本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及葡萄潰瘍病菌對(duì)葡萄致病力的評(píng)價(jià)方法，具體涉及4種葡萄潰瘍病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新殼梭孢Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata)粗毒素原液的制備與致病力評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
由葡萄座腔菌科(Botryosphaeria spp.)真菌引起的葡萄潰瘍病是一種重要的葡萄病害。葡萄潰瘍病主要發(fā)生在枝干、葉片和果實(shí)上，具體表現(xiàn)為樹勢(shì)衰減、枝干出現(xiàn)潰瘍斑、葉片皺縮、果實(shí)脫落等。至今已發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌科中有21個(gè)種能引起葡萄潰瘍病，在美國(guó)、日本、法國(guó)、新西蘭等20多個(gè)國(guó)家廣泛發(fā)生(URbez-Torres J R,Peduto F,Striegler R K,et al.Characterization of fungal pathogens associated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri.Fungal Diversity.2012:1-21.U Rbez-Torres J R,Gubler W D.Pathogenicity of Botryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California.Plant Disease.2009,93(6):584-592.)。
近年來(lái)，研究表明葡萄座腔菌科真菌可分泌多糖、蜜蜂曲霉素、對(duì)羥苯基乙醇等真菌毒素導(dǎo)致寄主植物發(fā)生病害(Martos S,Andolfi A,Luque J,et al.Production of phytotoxic metabolites by five species of Botryosphaeriaceae causing decline on grapevines,with special interest in the species Neofusicoccum luteum and N.parvum.European Journal of Plant Pathology,2008,121(4):451-461.Djoukeng J D,Polli S,Larignon P,et al.Identification of phytotoxins from Botryosphaeria obtusa,a pathogen of black dead arm disease of grapevine.European journal of plant pathology,2009,124(2):303-308.Abou-Mansour E,Débieux J L,Ramírez-Suero M,et al.Phytotoxic metabolites from Neofusicoccum parvum,a pathogen of Botryosphaeria dieback of grapevine.Phytochemistry,2015,115:207-215.)，表明毒素是葡萄潰瘍病菌的重要致病因子之一。
目前，主要的葡萄潰瘍病菌致病力評(píng)價(jià)方法，均需要接種活菌，實(shí)施需要大量的植物材料和病原菌，容易污染，耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了簡(jiǎn)便、直觀的明確毒素在葡萄潰瘍病菌在侵染葡萄過(guò)程中的作用，
本發(fā)明提供獲得一種操作簡(jiǎn)單、成本低、結(jié)果可靠的我國(guó)4種葡萄潰瘍病菌優(yōu)勢(shì)種(Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata)粗毒素原液的制備方法。
所述方法包括下述步驟：
1)將葡萄潰瘍病菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48小時(shí)后，用5mm打孔器沿菌落邊緣打取菌餅置于盛有100mL改良Fries的產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，6個(gè)菌餅/100mL培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)14d；
2)將步驟1)中獲得的培養(yǎng)物倒入50mL的無(wú)菌離心管中，常溫下10000rpm(相當(dāng)于11400g)離心8min；
3)將步驟2)中上清用0.25μm的針式過(guò)濾器過(guò)濾至新的無(wú)菌離心管中，即為粗毒素原液。
步驟1)中改良Fries的產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基的配方為：每升中含蔗糖20g、酒石酸銨5g、硝酸銨1g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.1g、氯化鈣0.13g、酵母浸膏1g，加超純水至1L。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述粗毒素原液的進(jìn)行葡萄潰瘍病菌對(duì)葡萄致病力評(píng)價(jià)的方法，。
具體步驟如下：
1)將葡萄潰瘍病菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48小時(shí)后，用5mm打孔器沿菌落邊緣打取菌餅置于盛有100mL改良Fries的產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，6個(gè)菌餅/100mL培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)14d；
2)將步驟1)中獲得的培養(yǎng)物倒入50mL的無(wú)菌離心管中，常溫下10000rpm離心8min；
3)將步驟2)中上清用0.25μm的針式過(guò)濾器過(guò)濾至新的無(wú)菌離心管中，即為粗毒素原液；
4)選取不同葡萄品種一年生綠枝條頂端起第1至第4片葉子，用1％(w/v)進(jìn)行消毒處理1min后，用滅菌水沖洗3遍，超凈工作臺(tái)中晾干備用；
5)用直徑為1cm的打孔器在經(jīng)步驟4)處理的葉片上打取葉盤，并將其放入裝有潤(rùn)濕滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中；
6)用移液器吸取步驟3)中制備的10μL粗毒素原液，接種在步驟5)中所述的葉盤的中心位置，25℃保濕培養(yǎng)3d后根據(jù)病斑面積大小評(píng)價(jià)不同葡萄潰瘍病菌粗毒素原液的致病力。
致病力的強(qiáng)弱是通過(guò)接種后葉盤上病斑面積大小來(lái)分級(jí)評(píng)價(jià)，病斑葉面積應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行測(cè)定，DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行顯著性分析。葡萄潰瘍病菌致病力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)病斑；Ⅰ級(jí)：病斑面積范圍在1-10mm2；Ⅱ級(jí)：病斑面積范圍在10-20mm2；Ⅲ級(jí)：20-40mm2。
本發(fā)明建立了一種操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠的葡萄潰瘍病菌粗毒素原液的制備方法及其致病力評(píng)價(jià)方法。本方法的建立在選育抗葡萄潰瘍病的葡萄品種方面也具有重要意義。
附圖說(shuō)明
圖1為夏黑’、‘寒香蜜’和‘巨玫瑰’葡萄品種葉盤法接種葡萄潰瘍病菌Diplodia seriata菌株SDZ-01 3d后的結(jié)果，其中a是對(duì)照，為‘夏黑’接種無(wú)菌水3d后的結(jié)果；b為‘夏黑’接種改良Fries培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的結(jié)果；c為‘夏黑’接種改良Czapeck培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的結(jié)果；d是對(duì)照，為‘寒香蜜’接種無(wú)菌水3d后的結(jié)果；e為‘寒香蜜’接種改良Fries培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的結(jié)果；f為‘寒香蜜’接種改良Czapeck培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的結(jié)果；g是對(duì)照，為‘巨玫瑰’接種無(wú)菌水3d后的結(jié)果；h為‘巨玫瑰’接種改良Fries培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的結(jié)果；i為‘巨玫瑰’接種改良Czapeck培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施實(shí)施例中所用葡萄潰瘍病菌菌株(Lasiodiplodia theobromae)GX-5-5A、Sxg-01s-1、SDZ-01和AH-3-1-01S在文獻(xiàn)“Jiye Yan,Yue Xie,Wei Zhang.,et al.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China.Fungal Diversity.2013,61:221-236.Jiye Yan,Yue Xie,Shengwei Yao,et al.Characterization of Botryosphaeria dothidea,the causal agent of grapevine canker in China.Australasian Plant Pathology2012,41(4):351-357.”中公開，GXQZ-04s由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所按照常規(guī)方法分離、鑒定保存，公眾可自行按照常規(guī)方法分類或者從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
實(shí)施例1、我國(guó)4種葡萄潰瘍病菌優(yōu)勢(shì)種粗毒素原液的致病力評(píng)價(jià)
1、葡萄潰瘍病菌粗毒素原液的制備
采用液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基改良Fries和改良Czapeck培養(yǎng)4種葡萄潰瘍病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新殼梭孢Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata)。將各株葡萄潰瘍病菌置于PDA培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48小時(shí)后，在菌落邊緣上用打孔器分別打取直徑為5mm的菌餅，并將其分別放入50mL改良Fries和改良Czapeck的產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基中，3個(gè)菌餅/50mL，靜置培養(yǎng)14天。改良Fries培養(yǎng)基配方：蔗糖20g、酒石酸銨5g、硝酸銨1g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.1g、氯化鈣0.13g、酵母浸膏1g，加超純水至1L；改良Czapeck培養(yǎng)基配方：硝酸鈉2g、磷酸氫二鉀1g、氯化鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、硫酸鐵0.01g、蔗糖30g、酵母提取物5g、麥芽糖提取物5g，超純水定容至1L。PDA培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml，煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過(guò)濾，再加10-20g葡萄糖和17-20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過(guò)濾，分裝，高壓蒸汽滅菌(121℃)滅菌20分鐘。
14天后，將各菌株培養(yǎng)液倒入50mL的離心管中，10000rpm離心8min，取上清于新的50mL離心管。為避免上清液有雜質(zhì)、菌絲和孢子的存在，將上清通過(guò)濾徑為0.25μm針孔過(guò)濾器過(guò)濾于10mL的離心管中，即為粗毒素原液。滴一滴過(guò)濾后的粗毒素原液于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，排除細(xì)菌、菌絲和孢子的污染。粗毒素原液于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2、粗毒素原液接種
本發(fā)明選取‘夏黑’、‘寒香蜜’和‘巨玫瑰’3種葡萄品種一年生綠枝條頂端起第1至第4片葉子，經(jīng)質(zhì)量百分濃度為1％的次氯酸鈉浸泡1min后，用滅菌的超純水浸洗3次，再用吸水紙吸干葉片上多余的水分，使用直徑為1cm的打孔器打出葉盤，并將其放入裝有潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中。接著吸取濾液10μL于葉盤中央，并觀察拍照。對(duì)照為改良Fries、改良Czapeck原液以及超純水。觀察結(jié)果表明：相同菌株在不同葡萄品種中表現(xiàn)出不同程度的病害，不同產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的濾液致病力存在差異，且不同菌株之間有著不同的致病力(圖1)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用于葡萄潰瘍病菌粗毒素原液致病力分析的粗毒素制備的最佳條件為：采用改良Fries培養(yǎng)菌株，獲取濾液后接種在葡萄生長(zhǎng)枝頂端起第1片幼嫩新葉，接種后3d測(cè)量病斑面積。采用改良Czapeck的產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的葡萄潰瘍病菌粗毒素原液沒有在各個(gè)品種的葡萄葉面形成病斑，發(fā)明人在選擇培養(yǎng)基的過(guò)程中，使用了其他多種培養(yǎng)基，均無(wú)法產(chǎn)生明顯病斑。
3、評(píng)價(jià)葡萄潰瘍病菌粗毒素原液致病力的方法
采用上述最佳條件對(duì)4種葡萄潰瘍病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新殼梭孢Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata)對(duì)不同葡萄品種進(jìn)行致病力的評(píng)價(jià)，致病力的強(qiáng)弱是通過(guò)接種后葉盤上病斑面積大小來(lái)分級(jí)評(píng)價(jià)，病斑葉面積應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行測(cè)定，DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行顯著性分析。葡萄潰瘍病菌致病力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)病斑；Ⅰ級(jí)：病斑面積范圍在1-10mm2；Ⅱ級(jí)：病斑面積范圍在10-20mm2；Ⅲ級(jí)：20-40mm2。
表1改良Frise培養(yǎng)基獲得濾液接種3d后的病斑面積(mm2)
結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明4種葡萄潰瘍病菌供試菌株中Diplodia seriata菌株SDZ-01粗毒素原液的致病力最強(qiáng)，其對(duì)‘巨玫瑰’和‘夏黑’兩個(gè)品種的致病力級(jí)別為Ⅲ級(jí)，對(duì)‘寒香蜜’的致病力為Ⅰ級(jí)，均高于Sxg-01s-1(Botryosphaeria dothidea)、GXQZ-04s/Gx-5-5A(Botryosphaeria rodina)和AH-3-1-01S(Neofusicoccum parvum)的致病力。
目前，常用的評(píng)價(jià)致病力方法是將上述4種葡萄潰瘍病菌直接接種各品種的枝條，具體方法如下所示，
(1)將待測(cè)菌株活化，28℃培養(yǎng)5天，在菌落邊緣處用4mm無(wú)菌打孔器打取菌餅。
(2)用4mm無(wú)菌打孔器刺傷葡萄枝條，造成傷口。
(3)將菌餅菌絲面朝下接種到傷口處，并用封口膜包扎保濕，每株葡萄苗為一個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)，并用接種空白PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。
(4)將接種好的葡萄苗置于25℃光照、18℃黑暗、12h光暗交替，50％相對(duì)濕度的溫室中培養(yǎng)，7天后測(cè)量病斑長(zhǎng)度。
并判斷致病力，評(píng)價(jià)的結(jié)果(Jiye Yan,Yue Xie,Wei Zhang.,et al.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China.Fungal Diversity.2013,61:221-236.Jiye Yan,Yue Xie,Shengwei Yao,et al.Characterization of Botryosphaeria dothidea,the causal agent of grapevine canker in China.)與本發(fā)明上述方法一致，但耗時(shí)長(zhǎng)，接種方法繁瑣。