本發(fā)明屬于生物化學領域，具體涉及一種利用L-谷氨酸脫氫酶催化生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法。
背景技術：
：α-酮戊二酸在三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝中是一種重要的二羧酸，參與氨基酸的形成和氮的傳輸，在雜環(huán)構建、保健品、輸液以及傷口愈合的組成成分中也有廣泛的應用。目前一種新的應用領域是α-酮戊二酸和三醇(甘油、1,2,4-丁三醇、1,2,6-己三醇)的熱縮聚，生成的聚合物三醇-α-酮戊二酸在生物醫(yī)藥上有潛在的應用。目前α-酮戊二酸的生產(chǎn)方法有三種：(1)化學合成法，以丁二酸二乙酯和草酸二乙酯為原料的多步合成；(2)微生物發(fā)酵法，細菌和酵母；(3)生物催化法。過量成產(chǎn)α-酮戊二酸常使用解脂耶氏酵母WSH-Z06，用Y.lipolyticaH355發(fā)酵選擇超表達的延胡索酸酶、依賴NADP+的異檸檬酸脫氫酶和丙酮酸縮化酶能提高α-酮戊二酸的產(chǎn)量，但是生物發(fā)酵法生產(chǎn)周期長，產(chǎn)物提取分離困難，生產(chǎn)成本偏高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。目前工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法是化學合成法，但是此法產(chǎn)生的有毒的化學物質和溶劑對環(huán)境有很嚴重的污染，基于化學合成法對環(huán)境的各方面的影響，新興的生物催化法生產(chǎn)α-酮戊二酸就具有很好的前景。第一，生物催化法以可再生資源為出發(fā)點，可降解、無毒；第二，選擇性高、產(chǎn)率高、降低了生產(chǎn)成本；第三，生物催化是在常溫常壓下進行，更安全。雖然生物催化法比化學合成法有更多潛在的優(yōu)勢，但是有關利用酶法催化生產(chǎn)α-酮戊二酸的報道很少，尤其是L-谷氨酸脫氫酶。工業(yè)上L-谷氨酸產(chǎn)能過剩(2012年，L-谷氨酸的產(chǎn)量大約1200萬噸)，因此以廉價的L-谷氨酸為原料生產(chǎn)α-酮戊二酸是最有優(yōu)勢的。在L-谷氨酸脫氫酶催化L-谷氨酸氧化過程中涉及到原位再生輔因子NAD(P)+的過程，但是研究以合成為目的的輔因子再生氧化過程這一領域很少，比較常見的是利用NADH氧化酶，但NADH氧化酶的可用數(shù)量仍然是有限的，因此需要一種NADH氧化酶類似物來再生輔因子NAD(P)+，近年來研究發(fā)現(xiàn)金屬有機配合物比較適合，如銠配合物、鐵卟啉，但是其成本高，易導致酶失活，且后處理比較困難，不適合工業(yè)生產(chǎn)。綜上所述，隨著α-酮戊二酸的應用價值的發(fā)現(xiàn)，其市場需求量在不斷的上升，但就目前工業(yè)上使用的有機合成法所引起的一系列的環(huán)境、成本等問題，利用依賴輔因子再生的酶法催化生產(chǎn)α-酮戊二酸具有很好的前景，目前國內(nèi)利用L-谷氨酸脫氫酶生物催化法生產(chǎn)α-酮戊二酸還未見有報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了一種利用L-谷氨酸脫氫酶催化生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，以解決現(xiàn)有技術存在的污染重、成本高和步驟繁瑣等問題。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：一種利用L-谷氨酸脫氫酶催化生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，它包括如下步驟：在緩沖溶液中和過氧化氫清除劑的存在下，經(jīng)輔因子和L-谷氨酸脫氫酶的催化，L-谷氨酸或其鹽經(jīng)氧化反應生成α-酮戊二酸；其中，所述的輔因子依賴有機小分子再生催化劑實現(xiàn)同步催化再生，輔因子的濃度為0.5～3mmol/L。，優(yōu)選1mmol/L。其中，L-谷氨酸或其鹽的氧化反應和輔因子的催化再生反應在反應體系中同步進行。其中，所述的緩沖溶液為0.1mmol/L的磷酸緩沖液、0.1mmol/L的Tris-HCl緩沖液、0.05mmol/L的碳酸鹽緩沖液、0.1mmol/L的檸檬酸緩沖液或0.1mmol/L的巴比妥鈉-HCl緩沖液；其中，所述的緩沖溶液的pH為8～10，優(yōu)選pH為9。其中，所述的過氧化氫清除劑為過氧化氫酶，濃度為500U/ml～3000U/ml，酶活定義為：在25℃下，1min降解1μmolH2O2所需要的過氧化氫酶的酶量定義為一個酶活力單位，優(yōu)選過氧化氫酶的濃度為500U/ml。其中，所述的輔因子為NAD+或NADP+，優(yōu)選NAD+。其中，所述的輔因子與有機小分子再生催化劑的摩爾比為1：0.5～3，優(yōu)選1：1。其中，所述的L-谷氨酸脫氫酶的濃度為5～50U/ml，酶活定義為：在25℃下，1min生成1μmolNADH所需要的L-谷氨酸脫氫酶的酶量定義為一個酶活力單位，優(yōu)選L-谷氨酸脫氫酶的濃度為5U/ml。其中，所述的有機小分子再生催化劑為FAD、FMN、7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽、7-甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽或8-甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽，優(yōu)選7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽。其中，所述的L-谷氨酸鹽為L-谷氨酸堿金屬鹽、L-谷氨酸堿性氨基酸鹽和L-谷氨酸銨鹽中的任意一種或幾種的組合。其中，所述的L-谷氨酸或其鹽的初始反應濃度為15～50mmol/L，優(yōu)選濃度為15mmol/L。其中，所述的氧化反應的溫度為25～35℃，優(yōu)選30℃；反應時間為24～72h，優(yōu)選48h。本發(fā)明還要保護一種組合產(chǎn)品，它包括如下組分：(1)L-谷氨酸脫氫酶；(2)過氧化氫清除劑；(3)輔因子；(4)有機小分子催化劑；其中，所述的過氧化氫清除劑為過氧化氫酶，所述的輔因子為NAD+或NADP+，所述的有機小分子催化劑為FAD、FMN、7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽、7-甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽或8-甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽。其中，L-谷氨酸脫氫酶和過氧化氫清除劑的濃度之比為1U/ml：100～1500U/ml，輔因子或有機小分子催化劑與L-谷氨酸脫氫酶的用量比為1mmol/L：5～50U/ml。其中，過氧化氫酶的酶活定義為：在25℃下，1min降解1μmolH2O2所需要的過氧化氫酶的酶量定義為一個酶活力單位；L-谷氨酸脫氫酶酶活定義為：在25℃下，1min生成1μmolNADH所需要的L-谷氨酸脫氫酶的酶量定義為一個酶活力單位。上述組合產(chǎn)品在制備α-酮戊二酸中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：本發(fā)明以依賴有機小分子催化再生的輔因子的L-谷氨酸脫氫酶催化L-谷氨酸或其鹽發(fā)生氧化反應生成α-酮戊二酸，所用原料低廉，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過程簡單易操作，且沒有環(huán)境污染，達到了資源循環(huán)再生利用的效果，這為工業(yè)上高效生產(chǎn)α-酮戊二酸奠定了理論基礎。本發(fā)明方法直接以L-谷氨酸或其鹽為原料，通過一步反應，生成α-酮戊二酸，反應選擇性好，產(chǎn)率高。附圖說明圖1為7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽作為輔因子再生催化劑與L-谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)反應的路線圖；圖2為L-谷氨酸脫氫酶催化生產(chǎn)α-酮戊二酸的液相圖；圖3為α-酮戊二酸標準物的液相圖。具體實施方式實施例1：L-谷氨酸脫氫酶在不同NAD+濃度下催化生產(chǎn)α-酮戊二酸30℃下，在10mlpH8Tris-HCl反應體系中，L-谷氨酸15mM，NAD+，7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽1mM，過氧化氫酶500U/mL、L-谷氨酸脫氫酶5U/mL，反應液與外界空氣相連通。取反應48h的反應液200μL，加入800μL水稀釋，液相檢測反應進程，結果如表1所示。表1NAD+濃度(mM)產(chǎn)率(％)0.552.1190.71.575.2250.52.546.8343.7實施例2：L-谷氨酸脫氫酶在不同7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽濃度下催化生產(chǎn)α-酮戊二酸30℃下，在10mlpH8Tris-HCl反應體系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽，過氧化氫酶500U/mL、L-谷氨酸脫氫酶5U/mL，反應液與外界空氣相連通。取48h的反應液200μL，加入800μL水稀釋，液相檢測反應進程，結果如表2所示。表27-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽(mM)產(chǎn)率(％)0.547.6190.71.572.7263.72.558.2354.1實施例3：L-谷氨酸脫氫酶在不同pH種類下催化生產(chǎn)α-酮戊二酸30℃下，在10mlpH8不同緩沖體系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽1mM，過氧化氫酶500U/mL、L-谷氨酸脫氫酶5U/mL，反應液與外界空氣相連通。取反應48h的反應液200μL，加入800μL水稀釋，液相檢測反應進程，結果如表3所示。表3pH種類產(chǎn)率(％)Tris-HCl90.7KPi50.4CBS60.2CPBS71.8巴比妥那-鹽酸53.6實施例4：L-谷氨酸脫氫酶在不同pH下催化生產(chǎn)α-酮戊二酸30℃下，在10mlTris-HCl反應體系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽1mM，過氧化氫酶500U/mL、L-谷氨酸脫氫酶5U/mL，反應液與外界空氣相連通。取反應48h的反應液200μL，加入800μL水稀釋，液相檢測反應進程，結果如表4所示。表4實施例5：不同來源的L-谷氨酸脫氫酶催化生產(chǎn)α-酮戊二酸30℃下，在10mlpH9Tris-HCl反應體系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽1mM，過氧化氫酶500U/mL、L-谷氨酸脫氫酶5U/mL，反應液與外界空氣相連通。取反應48h的反應液200μL，加入800μL水稀釋，液相檢測反應進程，結果如表5所示。表5L-GluDH的來源產(chǎn)率(％)化學合成97Proteussp67.8C.difficile54.3F.nucleatum37.2實施例6：不同輔因子再生體系對L-谷氨酸脫氫酶催化生產(chǎn)α-酮戊二酸30℃下，在10mlpH9Tris-HCl反應體系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，有機小分子再生催化劑1mM，過氧化氫酶500U/mL、L-谷氨酸脫氫酶5U/mL，反應液與外界空氣相連通。取反應48h的反應液200μL，加入800μL水稀釋，液相檢測反應進程，結果如表6所示。表6輔因子再生體系產(chǎn)率(％)FAD11.6FMN21.57-三氟甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽977-甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽83.18-甲基-1,10-乙撐基異咯嗪氯化鹽76.4實施例7：生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法：本發(fā)明的生產(chǎn)方法主要包括步驟：在緩沖溶液中和過氧化氫清除劑的存在下，經(jīng)依賴有機小分子催化再生的輔因子的L-谷氨酸脫氫酶的催化，L-谷氨酸或其鹽發(fā)生氧化反應生成α-酮戊二酸。當前第1頁1 2 3