本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種酶法制備甘露糖-6-磷酸的方法。
背景技術(shù)：
甘露糖-6-磷酸（英語：Mannose-6-phosphate，M6P）是一個(gè)在免疫系統(tǒng)中與凝集素結(jié)合的分子，M6P可由磷酸甘露糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。在蛋白質(zhì)代謝過程中，與細(xì)胞核內(nèi)體、細(xì)胞膜和細(xì)胞外分泌物有關(guān)的蛋白質(zhì)必須經(jīng)過修飾才能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的最終位置。6-磷酸甘露糖(mannose-6-phosphate,M-6-P)就是廣泛存在于生命體中的與蛋白質(zhì)修飾密切相關(guān)的磷酸化糖類化合物。M-6-P與其相應(yīng)的受體6-磷酸甘露糖受體(mannose-6-phosphate receptor,M-6-P receptor)結(jié)合，在溶酶體酶發(fā)生效應(yīng)的過程中起著重要的作用，M-6-P是溶酶體酶的分揀員和投送員。
專利號201080035798.3中提到了甘露糖-6-磷酸及其鹽、其前體或其類似物有減少皮膚發(fā)紅的用途，同時(shí)具有美容效果，并且能夠加快受損皮膚的愈合。近年來，以M-6-P為前體的藥物研究日益受到關(guān)注，人們對于M-6-P的需求也隨之提升。因此，尋找一種大規(guī)模生產(chǎn)M-6-P的方法是非常有必要的。
目前，人們大多數(shù)采用化學(xué)法來合成M-6-P的類似物，而利用酶法來合成M-6-P非常的少。化學(xué)法基本都是以甲基α-D-吡喃甘露糖苷或者甲基2,3,4-三-O-b苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷為起始物經(jīng)過3-5步的合成步驟，形成與M-6-P具有相似結(jié)構(gòu)的類似物。合成過程所需要的條件比較苛刻，需要低溫環(huán)境或者需要重金屬或有毒試劑的參與，并且總回收率也不高。
相比于化學(xué)法合成M-6-P的類似物來說，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，且無需有機(jī)試劑以及重金屬的參與，更加有利于后期的藥物合成。
本發(fā)明提供了一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，通過對D-甘露糖制備工藝參數(shù)，酶促反應(yīng)合成甘露糖-6-磷酸工藝參數(shù)的優(yōu)化，使得原料選擇更加簡單，工藝流程明了詳細(xì)，合成效率更好，同時(shí)制備得到的甘露糖-6-磷酸的純度更高，達(dá)到99%以上。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比(1-10)：(1-2)葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度25-65％(質(zhì)量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質(zhì)量之和的比值為0.1-1：50，在50-110℃的真空條件下進(jìn)行差向異構(gòu)，得到的異構(gòu)混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進(jìn)行脫鹽精制后進(jìn)入模擬移動床進(jìn)行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進(jìn)行差向異構(gòu)；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進(jìn)行一次蒸發(fā)然后加入活性炭進(jìn)行脫色，經(jīng)脫色處理后，進(jìn)行二次蒸發(fā)，得到料液，該料液進(jìn)行水相結(jié)晶，結(jié)晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時(shí)，每小時(shí)降0.5-1℃；7～18小時(shí)，每小時(shí)降1-2℃；19小時(shí)以后，每小時(shí)降0.5-1℃，直至降至20～30℃，結(jié)晶后經(jīng)離心精制，得到粗品結(jié)晶D-甘露糖，以20-40％的無水乙醇對粗D-甘露糖進(jìn)行15-60分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品;
(2) 配制反應(yīng)液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調(diào)節(jié)pH值；其中D-甘露糖濃度為300-800mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為500-1500mmol/L，MgCl2濃度為10-100mmol/L，pH值為4-9；
(3)加入己糖激酶混合，然后將其置于反應(yīng)溫度15-50℃的搖床上反應(yīng)，100rpm震蕩溫育使之進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)5-48小時(shí)；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進(jìn)行分離提純，濃縮，干燥即得。
優(yōu)選地，步驟(1)中，葡萄糖和果糖的摩爾比(9-10)：(1-1.2)，用純化水稀釋到濃度38％(質(zhì)量)，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質(zhì)量之和的比值為0.8-1：50。
優(yōu)選地，步驟(2)中，D-甘露糖濃度為500-800mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為500-1200mmol/L，-甘露糖與腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉摩爾比為1：2.3。
優(yōu)選地，步驟(2)中，MgCl2濃度為D-甘露糖濃度的1/3-1/9。
優(yōu)選地，步驟(2)中，pH值為6.5-8.8。
優(yōu)選地，腺苷三磷酸鈉鹽與六偏磷酸鈉摩爾比為1-10：10-1。
本發(fā)明具有以下有益效果：
(1)本發(fā)明使用酶法合成M-6-P，相比于化學(xué)法合成M-6-P的類似物來說，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、高效、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，且只需從市場獲得己糖激酶即可以作為原料，利于工業(yè)化生產(chǎn)；
(2)本發(fā)明通過對D-甘露糖制備工藝參數(shù)，酶促反應(yīng)合成甘露糖-6-磷酸工藝參數(shù)的優(yōu)化，使得原料選擇更加簡單，工藝流程明了詳細(xì)，合成效率更好，同時(shí)制備得到的甘露糖-6-磷酸的純度更高，達(dá)到99%以上。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說明書中闡述，并且部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實(shí)施本發(fā)明而了解。本發(fā)明的主要目的和其它優(yōu)點(diǎn)可通過在說明書、權(quán)利要求書中所特別指出的方案來實(shí)現(xiàn)和獲得。
附圖說明
附圖僅用于示出具體實(shí)施例的目的，而并不認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，在整個(gè)附圖中，相同的參考符號表示相同的部件。
圖1為利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比8：1葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度40％(質(zhì)量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質(zhì)量之和的比值為0.2：50，在65℃的真空條件下進(jìn)行差向異構(gòu)，得到的異構(gòu)混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進(jìn)行脫鹽精制后進(jìn)入模擬移動床進(jìn)行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進(jìn)行差向異構(gòu)；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進(jìn)行一次蒸發(fā)然后加入活性炭進(jìn)行脫色，經(jīng)脫色處理后，進(jìn)行二次蒸發(fā)，得到料液，該料液進(jìn)行水相結(jié)晶，結(jié)晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時(shí)，每小時(shí)降0.5℃；7～18小時(shí)，每小時(shí)降1.5℃；19小時(shí)以后，每小時(shí)降0.5℃，直至降至26℃，結(jié)晶后經(jīng)離心精制，得到粗品結(jié)晶D-甘露糖，以35％的無水乙醇對粗D-甘露糖進(jìn)行40分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；
(2) 配制反應(yīng)液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸鈉鹽、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調(diào)節(jié)pH值；其中D-甘露糖濃度為500mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為1300mmol/L，MgCl2濃度為12mmol/L，pH值為6；
(3)加入己糖激酶（商業(yè)購買，sigma公司生產(chǎn)CAS：9001-51-8）混合，然后將其置于反應(yīng)溫度30℃的搖床上反應(yīng)，100rpm震蕩溫育使之進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)36小時(shí)；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進(jìn)行分離提純，濃縮，干燥即得。
轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，提純后的甘露糖-6-磷酸的純度達(dá)到99.2%。
實(shí)施例2
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比8：1葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度30％(質(zhì)量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質(zhì)量之和的比值為1：50，在80℃的真空條件下進(jìn)行差向異構(gòu)，得到的異構(gòu)混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進(jìn)行脫鹽精制后進(jìn)入模擬移動床進(jìn)行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進(jìn)行差向異構(gòu)；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進(jìn)行一次蒸發(fā)然后加入活性炭進(jìn)行脫色，經(jīng)脫色處理后，進(jìn)行二次蒸發(fā)，得到料液，該料液進(jìn)行水相結(jié)晶，結(jié)晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時(shí)，每小時(shí)降1℃；7～18小時(shí)，每小時(shí)降2℃；19小時(shí)以后，每小時(shí)降1℃，直至降至22℃，結(jié)晶后經(jīng)離心精制，得到粗品結(jié)晶D-甘露糖，以25％的無水乙醇對粗D-甘露糖進(jìn)行50分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；
(2) 配制反應(yīng)液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、六偏磷酸鈉、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調(diào)節(jié)pH值；其中D-甘露糖濃度為350mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽和/或六偏磷酸鈉濃度為780mmol/L，MgCl2濃度為40mmol/L，pH值為8.5；
(3)加入己糖激酶（商業(yè)購買，品牌：星科生物 ）混合，然后將其置于反應(yīng)溫度40℃的搖床上反應(yīng)，100rpm震蕩溫育使之進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)20小時(shí)；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進(jìn)行分離提純，濃縮，干燥即得。
轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，提純后的甘露糖-6-磷酸的純度達(dá)到99.35%。
實(shí)施例3
一種利用甘露糖制備甘露糖-6-磷酸的方法，包括以下步驟：
(1)D-甘露糖的制備：a.將摩爾比2：1葡萄糖和果糖用純化水稀釋到濃度33％(質(zhì)量)，加入催化劑鉬酸鹽，所述鉬酸鹽與葡萄糖和果糖質(zhì)量之和的比值為0.2：50，在55℃的真空條件下進(jìn)行差向異構(gòu)，得到的異構(gòu)葡萄糖、果糖、甘露糖混合液；b.將步驟a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，進(jìn)行脫鹽精制后進(jìn)入模擬移動床進(jìn)行分離提純，得到富含甘露糖的組分A和其他組分B；將其他組分B返回到步驟a進(jìn)行差向異構(gòu)；c將步驟b得到的富含甘露糖的組分A，進(jìn)行一次蒸發(fā)然后加入活性炭進(jìn)行脫色，經(jīng)脫色處理后，進(jìn)行二次蒸發(fā)，得到料液，該料液進(jìn)行水相結(jié)晶，結(jié)晶過程中的降溫梯度控制：0～6小時(shí)，每小時(shí)降0.8℃；7～18小時(shí)，每小時(shí)降1.2℃；19小時(shí)以后，每小時(shí)降1℃，直至降至25℃，結(jié)晶后經(jīng)離心精制，得到粗品結(jié)晶D-甘露糖，以28％的無水乙醇對粗D-甘露糖進(jìn)行55分鐘浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；
(2) 配制反應(yīng)液，將步驟(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸鈉鹽和六偏磷酸鈉、MgCl2溶解在去離子水中，用Tris-Hcl緩沖液調(diào)節(jié)pH值；其中D-甘露糖濃度為400mmol/L，腺苷三磷酸鈉鹽濃度為400mmol/L，六偏磷酸鈉濃度為250mmol/L，MgCl2濃度為25mmol/L，pH值為7.5；
(3)加入己糖激酶（商業(yè)購買，品牌：星科生物 ）混合，然后將其置于反應(yīng)溫度30℃的搖床上反應(yīng)，100rpm震蕩溫育使之進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)35小時(shí)；
(4)加入活性炭脫色，過濾；
(5)加入KOH，然后利用SSMB進(jìn)行分離提純，濃縮，干燥即得。
轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，提純后的甘露糖-6-磷酸的純度達(dá)到99.5%。
上所述僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)所想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。