本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來自長牡蠣胞壁水解酶重組蛋白的制備及制備獲得的重組蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長牡蠣是世界重要的海水養(yǎng)殖貝類之一，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)中長期占據(jù)舉足輕重的地位。近年來，由各種病原微生物引起的疾病在長牡蠣的養(yǎng)殖群體中不斷爆發(fā)，對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失。因此，對長牡蠣開展免疫防御機(jī)制研究，發(fā)掘有效的抗病相關(guān)功能蛋白將有助于人類對其病害進(jìn)行有效防控。
長牡蠣隸屬于軟體動物，缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，僅依賴固有免疫系統(tǒng)抵御病原入侵?？咕?蛋白作為固有免疫中重要效應(yīng)分子，直接參與了對病原微生物的殺傷和清除過程。通過生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，長牡蠣基因組序列編碼了若干個胞壁水解酶基因。其中，cgcle-1(genbank注冊號：xp_011436111.1)基因開放閱讀框為501bp，其編碼的蛋白含有一段120個氨基酸的hydrolase_2結(jié)構(gòu)域。cgcle-1氨基酸序列除與長牡蠣中其他胞壁水解酶序列一致性為55-99％，與梭狀芽孢桿菌屬clostridium、芽孢桿菌屬bacillus細(xì)菌的細(xì)胞壁水解酶(cellwallhydrolase)或孢子皮質(zhì)裂解酶(sporecortex-lyticenzyme)一致性約為30-40％。目前，國內(nèi)外對細(xì)菌來源的胞壁水解酶進(jìn)行了功能研究，發(fā)現(xiàn)其可特異性地降解孢子皮質(zhì)中的肽聚糖，在孢子萌發(fā)過程發(fā)揮重要作用。但對無脊椎動物胞壁水解酶的制備、功能及其應(yīng)用的研究尚未見報道。本發(fā)明利用酵母表達(dá)體系制備長牡蠣胞壁水解酶cgcle-1重組蛋白，并對制備獲得的重組蛋白進(jìn)行抑菌功能研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種來自長牡蠣胞壁水解酶重組蛋白的制備及制備獲得的重組蛋白的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
一種長牡蠣胞壁水解酶重組蛋白的制備，利用酵母表達(dá)體系獲得長牡蠣胞壁水解酶的重組蛋白。
具體為：
1)通過長牡蠣血淋巴細(xì)胞總rna，反轉(zhuǎn)獲得cdna；
2)在cgcle-1的hydolase_2結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)兩端分別設(shè)計含有限制性酶切位點的引物；
序列為：5’-gaattcagaggagaaccgatggaagcta-3’，5’-gcggccgccacaaagtacagacccccgagtt-3’；
3)以步驟1)獲得cdna為模板，采用步驟2)的引物通過pcr擴(kuò)增獲得該基因片段，并將其克隆到ppiczαa表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；
4)所述獲得重組質(zhì)粒經(jīng)scai線性化后，電轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞畢赤酵母pichiapastorisgs115中實現(xiàn)真核體外重組表達(dá)，而后純化獲得cgcle-1重組蛋白。
一種利用制備方法獲得長牡蠣胞壁水解酶重組蛋白的應(yīng)用，所述長牡蠣crassostreagigas胞壁水解酶(cgcle-1)的重組蛋白作為抑菌劑的應(yīng)用。
所述長牡蠣crassostreagigas胞壁水解酶(cgcle-1)的重組蛋白作為大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、燦爛弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、惡臭假單胞菌或銅綠假單胞菌的抑菌劑的應(yīng)用。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點:
本發(fā)明對長牡蠣胞壁水解酶cgcle-1(accessionno.xp_011436111.1)進(jìn)行體外真核重組表達(dá)，所得長牡蠣胞壁水解酶重組蛋白是通過酵母表達(dá)系統(tǒng)所得，既具有生長快、易培養(yǎng)、遺傳操作簡單等原核表達(dá)系統(tǒng)的特點，又具有真核生物對蛋白的加工、修飾和空間折疊等功能，利于活性蛋白的表達(dá)。其對水生生物常見致病菌大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、燦爛弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、惡臭假單胞菌和銅綠假單胞菌的生長均有明顯的抑制效果，在水生生物抗菌劑方面具有潛在應(yīng)用價值。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白電泳圖。
圖2為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對燦爛弧菌生長的抑制作用效果圖。
圖3為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對大腸桿菌生長的抑制作用效果圖。
圖4為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對創(chuàng)傷弧菌生長的抑制作用效果圖。
圖5為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對惡臭假單胞菌生長的抑制作用效果圖。
圖6為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對溶藻弧菌生長的抑制作用效果圖。
圖7為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對銅綠假單胞菌生長的抑制作用效果圖。
圖8為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對嗜水氣單胞菌生長的抑制作用效果圖。
圖9為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣cgcle-1重組蛋白對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用效果圖。
具體實施方式
下面的實驗例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
本發(fā)明是通過pcr技術(shù)克隆獲得了長牡蠣胞壁水解酶中hydolase_2結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)序列，克隆到ppiczαa表達(dá)載體中，在畢赤酵母gs115中實現(xiàn)真核體外重組表達(dá)，經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠純化后獲得的重組蛋白分子，檢測重組蛋白的抑菌活性。
實驗例1：長牡蠣cgcle-1體外原核重組表達(dá)和純化
1、重組載體的構(gòu)建
本發(fā)明中采用的重組載體為invitrogen公司的ppiczαa原核表達(dá)載體。從新鮮長牡蠣血淋巴細(xì)胞中提取總rna，并通過反轉(zhuǎn)錄pcr獲得cdna。通過pcr技術(shù)，采用5’末端分別添加了ecori和noti限制性酶切位點的引物p1(5’-gaattcagaggagaaccgatggaagcta-3’)和p2(5’-gcggccgccacaaagtacagacccccgagtt-3’)擴(kuò)增長牡蠣胞壁水解酶hydolase_2結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)。反應(yīng)條件為：首先94℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)將擴(kuò)增片段純化回收，與pmd19-t載體連接。轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，并使用ecori和noti對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；回收目的片段，并與經(jīng)ecori和noti雙酶切的表達(dá)載體ppiczαa連接。經(jīng)測序驗證，插入序列與長牡蠣cgcle-1中hydolase_2結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)序列一致。
2、重組蛋白的表達(dá)與純化
將重組質(zhì)粒用saci酶切，并純化酶切產(chǎn)物。采用電擊法將10μg線性化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母pichiapastorisgs115菌株，涂布于含10-200μgml-1zeocin的ypds平板，于30℃培養(yǎng)3-4天，篩選高拷貝轉(zhuǎn)化菌株。挑取ypdzeocin平板上的陽性單菌落，接種于含有10mlbmgy培養(yǎng)基的搖瓶中，28-30℃振蕩培養(yǎng)(250-300rpm)直至對數(shù)生長期(od600為2.0-6.0)。1500-3000×g室溫離心5min，收集酵母細(xì)胞。將酵母細(xì)胞重懸于100-200mlbmmy培養(yǎng)基中(od600為1.0)，28-30℃振蕩培養(yǎng)，每隔24小時補(bǔ)加甲醇至終濃度為2％進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)4天后，3000×g4℃離心5min，收集發(fā)酵上清液進(jìn)行重組蛋白的純化和濃縮。發(fā)酵上清加入超濾離心管(mwco30kda,millipore)，12000×g4℃離心30min；流穿液加入超濾離心管(mwco3kda,millipore)，12000×g4℃離心30min，獲得重組表達(dá)蛋白，采用12％tricine-sds-page檢測。
實驗結(jié)果：電泳結(jié)果表明，得到單一蛋白條帶與預(yù)測的cgcle-1分子量大小一致，為純化的長牡蠣cgcle-1重組蛋白(圖1)。
實驗例2：長牡蠣cgcle-1重組蛋白的抑菌活性檢測
大腸桿菌(escherichiacoli)、嗜水氣單胞菌(aeromonashydrophila和金黃色葡萄球菌(staphyloccocusaureus)分別用lb培養(yǎng)基37℃，220rpm，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；燦爛弧菌(vibriosplendidus)、創(chuàng)傷弧菌(vibriovulnificus)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)分別用2216e培養(yǎng)基28℃，220rpm，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。所得菌體分別經(jīng)離心收集后用tbs(50mmtris-hcl,100mmnacl，ph＝7.4)進(jìn)行洗滌并重懸至濃度104cfu。將50μl上述實施例獲得重組蛋白cgcle-1(160μgml-1)與等體積的上述獲得各細(xì)菌重懸液室溫孵育2h?？瞻捉M(blank組)以50μltbs代替重組蛋白。取20μl上述混合物于平底96孔板(costar，fisher)中，每孔加入200μl液體培養(yǎng)基，于酶標(biāo)儀中振蕩培養(yǎng)12-16h，每隔30min檢測記錄各孔o(hù)d600值。其中，大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌處理組用lb培養(yǎng)基于37℃振蕩培養(yǎng)；燦爛弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌處理組用2216e培養(yǎng)基28℃震蕩培養(yǎng)。每個樣品設(shè)三個重復(fù)，根據(jù)3次測定結(jié)果取平均值繪制生長曲線并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
實驗結(jié)果：cgcle-1能夠顯著抑制燦爛弧菌(圖2)、大腸桿菌(圖3)、創(chuàng)傷弧菌(圖4)、惡臭假單胞菌(圖5)、溶藻弧菌(圖6)、銅綠假單胞菌(圖7)、嗜水氣單胞菌(圖8)和金黃色葡萄球菌(圖9)的生長(p<0.01)。實驗例3：長牡蠣cgcle-1重組蛋白最小抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentration,mic)的測定
將cgcle-1重組蛋白進(jìn)行倍比稀釋，按照實驗例2的方法進(jìn)行抑菌活性檢測，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長的最低藥物濃度即cgcle-1的mic。
實驗結(jié)果：cgcle-1對所檢測細(xì)菌的最小抑菌濃度見表1。
表1.cgcle-1對不同細(xì)菌的最小抑菌濃度