本發(fā)明屬于可皆霉素生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用狹旋毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)可皆霉素的方法。

背景技術(shù)：

狹旋毛殼屬于子囊菌門毛殼屬真菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值和生態(tài)意義。研究表明：毛殼菌作為生防菌能夠應(yīng)用于植物病害的防治?？山悦顾?Cochliodinol，分子式為C₃₂H₃₀N₂O₄；分子量：506.22；CAS登錄號(hào)：11051-88-0)僅在毛殼屬（Chaetomium globosum,C. cochliodes）中分離得到，其結(jié)構(gòu)式為：

。

Brewerr的科研團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在1-10μg/ml時(shí)，可皆霉素抑制多屬真菌的生長(zhǎng)，并能抑制真菌Botrytis allii 和 Fusarirm moniliforme孢子的萌發(fā)，其形成三乙胺鹽后，水溶性顯著增加，且溶解后能顯著抑制多種微生物質(zhì)的生長(zhǎng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)可皆霉素在低濃度時(shí)，能夠抑制多種鐮刀菌的生長(zhǎng)，而鐮刀菌可侵染多種植物(糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、藥用植物及觀賞植物)，引起植物多種病害，造成作物大量死亡，是生產(chǎn)上防治最具挑戰(zhàn)性的病害之一。由此可見，其在植物病害防治方面的潛在應(yīng)用價(jià)值非常大。另外，Casellada等研究發(fā)現(xiàn)可皆霉素具有顯著細(xì)胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌細(xì)胞KB和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的增殖，IC₅₀分別為0.53 μM、2.20μM。

綜上所述，可皆霉素具有多種生物活性，但由于合成成本高，得率低，無(wú)法獲得大量純品，難以進(jìn)行更深入研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高的利用狹旋毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)可皆霉素的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種利用狹旋毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）菌種活化：將狹旋毛殼菌種接種平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，獲得活化菌種；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1）制備的活化菌種接種于培養(yǎng)基B中，溫度為25℃條件下靜置培養(yǎng)40天，獲得發(fā)酵物；培養(yǎng)基B的配方為：50~70 g大米，100 ml水；培養(yǎng)基B的制備方法如下：將大米和水按比例混合，121℃下高壓滅菌40分鐘；

（3）乙酸乙酯提取物的制備：將步驟（2）制備的發(fā)酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，在溫度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下減壓回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；

（4）可皆霉素的制備：將步驟（3）制備的乙酸乙酯提取物上柱分離，得可皆霉素。

步驟（1）所用的狹旋毛殼菌種保藏的分類學(xué)名稱為狹旋毛殼(Chaetomium angustispirale) CLC001，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó) 武漢 武漢大學(xué)；保藏日期：2016年4 月28 日，保藏號(hào)為CCTCC NO：M 2016231。該菌在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)出大量可皆霉素。該菌的18S rDNA如序列表所示，即

CGTGGGTCTTTCTACCTGATCCGAGGTCACCTTGGGTTAAAAGGTGGTTTAACGGCCGGAACCCGCAGCACGCCCAGAGCGAGATGTATGCTACTACGCTCGGTGTGACAGCGAGCCCGCCACTGCTTTTCAGGGCCTGCGGCAGCCGCAGGTCCCCAACACAAGCCCGGGGGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTTATTCAGTACAGAAGACTCAGAGAGGCCATAAATTAACAAGAGTTTGGTGACCTCCGGCGGGCGCCCGCGGTGGGGCCCAGGGGCGCCCGGGGGGTAAACCCCGGGGCCGCCCGCCGAAGCAACGGTTTAGGTAACGTTCACAATGGTTTAGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCAGGTCCCCCTACGGAAG。

所述步驟（4）中上柱分離的具體步驟如下：用80～100目硅膠拌樣后裝柱，固定相為200～300目硅膠，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脫，硅膠薄層層析檢測(cè)，合并二氯甲烷-甲醇的體積比為100:（2～4）的流份，30～40℃下減壓回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷－甲醇體積比為1：1混合溶劑溶解，經(jīng)Sephadex LH-20層析，流動(dòng)相二氯甲烷－甲醇體積比為1：1，得可皆霉素。

所述步驟（1）中平板培養(yǎng)基配方為：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂粉20g/L，pH6.0±0.1。

所述步驟（3）中將發(fā)酵物用乙酸乙酯浸取時(shí)的工藝條件如下：加入乙酸乙酯，20～25℃下冷浸12h，用紗布過濾，得到乙酸乙酯提取液，反復(fù)提取3次，合并提取液。

所述步驟（4）中將乙酸乙酯提取物與80～100目硅膠拌樣時(shí)，乙酸乙酯提取物與80～100目硅膠的重量比為1︰2。

本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是：本發(fā)明中提供的狹旋毛殼(Chaetomium angustispirale) CLC001可在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)出大量可皆霉素；本發(fā)明的提取方法簡(jiǎn)單易行，相對(duì)于其它培養(yǎng)基，該方法成本更低，并具有可持續(xù)性，提取得到可皆霉素單體，提取過程中用到的溶劑可回收利用，提取量大，可工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1

一種利用狹旋毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）菌種活化：將狹旋毛殼菌種（保藏的分類學(xué)名稱為狹旋毛殼CLC001，保藏號(hào)為CCTCC NO：M 2016231，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）接種到90 mm平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)72小時(shí)，獲得活化菌種；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1）制備的活化菌種用手術(shù)刀片將其分為12份，取一份接種于培養(yǎng)基B中，溫度為25℃條件下靜置培養(yǎng)40天，獲得發(fā)酵物；培養(yǎng)基B的配方為：60 g大米，100 ml水；培養(yǎng)基B的制備方法如下：將大米和水按比例混合，121℃下高壓滅菌40分鐘；

（3）乙酸乙酯提取物的制備：將步驟（2）制備的發(fā)酵物用乙酸乙酯浸?。尤胍宜嵋阴?00 ml，20～25℃下冷浸12h，用紗布過濾，得到乙酸乙酯提取液，反復(fù)提取3次，合并三次的提取液），得提取液，在溫度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下減壓回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；通過HPLC檢測(cè)，可皆霉素在乙酸乙酯提取物中的含量為68.90%；

（4）可皆霉素的制備：將步驟（3）制備的乙酸乙酯提取物用80～100目硅膠拌樣后裝柱（乙酸乙酯提取物與80～100目硅膠的重量比為1︰2），固定相為200～300目硅膠，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脫(二氯甲烷－甲醇體積比為100:0；100:1；100:2；100:4；100:8)，硅膠薄層層析，紫外254 nm檢測(cè)，合并二氯甲烷-甲醇的體積比為100:2和100:4的流份，40℃下減壓回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷－甲醇體積比為1：1的混合溶劑溶解，經(jīng)Sephadex LH-20（羥丙基葡聚糖凝膠）層析，流動(dòng)相二氯甲烷－甲醇體積比為1：1，得純品可皆霉素400mg（純度為98.3%）。

本實(shí)施例制備得到的可皆霉素的結(jié)構(gòu)鑒定如下：

【性狀】紫色粉末

【鑒定】分子式：C₃₂H₃₀N₂O₄, 分子量：506.2206

儀器設(shè)備：Agilent 1100液相色譜儀, ¹H, ¹³C NMR 圖譜由 Bruker am-400 MHz 核磁共振儀測(cè)定(TMS為內(nèi)標(biāo)),質(zhì)譜由Agilent 6490 型質(zhì)譜儀測(cè)定。

利用ESI-MS，¹H NMR和¹³C NMR試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)如下：ESI-MS m/z: 505.2124 [M-H]⁺; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.41 (1H, s, 2,5-OH), 8.13 (1H, s, 1-NH), 7.60 (1H, s, H-2), 7.44 (1H, s, H-4), 7.34 (1H, d, J = 8.4, H-7),7.08 (1H, d, J = 8.4, H-6), 5.40 (1H, m, H-11), 3.46 (1H, m, H-10), 1.75 (3H, s, 13-CH₃), 1.74 (1H, s, 14-CH₃); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ:134.4 (C-8), 133.9 (C-5), 131.7 (C-12), 127.2 (C-2), 126.3 (C-9), 124.5 (C-11), 123.6 (C-6), 120.9 (C-4), 111.1 (C-7), 110.8 (C-3, C-6), 104.4 (C-3), 34.7 (C-10), 25.8 (C-14), 17.9 (C-13).

利用TLC，在UV 254nm呈強(qiáng)熒光；以硫酸顯色劑，110℃下15秒鐘，呈現(xiàn)棕色。

【含量測(cè)定】利用HPLC，色譜條件：Sepax GP-C18 5μm（250mm×4.6mm）色譜柱。流動(dòng)相：乙腈︰水︰甲酸為10︰90︰0.1；流速：1.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，保留時(shí)間值9.45 min。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明,而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

SEQUENCE LISTING

<110> 黃河科技學(xué)院

<120> 一種利用狹旋毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)可皆霉素的方法

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> Chaetomium angustispirale

<400> 1

cgtgggtctt tctacctgat ccgaggtcac cttgggttaa aaggtggttt aacggccgga 60

acccgcagca cgcccagagc gagatgtatg ctactacgct cggtgtgaca gcgagcccgc 120

cactgctttt cagggcctgc ggcagccgca ggtccccaac acaagcccgg gggcttgatg 180

gttgaaatga cgctcgaaca ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc 240

aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt tcgctgcgtt 300

cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgacttat tcagtacaga 360

agactcagag aggccataaa ttaacaagag tttggtgacc tccggcgggc gcccgcggtg 420

gggcccaggg gcgcccgggg ggtaaacccc ggggccgccc gccgaagcaa cggtttaggt 480

aacgttcaca atggtttagg gagttttgca actctgtaat gatccctccg caggtccccc 540

tacggaag 548