg-3’；
pcr反應(yīng)體系如下：
pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>
利用上述pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，以提取的擬南芥的dna(ctab法)為模板，使用ind鑒定上游引物和ind鑒定下游引物可在野生型(col-0)的擬南芥dna中擴(kuò)增出一條1198bp的條帶，而在ind-7純合子突變體中均無法擴(kuò)增出對應(yīng)條帶。而使用salk_058083插入引物和ind鑒定下游引物，可以在ind-7純合子突變體中擴(kuò)增出長度分別為756bp的條帶，而無法再野生型的擬南芥的dna中得到對應(yīng)條帶。從而說明我們通過pcr鑒定，獲得了兩種不同的t-dna插入位點(diǎn)的ind失活純合子突變體，命名為ind7(salk_058083)。
5.根據(jù)這個(gè)數(shù)據(jù)庫中這個(gè)基因的相關(guān)資料，在該基因序列的5’和3’末端序列設(shè)計(jì)一對引物，引物序列如下：
man7克隆上游引物：
5’-ggactcttgaccatggacaacaaacaacgagaaaaatc-3’；
man7克隆下游引物：
5’-atttaccctcagatctaccatccaagacctacccacataa-3’；
提取擬南芥的dna(ctab法)，在man7克隆上游引物和man7克隆下游引物的引導(dǎo)下，以擬南芥的總dna為模板，pcr擴(kuò)增擬南芥纖維素酶基因全長dna序列，50μlpcr反應(yīng)體系為：總dna模板2μl，premixtaq(extaqversion2.0，takara公司)25μl，man7克隆上游引物(2mm)5μl，man7克隆下游引物(2mm)5μl，水13μl。pcr的反應(yīng)條件為：先94℃變性2分鐘；然后94℃變性30秒，58℃復(fù)性1分鐘，72攝氏度延伸3分鐘，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化長度為2700bp的擴(kuò)增片段，使用clotech的infusion-clone技術(shù)將其克隆到pcambia1305.1載體中，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，使用m13引物對(m13上游引物：5’-gagcggataacaatttcacacagg-3’；m13下游引物：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’)其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明擬南芥纖維素酶man7基因全長具有序列表中seqidno：2的核苷酸序列，由2642個(gè)堿基組成，通過序列比對，與擬南芥纖維素酶家族成員之間的同源率在80％以上，同時(shí)與半纖維素酶man家族相似度高于90％，命名為半纖維素酶man7(簡稱：man7)；其編碼區(qū)域?yàn)?00-529，872-1066，1155-1277,1389-1591,1682-2126這五個(gè)區(qū)域，編碼具有序列表中seqidno.1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其編碼蛋白命名為半纖維素酶man7(簡稱：man7)，其分子量為51kda。
實(shí)施例2：半纖維素酶man7在果莢發(fā)育中的表達(dá)情況變化
在野生型擬南芥材料(col-0)開花時(shí)在花柄上用不同顏色的繩子做記號，記錄對應(yīng)的開花時(shí)的時(shí)間，然后根據(jù)開花后的天數(shù)(6d、8d、10d、12d)以及果莢的顏色變化(18a：半黃果莢；18b：全黃的果莢)進(jìn)行取材，將所得的材料作為樣品使用qiagen公司的
man7定量pcr上游引物：5’-atcgccaataaccgcattcc-3’；
man7定量pcr下游引物：5’-gggattgctcgcttgagtct-3’；
內(nèi)參actin8上游引物：5’-taaggtcgtggcaccacccg-3’；
內(nèi)參actin8下游引物：5’-atccgagtttgaagagctacaa-3’。
所用的反應(yīng)體系為：
反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>
溶解程序，獲得溶解曲線(見圖1)。
使用bio-rad的cfx96touchtm熒光定量pcr檢測系統(tǒng)運(yùn)行定量pcr反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示，其中，時(shí)期17表示果莢的一個(gè)發(fā)育階段，指的是從花器官(花藥，萼片等)脫離果莢到果莢變黃(18期)這一階段的果莢。從圖中可以看出半纖維素酶基因man7在果莢發(fā)育和延伸的時(shí)期(6d、8d、10d)的表達(dá)量逐漸下降，在果莢將要開始變黃的時(shí)候(12d)表達(dá)量有所上升，然后在果莢完全變黃的時(shí)候到達(dá)最高點(diǎn)。該結(jié)果表明，該基因跟果莢的早期的生長發(fā)育有所關(guān)聯(lián)，在果實(shí)開裂區(qū)形成和最后開裂的時(shí)候起作用，并影響著果莢開裂區(qū)的形態(tài)構(gòu)建和開裂的過程。
實(shí)施例3：半纖維素酶man7突變株的篩選
用下述方法篩選擬南芥man7失活純合突變體：從abrc(arabidopsisbiologicalresourcecenter)獲得man7(at5g66460)位點(diǎn)兩種不同的t-dna插入的突變體株系的種子(種子編號：gabi_747h02和sail_424_h03)(alonsoj.m.,stepanovaa.n.,leisset.j.,kimc.j.,chenh.,shinnp.,stevensond.k.,zimmermanj.,barajasp.,cheukr.,etal.2003.genome-wideinsertionalmutagenesisofarabidopsisthaliana.science301:653-657.)，并根據(jù)網(wǎng)站提供的資料設(shè)計(jì)所需引物，引物序列如下：
man7-1鑒定上游引物：5’-cacttattgcgcctatgcttc-3’；
man7-1鑒定下游引物：5’-gtaggagccaggggaatactg-3’；
man7-3鑒定上游引物：5’-gaaatggctgctcatgtgaaatca-3’；
man7-3鑒定下游引物：5’-ctcttccatttctccacattgatc-3’；
gabi_747h02插入片段引物：5’-atattgaccatcatactcattgc-3’；
sail_424_h03插入片段引物：
5’-gccttttcagaaatggataaatagc-3’。
以擬南芥的dna為模板(實(shí)施例1提取的擬南芥dna)，用上、下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系如下：
pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>
通過pcr鑒定，獲得了兩種不同的t-dna插入位點(diǎn)的man7失活純合子突變體，分別命名為man7-1(gabi_747h02)和man7-3(sail_424_h03)。具體過程為：
利用上述pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，使用man7-1鑒定上游引物和man7-1鑒定下游，以及man7-3鑒定上游引物和man7-3鑒定下游引物可分別在野生型(col-0)的擬南芥dna中擴(kuò)增出一條1060bp和673bp的條帶，而在man7-1和man7-3純合子突變體中均無法擴(kuò)增出對應(yīng)條帶(圖3a和3b)。而使用gabi_747h02插入片段引物和man7鑒定下游引物，sail_424_h03插入片段引物和man7鑒定上游引物可以分別在man7-1和man7-3純合子突變體中擴(kuò)增出長度分別為324bp和686bp的條帶，而無法在野生型的擬南芥的dna中得到對應(yīng)條帶(圖3c和3d)。
實(shí)施例4：man7失活純合子突變體的t-dna插入位點(diǎn)的鑒定
將實(shí)施例3擴(kuò)增出來的長度分別為324bp和686bp的條帶回收，得到man7-1和man7-3的dna，然后將使用gabi_747h02插入片段引物和man7-1鑒定上游引物以man7-1的dna為模板的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和使用sail_424_h03插入片段引物和man7-3鑒定下游引物以man7-3的dna為模板的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物分別測序。根據(jù)所得的測序結(jié)果在擬南芥數(shù)據(jù)庫中blast以確定man7-1和man7-3的t-dna的插入位點(diǎn)。結(jié)果表明，man7-1的插入位點(diǎn)位于man7基因的5’-utr處，屬于man7啟動子區(qū)域；而man7-3的插入位點(diǎn)位于man7基因的最后一個(gè)內(nèi)含子上(見圖4)。
實(shí)施例5：驗(yàn)證man7失活純合子突變體中man7基因的表達(dá)下調(diào)
分別以man7-1和man7-3的開花后12天的果莢為材料提取rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna。以cdna為模板，哥倫比亞型(col-0)即野生型為對照，使用定量引物與實(shí)施例1一致，結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，所得的兩種man7失活純合子突變體中man7基因的表達(dá)量只有野生型的14％(man7-1)和0.2％(man7-3)。
實(shí)施例6：半纖維素酶突變體果莢成熟推遲
將實(shí)施例2中纖維素酶man7的純合子突變體man7-1和man7-3以及對應(yīng)野生型哥倫比亞型擬南芥材料的花通過綁不同顏色繩子進(jìn)行標(biāo)記來記錄每朵花開花的日期，然后在果實(shí)變黃時(shí)通過觀察繩子顏色可計(jì)算出從花到變黃果莢所需的發(fā)育時(shí)間，每種材料統(tǒng)計(jì)至少50個(gè)果莢。結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出，野生型擬南芥(col-0)從開花到果莢變黃平均需要14.25天，而纖維素酶純合子突變體man7-1和man7-3則分別需要16.19天和16.86天，均比野生型推遲2天左右。說明纖維素酶缺失能造成擬南芥果實(shí)發(fā)育延遲。
實(shí)施例7：半纖維素酶突變體果莢開裂率下降
將實(shí)施例2中半纖維素酶man7的純合子突變體man7-1和man7-3以及對應(yīng)野生型哥倫比亞型(col-0)擬南芥材料的果實(shí)發(fā)育至剛變褐(19期)時(shí)，取該果實(shí)和這個(gè)果莢對應(yīng)的上一個(gè)全黃的果莢(18期)放置于解剖鏡下觀察是否有裂口。每種材料(man7-1、man7-3、col-0)從6株以上的植物中選?。好靠弥参锝y(tǒng)計(jì)15個(gè)18期和15個(gè)19期的果莢(一共統(tǒng)計(jì)90個(gè)以上果莢)，計(jì)算每種材料每種時(shí)期的開裂率(開裂率為有裂口的果莢占果莢總數(shù)的百分比)，然后每種材料用6株植物作為樣品重復(fù)(每種材料每種時(shí)期會得到6個(gè)開裂率)，再統(tǒng)計(jì)獲得平均開裂率，在將突變株的不同時(shí)期的開裂率和對應(yīng)的野生型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較并使用p值校驗(yàn)他們的差異性。
結(jié)果如圖7所示，從圖中可以看出，野生型擬南芥黃果莢(18期)的開裂率為76±3.6％，而纖維素酶純合子突變體man7-1和man7-3黃果莢(18期)的開裂率為38±3.5％和39±7.8％；在變褐果莢中，野生型的開裂率為100％，而突變株的開裂率為82±2.9％和82±5.1％。突變株相對野生型的p值均遠(yuǎn)低于0.05，表明突變株和野生型在開裂率之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明半纖維素酶缺失后會造成擬南芥果實(shí)開裂率下降。
實(shí)施例8：半纖維素酶突變體果莢對果莢發(fā)育過程中形態(tài)的影響
取野生型(col-0)，半纖維素酶man7失活純合子突變株man7-1和man7-3的半黃果莢(18a)，全黃的果莢(18b)以及干褐的果莢(19a)在體式顯微鏡進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖8所示：在果莢半黃的時(shí)期(18a)，野生型以及半纖維素酶man7失活純合子突變株man7-1和man7-3的果莢均未開裂。在果莢全黃的時(shí)期(18b)，野生型的果瓣和胎座框已經(jīng)分離，果莢已經(jīng)開始開裂，而半纖維素酶man7失活純合子突變株man7-1和man7-3的果莢并未裂開。在干褐果莢(19a)中，野生型的果莢已經(jīng)完全裂開，而半纖維素酶man7失活純合子突變株man7-1和man7-3的果莢頂部和基部雖然出現(xiàn)了裂口，但是整個(gè)開裂區(qū)還有許多地方處于未開裂狀態(tài)(圖7)。說明半纖維素酶突變后對果莢的開裂造成明顯的影響。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>一種半纖維素酶及其編碼基因與應(yīng)用
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