本發(fā)明屬于分子生物學
技術領域：
，具體涉及擬南芥基因REM16的表達載體及其在調控植株開花期中的應用。
背景技術：
：微絲解聚因子（ADF/cofilin）廣泛存在于真核細胞中，對維持細胞的形態(tài)結構、細胞運輸、能量轉換、信息傳遞、細胞分裂及分化等起著非常重要的作用。前期研究表明，擬南芥微絲解聚因子ADF1表達量變化會影響植物的開花期，ADF1表達量的降低導致開花延遲。野生型擬南芥約在35±1天開花，有17片蓮座葉；而ADF1基因沉默植株開花較野生型延遲2周，蓮座葉數(shù)目增加至26片。其后，人們通過基因敲除深入解析ADF在植物生長發(fā)育中的分子功能。擬南芥adf4突變體具有更長的下胚軸和表皮細胞。擬南芥ADF9的突變體（adf9-1，adf9-2）植株的頂端優(yōu)勢增強，其花序的二級分枝數(shù)目少于野生型，但分枝的長度比野生型長；長日照生長條件下突變體開花時間早于野生型，同時蓮座葉數(shù)目比野生型少，而短日照生長條件下跟野生型相比沒有明顯差異。此外，ADF9能調控開花轉換時期相關基因的表達量。這些研究表明，ADF蛋白直接參與植物生長發(fā)育及花期調控，但其調控的目標基因、參與的關鍵調控因子及分子調控機制等都不清楚。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了擬南芥基因REM16的表達載體及其在調控植株開花期中的應用。本發(fā)明以擬南芥ADF1為誘餌，通過酵母雙雜交從擬南芥cDNA文庫中篩選得到了十幾個ADF1互作蛋白分子，獲得本發(fā)明所述的基因REM16(基因編號為AT3G53310)，并通過實驗證明了其調控擬南芥花期的功能。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種擬南芥基因REM16的過表達載體pCambia1300-221-HA，所述過表達載體pCambia1300-221-HA的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:2所示，所述過表達載體含有如序列表SEQIDNo:1所示的基因REM16，所述過表達載體pCambia1300-221-HA用于調控擬南芥花期提前。進一步的：將基因REM16和帶有XbaI和KpnI酶切位點的pCambia1300-221-HA載體分別進行KpnI和XbaI的雙酶切，再按照基因片段和載體4：1的比例在T4連接酶的催化下進行16℃過夜連接20h制得。本發(fā)明提供了一種擬南芥基因REM16的基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0，所述基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:3所示，所述基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0用于調控擬南芥花期延遲。本發(fā)明還提供了擬南芥基因REM16在調控擬南芥開花期中的應用。進一步的：所述調控開花期的擬南芥中含有如序列表SEQIDNo:1所示的過表達載體pCambia1300-221-HA或如序列表SEQIDNo:2所示的基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0。進一步的：所述擬南芥基因REM16具有花期調控的功能，基因REM16過表達植株表現(xiàn)為早花性狀，基因REM16沉默植株表現(xiàn)為晚花性狀。進一步的：所述基因REM16過表達植株開花時間比野生型植株早4-6天，蓮座葉數(shù)目比野生型少2片；而所述基因REM16沉默植株開花時間比野生型植株晚2-3天，蓮座葉數(shù)目和野生型沒有顯著變化。進一步的：所述基因REM16過表達植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達量均高于野生型植株，春化途徑FLC的表達量低于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達量與野生型比沒有明顯差異。進一步的：所述基因REM16沉默植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達量均低于野生型植株，春化途徑FLC的表達量高于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達量與野生型比沒有明顯差異。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術，本發(fā)明通過花序侵染法的方法獲得擬南芥基因REM16的過表達和基因沉默轉基因載體及其轉基因株系，通過研究過表達和基因沉默轉基因植株表型，并將其與相同條件下生長的野生型植株開花時間及蓮座葉數(shù)目進行比較。經過實驗分析證明，擬南芥基因REM16(AT5G25520)具有花期調控的功能，過表達REM16基因引起轉基因擬南芥植株中開花相關基因表達變化而促進擬南芥提早開花，與野生型植株的開花時間相比表現(xiàn)為早花性狀；沉默REM16基因引起轉基因擬南芥植株中開花相關基因表達變化而延遲擬南芥開花，與野生型植株相比表現(xiàn)為晚花性狀。通過分析轉基因株系開花相關基因的表達從而確定REM16基因調控開花的功能。本發(fā)明的技術方案對于植物花期調控具有重要意義。附圖說明圖1為野生型與突變體REM16基因表達量分析（**：P<0.01）。圖2為野生型與突變體開花時間及蓮座葉比較，其中：(a)為野生型與突變體開花時間比較；(b)為野生型與突變體開花時間統(tǒng)計分析；(c)為野生型與突變體蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計分析(**：P<0.01)。圖3為野生型與突變體開花相關基因表達量分析(**：P<0.01)。具體實施方式下面結合附圖和具體實施例來對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細的說明。本發(fā)明實驗中用到的試劑等購自TAKARA、Promega、Sigma等公司。實驗中用到的LB培養(yǎng)基配方：0.5%酵母粉、1%NaCl、1%蛋白胨。其它試劑配方：見《分子克隆》第三版。實施例1、REM16基因的克隆1、擬南芥的種植擬南芥種子的表面消毒：將50粒待滅菌的擬南芥種子放入1.5ml離心管中，加入1ml75%的乙醇（含有0.03%體積比的TritonX-100）震蕩消毒1min，再用70%的乙醇震蕩消毒1min（兩次），最后用吸頭將種子吸到無菌濾紙上吹干，然后用無菌的牙簽將其點入1/2MS培養(yǎng)基中，冰箱中4℃春化3d后取出置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下：16h光照/8h黑暗交替光照，溫度22℃，光強100μmol·m-2·s-1。然后，待光照生長7-10天將擬南芥幼苗移到土中，覆蓋保鮮膜3-7天揭膜，后于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，條件同光照培養(yǎng)箱。2、擬南芥總RNA提取(1)將擬南芥材料放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過程中要保證材料浸在液氮中；(2)等液氮揮發(fā)后，立即將100-200mg植物粉末轉入到1.5ml離心管中，然后迅速加入1mlTrizol提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫放置5min；(3)4℃，12,000rpm，離心11min，將0.8ml上清液轉移到新的1.5ml離心管中；再加入0.2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec，室溫放置2-5min直到分層。(4)4℃，12,000rpm，離心11min，將0.4ml上清液轉移到新的1.5ml離心管中；再加入0.4ml異丙醇，上下翻轉15次混勻溶液，-20℃放置30mim。(5)4℃，12,000rpm，離心11min，棄上清，用0.9ml75%的乙醇洗滌沉淀兩次，4℃，12,000rpm，離心5min；(6)棄上清，開蓋于超凈工作臺中干燥RNA約2-5min，加入40μlRNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA10min；(7)用紫外分光光度計測RNA樣品的OD值和濃度，A260/A280達到1.8-2.0為佳；瓊脂糖凝膠電泳檢測的質量。3、RNA的反轉錄詳見TaKaRa的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒（RR047A）說明書。4、PCR擴增以上述反轉錄合成的cDNA為模板，PCR法擴增基因片段。(1)PCR引物由上海桑尼生物技術服務有限公司合成：引物REM16-For:5’-ATGGCTGACGATAGCGAAT-3’（SEQIDNo:4）；引物REM16-Rev:5’-TCAAGCATCTCTACGCAAGACATG-3’（SEQIDNo:5）。(2)PCR反應體系組分體積(μl)/管10×PCRBuffer2.5dNTPMixture1擬南芥cDNA3正向引物（10μΜ）1反向引物（10μΜ）1rTaq0.15ddH2O18.5總體積25PCR反應條件：94oC預變性5min；94oC變性30s，62oC退火30s，72oC延伸50s，27個循環(huán)；72oC延伸7min。5、PCR產物回收PCR反應后1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（110V17min），后在凝膠成像儀上觀察結果并拍照。然后參照TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0試劑盒說明書將PCR產物回收，回收到擬南芥基因REM16(AP2/B3-liketranscriptionalfactorfamilyprotein)，所述基因REM16CDS序列如序列表SEQIDNo:1所示。6、連接將以上回收得到的REM16基因片段通過TA克隆連接到克隆載體pMD18-TVector上，16oC過夜。連接體系如下：組分體積(μl)/管SolutionI5pMD18-TVector1DNA回收產物4總體積107、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備和轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備(1)DH5α菌種的活化：從-80℃超低溫冰箱中取出保存的DH5α菌種，劃線后37℃倒置培養(yǎng)；(2)挑取單菌落接種于10mLLB（-）液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)12h；(3)按1:100取接種于50mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600值為0.4-0.6；(4)將菌液轉移至50mL離心管中，冰上放置10min，4℃，2500g離心5min，棄上清；(5)加入20mL預冷的0.1MMgCL2懸浮菌體，4℃，2500g離心5min，棄上清；(6)加入50mL預冷的0.1MCaCL2懸浮菌體，冰浴20min，4℃，2500g離心5min，棄上清；(7)加入10mL預冷的0.1MCaCL2懸浮菌體，再加入1mL甘油充分混勻，每個EP管分裝100μL后用液氮速凍于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。轉化感受態(tài)細胞(1)從-80℃超低溫冰箱中取出感受態(tài)細胞于冰上融化，將10μL重組質粒加入到感受態(tài)細胞中，吸打混勻，冰浴30min；(2)42℃熱激90s，立即冰浴5min；(3)加入900μLLB（-）培養(yǎng)基，37℃，200rpm，1.5h；(4)4000g室溫離心5min，棄800μL上清，剩余液體重懸菌體，涂布于帶有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上，將平板于37℃正向放置30min至液體被吸收，倒置平板，于37℃培養(yǎng)12h過夜。8、重組質粒的獲得及鑒定將TA克隆后挑單菌落進行菌液PCR驗證，陽性菌液送樣到上海桑尼生物技術有限公司進行DNA測序驗證，將測序正確的菌液提取質粒用于后續(xù)實驗。實施例2、35S::REM16CDS表達載體構建1、目的基因的獲得引物設計及PCR反應的體系和條件：（1）以測序正確的重組質粒為模板，KpnI–REM16-For和XbaI-REM16Rev為引物PCR擴增861bp的REM16全長基因編碼（CDS）序列，所用引物序列如下：KpnI-REM16-For：5’-CGGGGTACCCCGATGGCTGACGATAGCGAAT-3’（SEQIDNo:6）；XbaI-REM16-Rev：5’-GCTCTAGAGCTCAAGCATCTCTACGCAAGACATG-3’（SEQIDNo:7）；PCR反應體系和條件同實施例1。2、表達載體的構建將上一步的膠回收產物和帶有XbaI和KpnI酶切位點的pCambia1300-221-HA載體分別進行KpnI和XbaI的雙酶切，再按照4:1的比例在T4連接酶的催化下進行過夜連接。反應體系及條件如下：酶切反應體系和條件：組分體積(μL)/管XbaI1KpnI110×Mbuffer2膠回收產物/載體8ddH2O8總體積2037℃溫育2.5h，然后分別將酶切產物回收。通過T4連接酶將目的基因REM16片段與雙元載體pCambia1300-221-HA16℃過夜連接20h，連接體系如下：組分體積(μL)/管10×T4DNAligaseBuffer2.5RTE4酶切回收產物4pCambia1300-221-HA酶切回收產物1T4DNAligase1ddH2O1.5總體積10連接完成后轉化大腸桿菌，然后挑單菌落搖菌提取重組質粒進行雙酶切和菌液PCR驗證，將含有重組質粒的陽性菌株送上海桑尼生物技術有限公司測序，得到的測序結果經過NCBIblast分析，陽性質粒中確實含有REM16的CDS序列。至此得到了35S::REM16CDS表達載體pCambia1300-221-HA（序列如SEQIDNo:2所示）。實施例3、REM16-RNAi載體構建1、含有固定接頭（attB1，attB2）的目的片段的獲得將測序正確的包含目的片段REM16基因的18-T重組質粒稀釋1000倍，以稀釋后的質粒為模板，按照上述克隆條件，以加attB接頭的上下游引物為引物，克隆目的片段。凝膠回收目的片段。2、BP重組反應體系和條件組分體積(μL)/管帶接頭的attB-PCR回收產物3pDONR221vector(150ng/μL)2BP酶2TEBuffer，PH8.0to1025℃培養(yǎng)20h，每個反應加入1μlProteinaseK，37℃水浴10min。轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落，菌液PCR驗證，提取陽性菌株質粒。3、LR重組反應體系和條件：組分體積(μL)/管Entryclone(上一步BP反應質粒)3pB7GWIWG2(II).0vector(150ng/μL)2LR酶2TEBuffer，PH8.0To1025℃培養(yǎng)20h，每個反應加入1μlProteinaseK，37℃水浴10min。轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落，菌液PCR驗證，提取陽性菌株質粒，即為擬南芥基因REM16的基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0（序列如SEQIDNo:3所示）。實施例4、擬南芥的轉化與轉基因植株的篩選1、農桿菌感受態(tài)細胞的制備(1)從超低溫冰箱中取保存的農桿菌GV3101菌液用接種環(huán)劃板活化，獲單菌落；(2)用接種環(huán)挑取單菌落，接種于5ml液體YEP（-）培養(yǎng)基中，28℃，200rpm培養(yǎng)12h；(3)將液體培養(yǎng)物接種到新的液體YEP（-）培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6；(4)將菌液冰浴0.5h，4℃，5000rpm，5min；(5)棄上清，用10mL0.15M預冷的NaCl懸浮菌體，4℃，5000rpm，5min；(6)棄上清，用10mL20mM預冷的CaCl2重懸菌體，分裝成200μl/管于1.5mL離心管中，用液氮中迅速冷凍后于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?、將構建好的載體轉化農桿菌GV3101（凍融法）(1)從-80℃超低溫冰箱中取出農桿菌感受態(tài)細胞于冰上慢慢融化，加入10μl重組質粒，冰浴0.5h，液氮中冷凍60s，后置于37℃水浴5min；(2)加入950μl液體YEP（-）培養(yǎng)基，28℃，200rpm，培養(yǎng)3h；(3)12000rpm，1min收集菌體，留取100μl上清液回溶菌體；(4)將菌液涂于LB（含抗生素）固體培養(yǎng)基上，先28℃正置培養(yǎng)0.5h，后倒置培養(yǎng)2-3天；(5)菌液PCR反應驗證。3、擬南芥的轉化參考Clough等人的擬南芥轉化的農桿菌介導的花浸染法。取驗證過的陽性克隆菌于含有50mg/l利福平（Rif）和相應抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、220rpm震蕩培養(yǎng)至OD600至1.0-1.8。6000rpm離心5min收集菌體，用含有5%蔗糖，0.04%SilwetL-77侵染液懸浮菌體，此時OD600在0.8左右。將擬南芥花序浸到侵染液中10-15s。然后將侵染好的擬南芥植株放入暗箱中上面覆膜保濕，暗培養(yǎng)24h后放于培養(yǎng)室中長日照培養(yǎng)。4、轉基因植物的篩選及鑒定將侵染獲得的第一代種子命名為T1代，將擬南芥種子經表面消毒后將鋪在1/2MS+30mg/l潮霉素(Hyg)或5mg/l草銨膦(PPT)培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱中春化處理3-4天，再于培養(yǎng)箱中16h光照/8h黑暗交替光照培養(yǎng)10天，陽性苗會一直存活并且顏色較綠，陰性苗會逐漸變黃致死。最后將陽性苗移栽到土中放于培養(yǎng)室中16h光照/8h黑暗交替光照培養(yǎng)至收獲T2代種子（單株收）。將收獲的T2代種子鋪抗性板進行純合體鑒定，若陽性苗與陰性苗比例為3:1則為純合株系，按照之前的篩選方法再將純合的陽性苗移苗到土壤中在培養(yǎng)室培養(yǎng)至收獲的T3代種子（單株收），在抗性平板上篩選培養(yǎng)，此時幼苗應該為全綠證明是純合體。在長日照生長10d的擬南芥幼苗，取幼苗提取總RNA經反轉錄得到cDNA，將cDNA稀釋五倍作為模板，經過熒光定量PCR技術的分析，實驗結果如圖1所示，REM16過表達植株中涉及REM16基因表達量顯著高于野生型植株，而REM16基因沉默植株中REM16基因表達量明顯低于野生型植株。實施例5、轉基因植株表型以及不同REM16表達量影響開花相關基因的分析1、開花時間及蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計分析選取長日照條件下（16h光照/8h黑暗）生長正常的擬南芥野生型（WT）植株與突變體植株各40株，進行開花時間及蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結果如圖2所示，由圖分析可知，生長至5周時，野生型（WT）擬南芥植株已完成由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變，花朵開放，蓮座葉數(shù)目大約為10片；REM16過表達植株開花時間比野生型早4-6天，蓮座葉數(shù)目比野生型少約2片；而REM16基因沉默植株開花時間比野生型晚2-3天，蓮座葉數(shù)目和野生型沒有顯著變化。由此確定擬南芥基因REM16(AT5G25520)具有花期調控的功能，過表達突變體表現(xiàn)為早花性狀，基因沉默突變體表現(xiàn)為晚花性狀。2、不同REM16基因的表達量影響開花相關基因表達的分析在長日照生長10d的擬南芥幼苗，取幼苗提取總RNA經反轉錄得到cDNA，將cDNA稀釋五倍作為模板，經過熒光定量PCR技術的分析，實驗結果如圖3所示，REM16過表達植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達量均高于野生型植株，春化途徑FLC的表達量低于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達量與野生型比沒有明顯差異，這與REM16過表達植株早花的表型相一致。REM16基因沉默植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達量均低于野生型植株，春化途徑FLC的表達量高于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達量與野生型比沒有明顯差異，這與REM16基因沉默植株晚花的表型相一致。以上證據表明REM16參與調控了部分開花相關基因的表達，并使得REM16過表達突變體表現(xiàn)為早花性狀，REM16基因沉默突變體表現(xiàn)為晚花性狀。以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明所要求保護的技術方案的精神和范圍。SEQUENCELISTING<110>青島農業(yè)大學<120>擬南芥基因REM16的表達載體及其在調控植株開花期中的應用<130><160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>861<212>DNA<213>人工序列<400>1atggctgacgatagcgaattgtatcctcgtttcttcaaagtgttcctcgttgaatcggct60tctgaatcgttgatgattccgttgccttttatggcatttcttgctgatccattgccaaag120acagtgaagctccaaggtcttggaggaaaactttggactgtgagcttgaagaaaataagc180ggagctgcgtatcttactagaggatggccaaaattcgcagaggaacatgagctgaagaac240ggagagttcatgacatttgtgtatgatggtcatcgtacctttgaagtgagtgtctttgat300cgttggggtagcaaagaggtcagagctgaaatacaagccataccactttctgattctgat360tctgattctgttgtggaagacgaaaaagactcaactgatgttgttgaagatgatgatgat420gaagatgaagatgaagatgaagatgatgatggtagctttgatgaagatgaagaaatcagc480cagagtctttatccgattgacgaagagactgcaaccgatgctgcagtttttgaagggaac540ttggacgtggaagctttaactaatccacactttccgactacgctcaagaacaggatttat600gaactgttgatcccagccaatgtggtgaaggataataaccttgaatttggttcatccatc660aagtacatcgatggagaaggaaccttagtagggctaagaggaaaatgggctgataagagg720gtttgcttcaaaggatgggacaggatttgcagaaggaacaggctcaaaaagcaccaagat780actgtcgaatgcgagcttcttcatgatgaccagaagatggttcattccatccgagtccat840gtcttgcgtagagatgcttga861<210>2<211>10221<212>DNA<213>人工序列<400>2gaattcccgatctagtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcg60ctatattttgttttctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaac120ccatctcataaataacgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaa180cagaaattatatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaacttta240ttgccaaatgtttgaacgatcggggaaattcgagctcactagtggatcctcactaaagac300tagcataatctggaacatcataaggatacatcaatgatgcgtagtcaggcacgtcgtatg360ggtacataagactagcataatctggaacatcataaggatagcccccggggtcgacggtac420cccgctcgacgcgcctcgagatc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