本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于套氏病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約為15.4kb，基因組3’末端有Poly(A)尾序列，5’末端有帽狀引導(dǎo)序列。其基因組含有9個相互重疊的開放讀碼框(open reading frame,ORF)。在PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白中，GP5、M、N蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白，而GP2a、2b、GP3、GP4是次要結(jié)構(gòu)蛋白。

反向遺傳學(xué)(Reverse genetics)技術(shù)相對于經(jīng)典遺傳學(xué)方法具有方法簡便、定點可控等優(yōu)點，在研究病毒的分子生物學(xué)以及病毒的致病機(jī)理中發(fā)揮著重要的作用。RNA聚合酶II(RNA polymerase II)拯救系統(tǒng)直接利用真核生物RNA聚合酶II啟動子驅(qū)動病毒轉(zhuǎn)錄，一般選用CMV啟動子、SV40啟動子、肌動蛋白基因啟動子等。RNA聚合酶II拯救系統(tǒng)有很突出的優(yōu)點：避免了體外長時操作RNA的步驟；RNA polymerase II有校正功能，錯配率相對較低，可保證病毒基因組的準(zhǔn)確性；所有的真核細(xì)胞內(nèi)都有RNA聚合酶II，所以該系統(tǒng)有廣泛的細(xì)胞適應(yīng)性；步驟簡便，既不需要轉(zhuǎn)染RNA，又不需要額外提供T7RNA聚合酶，經(jīng)濟(jì)實用。轉(zhuǎn)染72小時后收獲培養(yǎng)上清，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代救獲病毒。對基因組cDNA進(jìn)行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(tǒng)可獲得相應(yīng)的突變或重組的負(fù)鏈RNA病毒。

自2006年以來出現(xiàn)的由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起的HP-PRRS，以發(fā)病率和死亡率高、傳播迅速為特征，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在中國流行的PRRSV毒株與之前的流行株相比，在遺傳變異、毒力和致病性等方面發(fā)生了很大改變，使我國PRRS的防治面臨更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。但是到目前為止PRRSV毒力增強的機(jī)制還不清楚，因此，非常有必要建立高效經(jīng)濟(jì)的HP-PRRSV的反向遺傳學(xué)技術(shù)操作平臺，PRRSV作為病毒疫苗載體應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)意義十分巨大。但是，現(xiàn)有的用于研究的PRRSV基礎(chǔ)材料其在應(yīng)用過程中不便于觀察，其傳代能力較差，給對PRRSV的深入研究帶來了不便。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，該方法可以構(gòu)建出可視化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，為豬繁殖與呼吸綜合征病毒深入研究提供便捷。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該病毒具有可視化的特點，在其應(yīng)用過程中，能夠被方便地觀察，且其傳代能力好。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒篩選抗病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法得到的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括：

將含有熒光標(biāo)記基因的熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒上的連接位點；

將上述感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后得到帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒；

其中，上述感染性克隆質(zhì)粒含有用于表達(dá)上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)序列，上述表達(dá)序列包括N蛋白基因序列和連接至上述N蛋白基因序列下游的3’端非編碼序列，上述連接位點位于上述N蛋白基因序列的下游和上述3’端非編碼序列的上游之間。

一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其由上述的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法所構(gòu)建得到。

上述的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在篩選抗病毒藥物中的應(yīng)用。

上述的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。

上述的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程疫苗中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，通過將含有熒光標(biāo)記基因的熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒上的連接位點，上述連接位點位于感染性克隆質(zhì)粒上發(fā)熱N蛋白基因序列的下游和3’端非編碼序列的上游之間，使得該熒光標(biāo)記基因，能夠被穩(wěn)定地表達(dá)，不影響其他結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，確保所得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)完整，且其表面帶有熒光標(biāo)記蛋白，這樣的熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒可作為研究載體應(yīng)用到各種領(lǐng)域，其具有可視化的特點，非常便于研究過程中的觀察病毒的活動狀態(tài)，另外由于熒光標(biāo)記表達(dá)盒的插入位點在N蛋白基因序列的下游和3’端非編碼序列的上游之間，這個位點并不影響病毒的復(fù)制能力和傳動能力，確保得到的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在傳代過程中的穩(wěn)定性更好，不發(fā)生熒光基因的丟失現(xiàn)象。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明提供的構(gòu)建帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的策略圖；

圖2為本發(fā)明提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在熒光顯微鏡下的檢測結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的Northern Blot檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明提供的一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用進(jìn)行具體說明。

一方面，本發(fā)明提供的一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括：

將含有熒光標(biāo)記基因的熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒上的連接位點。

將上述感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后得到帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

其中，上述感染性克隆質(zhì)粒含有用于表達(dá)上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)序列，上述表達(dá)序列包括N蛋白基因序列和連接至上述N蛋白基因序列下游的3’端非編碼序列(3’-UTR)，上述連接位點位于上述N蛋白基因序列的下游和上述3’端非編碼序列的上游之間。

進(jìn)步一地，上述熒光標(biāo)記表達(dá)盒還含有調(diào)控上述熒光標(biāo)記基因表達(dá)的調(diào)控序列(TRS)，上述調(diào)控序列選自SEQ ID NO.1-6中的任意一種。

其中，SEQ ID NO.1所示的為TRS2調(diào)控序列，長度為27bp，該調(diào)控序列的核心結(jié)合序列為TTGAACCA；

SEQ ID NO.2所示的為TRS3調(diào)控序列，長度為88bp，該調(diào)控序列的核心結(jié)合序列為TAACCAT；

SEQ ID NO.3所示的為TRS4調(diào)控序列，長度為236bp，該調(diào)控序列的核心結(jié)合序列為TTGACCA；

SEQ ID NO.4所示的為TRS5調(diào)控序列，長度為47bp，該調(diào)控序列的核心結(jié)合序列為TTTAGCCTGTC；

SEQ ID NO.5所示的為TRS6調(diào)控序列，長度為24bp，該調(diào)控序列的核心結(jié)合序列為TTTAACCA；

SEQ ID NO.6所示的為TRS7調(diào)控序列，長度為128bp，該調(diào)控序列的核心結(jié)合序列為TAACCA。

不同的調(diào)控序列其調(diào)控能力不同，使用者可根據(jù)熒光基因表達(dá)的強度，采用不同的調(diào)控序列進(jìn)行構(gòu)建，得到具有不同熒光基因表達(dá)強度的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

優(yōu)選地，上述調(diào)控序列的3’端與上述熒光標(biāo)記基因的5’端之間插入有Kozark序列，上述Kozark序列的堿基序列如SEQ ID NO.7所示。

優(yōu)選地，上述熒光標(biāo)記基因為綠色熒光蛋白基因或紅色熒光蛋白基因，上述綠色熒光蛋白基因的堿基序列如SEQ ID NO.8所示，上述紅色熒光蛋白基因的堿基序列如SEQ ID NO.9所示。

需要說明的是，熒光標(biāo)記基因的并不限于上述的綠色熒光蛋白基因或紅色熒光蛋白基因，其他的能夠表達(dá)出熒光蛋白的熒光標(biāo)記基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

優(yōu)選地，上述感染性克隆質(zhì)粒是pBAC-SD¹⁶。該感染性克隆質(zhì)粒含有編碼HP-PRRSV/SD16所有結(jié)構(gòu)蛋白(包括主要結(jié)構(gòu)蛋白GP3/GP4/GP5/M/N，以及非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a、ORF1b)的cDNA(如圖1B所示)。

需要說明的是，感染性克隆質(zhì)粒的類型并不限于pBAC-SD¹⁶。只要含有具有編碼HP-PRRSV或者PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白(包括主要結(jié)構(gòu)蛋白GP3/GP4/GP5/M/N，以及非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a、ORF1b)的cDNA的感染性克隆質(zhì)粒即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

優(yōu)選地，上述宿主細(xì)胞是Marc-145細(xì)胞或者M(jìn)A-104細(xì)胞。

另一方面，本發(fā)明提供的一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其由上述的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法所構(gòu)建得到。

再一方面，本發(fā)明提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在篩選抗病毒藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程疫苗中的應(yīng)用。

綜上，本發(fā)明的提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，通過將含有熒光標(biāo)記基因的熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒上的連接位點，上述連接位點位于感染性克隆質(zhì)粒上發(fā)熱N蛋白基因序列的下游和3’端非編碼序列的上游之間，使得該熒光標(biāo)記基因，能夠被穩(wěn)定地表達(dá)，不影響其他結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，確保所得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)完整，且其表面帶有熒光標(biāo)記蛋白，這樣的熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒可作為研究載體應(yīng)用到各種領(lǐng)域，其具有可視化的特點，非常便于研究過程中的觀察病毒的活動狀態(tài)，另外由于熒光標(biāo)記表達(dá)盒的插入位點在N蛋白基因序列的下游和3’端非編碼序列的上游之間，這個位點并不影響病毒的復(fù)制能力和轉(zhuǎn)錄能力，確保得到的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒在傳代過程中的穩(wěn)定性更好，不發(fā)生熒光基因的丟失現(xiàn)象。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實施例1

本實施例提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括如下步驟，其構(gòu)建策略如圖1所示(圖1中：A為熒光標(biāo)記表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)模式圖，B為感染性克隆質(zhì)粒改造的結(jié)構(gòu)模式圖，C為連接有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的感染性克隆質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)模式圖)，先構(gòu)建出由調(diào)控序列驅(qū)動熒光標(biāo)記基因表達(dá)的熒光標(biāo)記表達(dá)盒，在熒光標(biāo)記表達(dá)盒的兩端引入酶切位點(AsiS I和Mlu I內(nèi)切酶)，然后在感染性克隆質(zhì)粒(pBAC-SD16^FL)的N蛋白與3’端非編碼序列(3’-UTR)之間引入相同的酶切位點(AsiS I和Mlu I內(nèi)切酶))，接著將熒光標(biāo)記表達(dá)盒雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切后的感染性克隆質(zhì)粒進(jìn)行連接，進(jìn)而得到連接有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的感染性克隆質(zhì)粒(pBAC-SD16^FL-TRSX-EGFP，TRSX中的X代表2、3、4、5、6或7)。

1.1構(gòu)建熒光標(biāo)記表達(dá)盒

1.1.1設(shè)計引物：上游引物(AsisI-TRS2-EGFP-up)：5’-GCGATCGCTTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAA-3’和下游引物(EGFP-MluI-Lower):5’-CAGCCCACGACGCGTCGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’。利用NEB Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase構(gòu)建含有HP-PRRSV/SD16TRS2和EGFP基因(克隆于pEGFP-N1載體(Clontech))的基因片段。PCR按照說明書進(jìn)行。PCR體系為50μL，其中包括25μL 2×Premix PCR緩沖液，引物各1μmol/L，模板為pEGFP-N1載體。PCR反應(yīng)條件為：98℃30s，98℃10s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸2min。其中，TRS2調(diào)控序列的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP基因的堿基序列如SEQ ID NO.8所示。

利用Qiagen膠回收試劑盒按照說明書回收目的片段。按照載體說明書將回收的目的片段并將其亞克隆入pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector中即得到含有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的質(zhì)粒載體即pEASY-TRS2-EGFP(如圖1A所示)。經(jīng)測序驗證后，用于后續(xù)步驟。需要說明的是熒光標(biāo)記表達(dá)盒也可以通過基因合成的方法獲取。

1.2熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒

1.2.1用AsiS I和Mlu I內(nèi)切酶對pEASY-TRS2-EGFP進(jìn)行雙酶切，溫度37℃，酶切時間8h。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收小片段即TRS2-EGFP片段。

1.2.2通過套式PCR技術(shù)，利用NEB Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase構(gòu)建Fam片段，將AsiS I和Mlu I兩個酶切位點定向引入到HP-PRRSV基因組的N基因和3'-UTR序列(基因組的15,170nt和15,171nt)結(jié)合處，再利用Asc I和Rsr II酶切位點將pBAC-SD16FL質(zhì)粒的相應(yīng)片段進(jìn)行替換，構(gòu)建完成含有AsiS I和Mlu I分子標(biāo)簽的HP-PRRSV/SD16全長cDNA克隆的pBAC-SD16^FL-AM質(zhì)粒。其中，pBAC-SD16^FL含有編碼HP-PRRSV/SD16所有結(jié)構(gòu)蛋白(包括主要結(jié)構(gòu)蛋白GP3/GP4/GP5/M/N，以及非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a、ORF1b)的cDNA(如圖1中B所示)。

1.2.3用T4DNA連接酶，在16℃連接過夜條件下，將所述TRS2-EGFP小片段連接至與經(jīng)同樣雙酶切后的含有pBAC-SD16^FL-AM質(zhì)粒，得到pBAC-SD16^FL-TRS2-EGFP感染性克隆質(zhì)粒(如圖1中C所示)。

1.3轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒

1.3.1將Marc-145細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞ATCC)接種于含有10％胎牛血清(Hyclone)和2％胎牛血清(Hyclone)的DMEM培養(yǎng)基的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞融合至60％-80％時，取1.2μg pBAC-SD16^FL-TRS2-EGFP質(zhì)粒并加入4.5μL Attractene轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)按照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后置于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后每天觀察細(xì)胞病變和熒光出現(xiàn)情況，待細(xì)胞病變達(dá)90％時候收取細(xì)胞上清。獲得熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的EGFP基因的表達(dá)由調(diào)控序列TRS2調(diào)控。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為rHP-PRRSV/SD16/TRS2-EGFP。

實施例2

本實施例提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括如下步驟。

2.1構(gòu)建熒光標(biāo)記表達(dá)盒

2.1.1設(shè)計引物：上游引物(AsisI-TRS3-up)：

5’-GCGATCGCTAACCATAGTGTATAATA-3’，

下游引物(TRS3-EGFP-lower)：

5’-CTCGCCCTTGCTCACCATTGCTGAAAATCATGAAGC-3’，

上游引物(TRS3-EGFP-up)：

5’-GCTTCATGATTTTCAGCAATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’。首先以pBAC-SD16^FL為模板，利用引物AsisI-TRS3-up和TRS3-EGFP-lower擴(kuò)增含有TRS3序列和EGFP基因的前18個堿基的基因序列；然后利用引物TRS3-EGFP-up和EGFP-MluI-Lower擴(kuò)增含有TRS3序列最后18個堿基序列和EGFP基因序列的目的片段。最終通過套式PCR技術(shù)，利用引物AsisI-TRS3-up和EGFP-MluI-Lower，利用NEB Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase構(gòu)建含有HP-PRRSV/SD16TRS3和EGFP基因的基因片段。

PCR按照說明書進(jìn)行。每個PCR體系各50μL，其中包括25μL2×Premix PCR緩沖液，引物各1μmol/L，模板分別為pBAC-SD16^FL和pEGFP-N1載體。PCR反應(yīng)條件為：98℃30s，98℃10s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸2min。

利用Qiagen膠回收試劑盒按照說明書回收目的片段。按照載體說明書將回收的目的片段并將其亞克隆入pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector中，即得到含有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的質(zhì)粒載體即pEASY-TRS3-EGFP。經(jīng)測序驗證后，用于后續(xù)步驟。其中，TRS3調(diào)控序列的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

2.2熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒，具體操作可參考實施例1的步驟1.2。得到pBAC-SD16^FL-TRS3-EGFP感染性克隆質(zhì)粒

2.3轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，具體操作可參考實施例1的步驟1.3。獲得熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的EGFP基因的表達(dá)由調(diào)控序列TRS3調(diào)控。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為rHP-PRRSV/SD16/TRS3-EGFP。

實施例3

本實施例提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括如下步驟。

3.1構(gòu)建熒光標(biāo)記表達(dá)盒

3.1.1設(shè)計引物：上游引物(AsisI-TRS4-up)：

5’-GCGATCGCTTGACCAGTGTCTACGCC-3’，

下游引物(TRS4-EGFP-lower)：

5’-CTCGCCCTTGCTCACCATTCCAGGTGAAACCAATTG-3’，

上游引物(TRS4-EGFP-up)：

5’-CAATTGGTTTCACCTGGAATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’。首先以pBAC-SD16^FL為模板，利用引物AsisI-TRS4-up和TRS4-EGFP-lower擴(kuò)增含有TRS4序列和EGFP基因的前18個堿基的基因序列；然后利用引物TRS4-EGFP-up和EGFP-MluI-Lower擴(kuò)增含有TRS4序列最后18個堿基序列和EGFP基因序列的目的片段。最終通過套式PCR技術(shù)，利用引物AsisI-TRS4-up和EGFP-MluI-Lower，利用NEB Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase構(gòu)建含有HP-PRRSV/SD16TRS4和EGFP基因(克隆于pEGFP-N1載體(Clontech))的基因片段。

PCR按照說明書進(jìn)行。每個PCR體系各50μL，其中包括25μL2×Premix PCR緩沖液，引物各1μmol/L，模板分別為pBAC-SD16^FL和pEGFP-N1載體。PCR反應(yīng)條件為：98℃30s，98℃10s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸2min。

利用Qiagen膠回收試劑盒按照說明書回收目的片段。按照載體說明書將回收的目的片段并將其亞克隆入pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector中，即得到含有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的質(zhì)粒載體即pEASY-TRS4-EGFP。經(jīng)測序驗證后，用于后續(xù)步驟。其中，TRS4調(diào)控序列的堿基序列如SEQ ID NO.3所示。

3.2熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒，具體操作可參考實施例1的步驟1.2。得到pBAC-SD16^FL-TRS4-EGFP感染性克隆質(zhì)粒

3.3轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，具體操作可參考實施例1的步驟1.3。獲得熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的EGFP基因的表達(dá)由調(diào)控序列TRS4調(diào)控。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為rHP-PRRSV/SD16/TRS4-EGFP。

實施例4

本實施例提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括如下步驟。

4.1構(gòu)建熒光標(biāo)記表達(dá)盒

4.1.1設(shè)計上游引物(AsisI-TRS5-EGFP-up)：

5’-GCGATCGCATTAGCCTGTCTTTTTGCCATCCTACTGGCAATTTGAATGTTCAAGT-3’，利用引物AsisI-TRS5-EGFP-up和EGFP-MluI-Lower，利用NEB Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase構(gòu)建含有HP-PRRSV/SD16TRS5和EGFP基因(克隆于pEGFP-N1載體(Clontech))的基因片段。

PCR按照說明書進(jìn)行。每個PCR體系各50μL，其中包括25μL2×Premix PCR緩沖液，引物各1μmol/L，模板為pEGFP-N1載體。PCR反應(yīng)條件為：98℃30s，98℃10s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸2min。

利用Qiagen膠回收試劑盒按照說明書回收目的片段。按照載體說明書將回收的目的片段并將其亞克隆入pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector中，即得到含有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的質(zhì)粒載體即pEASY-TRS5-EGFP。經(jīng)測序驗證后，用于后續(xù)步驟。其中，TRS5調(diào)控序列的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

4.2熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒，具體操作可參考實施例1的步驟1.2。得到pBAC-SD16^FL-TRS5-EGFP感染性克隆質(zhì)粒

4.3轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，具體操作可參考實施例1的步驟1.3。獲得熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的EGFP基因的表達(dá)由調(diào)控序列TRS5調(diào)控。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為rHP-PRRSV/SD16/TRS5-EGFP。

實施例5

本實施例提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括如下步驟。

5.1構(gòu)建熒光標(biāo)記表達(dá)盒

5.1.1設(shè)計上游引物(AsisI-TRS6-EGFP-up)：

5’-GCGATCGCTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’，利用引物AsisI-TRS6-EGFP-up和EGFP-MluI-Lower，通過套式PCR技術(shù)，利用NEB Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase構(gòu)建含有HP-PRRSV/SD16TRS6和EGFP基因(克隆于pEGFP-N1載體(Clontech))的基因片段。

PCR按照說明書進(jìn)行。每個PCR體系各50μL，其中包括25μL2×Premix PCR緩沖液，引物各1μmol/L，模板為pEGFP-N1載體。PCR反應(yīng)條件為：98℃30s，98℃10s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸2min。

利用Qiagen膠回收試劑盒按照說明書回收目的片段。按照載體說明書將回收的目的片段并將其亞克隆入pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector中，即得到含有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的質(zhì)粒載體即pEASY-TRS6-EGFP。經(jīng)測序驗證后，用于后續(xù)步驟。其中，TRS6調(diào)控序列的堿基序列如SEQ ID NO.5所示。

5.2熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒，具體操作可參考實施例1的步驟1.2。得到pBAC-SD16^FL-TRS6-EGFP感染性克隆質(zhì)粒

5.3轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，具體操作可參考實施例1的步驟1.3。獲得熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的EGFP基因的表達(dá)由調(diào)控序列TRS6調(diào)控。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為rHP-PRRSV/SD16/TRS6-EGFP。

實施例6

本實施例提供的帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法，其包括如下步驟。

6.1構(gòu)建熒光標(biāo)記表達(dá)盒

6.1.1設(shè)計引物：上游引物(AsisI-TRS7-up)：

5’-GCGATCGCTAACCACGCATTTGTCGT-3’，

下游引物(TRS7-EGFP-lower)：

5’-CTCGCCCTTGCTCACCATATTTAACAAGGTTTACCA-3’，

上游引物(TRS7-EGFP-up)：

5’-TGGTAAACCTTGTTAAATATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’。首先以pBAC-SD16FL為模板，利用引物AsisI-TRS7-up和TRS7-EGFP-lower擴(kuò)增含有TRS7序列和EGFP基因的前18個堿基的基因序列；然后利用引物TRS7-EGFP-up和EGFP-MluI-Lower擴(kuò)增含有TRS7序列最后18個堿基序列和EGFP基因序列的目的片段。最終通過套式PCR技術(shù)，利用引物AsisI-TRS7-up和EGFP-MluI-Lower，利用NEB Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase構(gòu)建含有HP-PRRSV/SD16TRS7和EGFP基因(克隆于pEGFP-N1載體(Clontech))的基因片段。

PCR按照說明書進(jìn)行。每個PCR體系各50μL，其中包括25μL2×Premix PCR緩沖液，引物各1μmol/L，模板分別為pBAC-SD16^FL和pEGFP-N1載體。PCR反應(yīng)條件為：98℃30s，98℃10s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸2min。

利用Qiagen膠回收試劑盒按照說明書回收目的片段。按照載體說明書將回收的目的片段并將其亞克隆入pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector中，即得到含有熒光標(biāo)記表達(dá)盒的質(zhì)粒載體即pEASY-TRS7-EGFP。經(jīng)測序驗證后，用于后續(xù)步驟。其中，TRS7調(diào)控序列的堿基序列如SEQ ID NO.6所示。

6.2熒光標(biāo)記表達(dá)盒連接至感染性克隆質(zhì)粒，具體操作可參考實施例1的步驟1.2。得到pBAC-SD16^FL-TRS7-EGFP感染性克隆質(zhì)粒

6.3轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，具體操作可參考實施例1的步驟1.3。獲得熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的EGFP基因的表達(dá)由調(diào)控序列TRS7調(diào)控。該熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為rHP-PRRSV/SD16/TRS7-EGFP。

實驗例1

取實施例1-6中的感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后獲得帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清液，盲傳3代后收獲病毒。檢測各實施例得到的熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒綠色熒光表達(dá)情況。

方法如下：將Marc-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合至60％～80％時，將1.2μg攜帶不同調(diào)控序列TRS和EGFP標(biāo)簽組成的HP-PRRSV全長cDNA克隆質(zhì)粒分別加入4.5μL Attractene轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)按照Attractene轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后每天觀察細(xì)胞病變和熒光出現(xiàn)情況。

利用熒光顯微鏡對每代病毒進(jìn)行熒光觀察和細(xì)胞病變檢測。結(jié)果圖2所示(圖2中：1-6分別代表rHP-PRRSV/SD16/TRS2-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS3-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS4-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS5-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS6-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS7-EGFP，A代表熒光圖，B代表細(xì)胞病變(CPE)圖，C代表疊加圖，圖中箭頭所指為熒光點)，熒光顯微鏡下觀察到在每代病毒都可以檢測到綠色熒光團(tuán)的出現(xiàn)。不同實施例得到的病毒表達(dá)綠色熒光的能力存在差異。該結(jié)果表明已獲得綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒，綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒可以持續(xù)傳代。

實驗例2

Northern Blot檢測各實施例的EGFP表達(dá)情況。方法如下：

將上述得到的綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒以低感染劑量(0.1MOI)感染單層Marc-145細(xì)胞，48h后收獲病毒，提取病毒總RNA，進(jìn)行1％甲醛變性凝膠電泳，25v恒壓低溫電泳過夜。設(shè)計引物合成探針，設(shè)計的引物為：SNB041-F：5′-GTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′和SNB041-R：5′-GTAGTGGTTGTCGGGCAGCA-3′，參照BrightStar Psoralen-Biotin試劑盒(Ambion)的說明書地高辛標(biāo)記探針，標(biāo)記探針置-70℃保存?zhèn)溆谩?％甲醛變性凝膠電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取下膜作好標(biāo)記，在2×SSC中漂洗一次，利用紫外交聯(lián)系統(tǒng)紫外交聯(lián)30s。

隨后42℃雜交過夜，雜交后室溫下，20ml 2×SSC/0.1％SDS洗膜2×5min。65℃，20ml 1×SSC/0.1％SDS洗滌2×15min。用Washing buffer沖洗1-5分鐘，在100mL Blocking solution中孵育30分鐘，在20mL Antybody solution溶液中孵育30分鐘，用100mLWashing buffer洗滌兩次，每次15分鐘。在20mL Detection buffer中平衡2-5分鐘。最后將孵育膜放入盛有準(zhǔn)備好的2ml底物顯色液的盒子中避光。當(dāng)?shù)玫筋A(yù)期的聚焦強度，停止反應(yīng)，用TE-buffer50ml洗膜5min，結(jié)果用攝影記錄。

結(jié)果如圖3所示(圖3中：M代表分子量，1-6分別代表rHP-PRRSV/SD16/TRS2-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS3-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS4-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS5-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS6-EGFP、rHP-PRRSV/SD16/TRS7-EGFP)，結(jié)果顯示各實施例得到的熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒均能轉(zhuǎn)錄出EGFP，在720bp位置均有條帶(如圖3中箭頭所指位置)。(其中TRS2,TRS5,TRS6和TRS7調(diào)控序列的調(diào)控能力較強，TRS4調(diào)控序列略差，TRS3調(diào)控序列最弱)這就表明該綠色熒光蛋白穩(wěn)定存在于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因組中且能夠正確轉(zhuǎn)錄表達(dá)，穩(wěn)定性好。

綜上，本發(fā)明提供的帶熒光標(biāo)記的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建方法通過將各個轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和熒光標(biāo)記基因插入到豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性克隆N蛋白與3-UTR之間，通過轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞、傳代，構(gòu)建出可視化的熒光蛋白標(biāo)記的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒的生長特性與其親本病毒一致，感染Marc-145細(xì)胞后無需額外的免疫熒光試驗步驟，可通過熒光顯微鏡直接可視。且本發(fā)明的構(gòu)建方法操作難度小、可操作性強，能夠獲得穩(wěn)定的表達(dá)熒光蛋白的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒。本發(fā)明可用于修飾豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因組，由此可產(chǎn)生具有改進(jìn)性質(zhì)的、修飾過的豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其衍生的疫苗和診斷分析。本發(fā)明將為進(jìn)一步開展新型病毒疫苗研制及豬繁殖與呼吸綜合征病毒相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了有力工具。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120> 一種帶有熒光標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgaaccaac tttaggcctg aattgaa 27

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taaccatagt gtataatagt actttggatc aggtgtttgc cattttccca acccctggtt 60

cccggccaaa gcttcatgat tttcagca 88

<210> 3

<211> 236

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgaccagtg tctacgcctg gttggcgttc ctgtccttca gctacacggc ccagttccat 60

cccgagatat ttgggatagg gaatgtgagt cgaatttatg ttgacatcaa gcaccaattc 120

atctgcgctg ttcacgacgg ggataacgcc accttgcctc gccatgacaa tatttcagcc 180

gtatttcaga cctactacca acaccaggtc gacggcggca attggtttca cctgga 236

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attagcctgt ctttttgcca tcctactggc aatttgaatg ttcaagt 47

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttaaccaga gtttcagcgg aaca 24

<210> 6

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taaccacgca tttgtcgtcc ggcgtcccgg ctccactacg gtcaacggca cattggtgcc 60

cgggttgaaa agcctcgtgt tgggtggcag aaaagctgtt aagcagggag tggtaaacct 120

tgttaaat 128

<210> 7

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gccgccacc 9

<210> 8

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 9

<211> 676

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctc cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagact 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

atccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggactc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcgc cgagggccgc 660

caccacctgt tcctga 676