一種用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒的制作方法

文檔序號：12644802閱讀：1652來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及一種用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒。

背景技術(shù)：

酵母細胞表面展示抗體庫技術(shù)被廣泛使用，但仍存在兩個問題，第一，由于酵母細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率較低，在酵母中構(gòu)建抗體庫的容量小于噬菌體展示抗體庫的容量，同時酵母展示技術(shù)依賴于流式分選，對能操作的文庫大小也有一定限制；第二，現(xiàn)有酵母系統(tǒng)一般展示scFv，但scFv不夠穩(wěn)定易失活；第三，F(xiàn)ab抗體相對穩(wěn)定，但篩選難度大，過程復(fù)雜，需要分別表達Fab的重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，目前主要通過分別攜帶有Fab重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)的不同配型的酵母細胞交配在酵母表面展示完整的Fab抗體。該方法除費時費力缺點外，易殘留只展示Fab抗體重鏈區(qū)的酵母細胞，干擾Fab抗體的篩選或改造。而scFv轉(zhuǎn)化為全長IgG時對抗原的親和力會變?nèi)跎踔潦Щ睢?/p>

參考文獻：

1、Steinwand M,Droste P,Hust M,et al.The influence of antibody fragment format on phage display based affinity maturation of IgG[J].Mabs,2013,6(1):204-218.

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服上述問題，提供一種用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠使單個酵母細胞同時表達抗體Fab片段的輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)，與利用酵母細胞交配篩選抗體Fab片段相比，特異性高，簡單易操作，省時省力，節(jié)約成本。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒，其特征在于，其序列包含酵母GAL1/GAL10雙向啟動子、以GAL10為啟動子表達Fab抗體的輕鏈區(qū)和以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)，其中，所述的以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)與Aga2相融合。

優(yōu)選地，所述的以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)位于Aga2的C端或N端。

優(yōu)選地，所述的用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒的序列還包含Aga2引導(dǎo)序列，以GAL10為啟動子表達Fab抗體的輕鏈區(qū)和以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)之前都各帶有一段Aga2引導(dǎo)序列。

優(yōu)選地，所述的用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒的序列還包含酵母營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記TRP1、引導(dǎo)單鏈DNA復(fù)制啟動子、酵母ADH1終止子、Aga2ORF(a-凝集素亞基2開放閱讀框)，HA標(biāo)簽、C-Myc標(biāo)簽、酵母CYC1終止子、pUC原核細胞復(fù)制啟動子、Ampicillin resistance(bla)ORF(氨芐青霉素抗性開放閱讀框)和酵母復(fù)制啟動子。

優(yōu)選地，所述的用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒的序列還包含位于以GAL10為啟動子表達Fab抗體的輕鏈區(qū)兩端的PacI和SacI酶切位點和位于以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)兩端的XhoI和SpeI酶切位。

優(yōu)選地，所述的用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒的序列還包含EcoRI、BamHI和NheI等酶切位點。

優(yōu)選地，所述的用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒的序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明使單一酵母細胞同時表達Fab抗體的重鏈和輕鏈，且二者等量表達，形成完整的異二聚體Fab抗體片段，避免了單個Fab重鏈區(qū)展示在酵母表面影響Fab抗體篩選的特異性。

2、本發(fā)明可以將噬菌體展示抗體庫技術(shù)和酵母展示抗體庫技術(shù)有效集成在一起，從而先按照傳統(tǒng)親和力成熟方法，構(gòu)建超大庫容(多樣性>10¹⁰)的噬菌體展示抗體Fab突變庫，并進行一輪“淘選”，初步富集與抗原結(jié)合的抗體；之后，將富集的抗體通過亞克隆構(gòu)建到本發(fā)明質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)化到酵母中，較小庫容(105多樣性)的酵母展示抗體Fab突變庫即可以覆蓋所有富集的抗體的多樣性，接下來應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的酵母展示技術(shù)進行抗體的親和力成熟改造，進行半定量篩選具有高親和力或特殊性質(zhì)的抗體亞群。該操作結(jié)合了噬菌體展示的大庫容、操作方便和酵母展示抗體庫技術(shù)的半定量篩選的優(yōu)點。

附圖說明

圖1為用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒圖譜；

圖2為實施例2中用流式細胞儀于561nm激光激發(fā)檢測酵母細胞熒光強度圖。

圖3為ELISA檢測噬菌體展示系統(tǒng)中Fab抗體與抗原的結(jié)合圖。

圖4為pcome3xss質(zhì)粒圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

本實施例的用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒pYD-AH vector的圖譜如圖1中A所示，本實施例的用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒pYD-HA vector的圖譜如圖1中B所示。質(zhì)粒pYD-AH vector和pYD-HA vector的序列包含酵母GAL1/GAL10雙向啟動子、以GAL10為啟動子表達Fab抗體的輕鏈區(qū)和以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)，其中，所述的以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)與Aga2相融合。

所述的質(zhì)粒pYD-AH vector和pYD-HA.vector的序列具體包含：

1、Yeast TRP1selection marker ORF(TRP1)：酵母營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記TRP1。

2、f1origin of ss-DNA replication(f1ori)：引導(dǎo)單鏈DNA復(fù)制啟動子。

3、Yeast ADH1terminator(T ADH1)：酵母ADH1終止子。

4、Fab L chain：以GAL10為啟動子表達Fab抗體的輕鏈區(qū)(含一個可變區(qū)和一個保守區(qū)段)。

5、Fab H chain：以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)(含一個可變區(qū)和一個保守區(qū)段)。對于質(zhì)粒pYD-AH vector，以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)位于Aga2的C端，對于質(zhì)粒pYD-HA vector，以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)位于Aga2的N端。

6、Yeast GAL1/GAL10divergent promoters(P GAL1/P GAL10)(酵母GAL1/GAL10雙向啟動子)：GAL1/10是酵母雙向啟動子，利用這個雙向啟動子可以在一個質(zhì)粒中同時表達兩種蛋白。本發(fā)明利用這一特殊啟動子實現(xiàn)Fab抗體重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)的共表達。GAL1/GAL10啟動子在SG培養(yǎng)基(合成葡萄糖基本培養(yǎng)基)中被抑制，在SG培養(yǎng)基(合成半乳糖基本培養(yǎng)基)中被啟動。

7、Aga2leader sequence(L Aga2)：Aga2引導(dǎo)序列，以GAL10為啟動子表達Fab抗體的輕鏈區(qū)和以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)之前都各帶有一段Aga2引導(dǎo)序列。

8、Aga2ORF(Aga2)：(a-凝集素亞基2開放閱讀框)表達Aga2用于在酵母表面展示抗體。

9、HA tag：HA標(biāo)簽。

10、C-Myc tag(Myc tag)：C-Myc標(biāo)簽。

11、Yeast CYC1terminator(T CYC1)：酵母CYC1終止子。

12、pUC origin of replication(pUC ori)：pUC原核細胞復(fù)制啟動子，用于質(zhì)粒在大腸桿菌中的擴增。

13、Ampicillin resistance(bla)ORF(AmpR)：(氨芐青霉素抗性開放閱讀框)質(zhì)粒載體具備氨芐青霉素抗性，用于在大腸桿菌中的篩選。

14、2μyeast origin of replication(2μori)：酵母復(fù)制啟動子。

15、多克隆位點：包括位于以GAL10為啟動子表達Fab抗體的輕鏈區(qū)兩端的PacI和SacI酶切位點和位于以GAL1為啟動子表達Fab抗體的重鏈區(qū)兩端的XhoI和SpeI酶切位點。如圖4所示，質(zhì)粒pYD-AH vector和pYD-HA vector用于克隆抗體輕鏈和重鏈的酶切位點與常用噬菌體展示抗體Fab的載體pcome3xss一致，因此抗體基因可以方便的在噬菌體展示系統(tǒng)和酵母展示系統(tǒng)之間通過亞克隆方便切換。另外質(zhì)粒上也有EcoRI、BamHI、NheI等常用多克隆位點。

所述的質(zhì)粒pYD-AH vector和pYD-HA vector的具體序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。質(zhì)粒各元件序列信息從NCBI基因庫中獲得。其制備方法為：按照質(zhì)粒具體序列，拼裝后送基因合成公司上海捷瑞生物工程有限公司按照常規(guī)方法進行全序列合成；將合成的質(zhì)粒按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(天跟生化科技有限公司，CB101)進行擴增，將擴增后的質(zhì)粒送基因測序公司鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行測序，測序確認(rèn)后保存相應(yīng)質(zhì)粒，以備后續(xù)使用。

實施例2

為檢測實施例1中的質(zhì)粒pYD-AH vector和pYD-HA vector是否能夠在酵母展示篩選系統(tǒng)中正確展示Fab抗體，以血小板生成素受體(Thrombopoietin Receptor,TpoR)抗體3D9(該抗體記載在WO 2014/035693A2中，其輕鏈區(qū)序列為SEQ ID NO:3，重鏈區(qū)序列為SEQ ID NO:4)和人類表皮生長因子受體2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,Her2，又名c-erb2)抗體4D5為例進行驗證。具體步驟為：

(1)按照質(zhì)粒圖譜說明將3D9輕鏈區(qū)利用限制性內(nèi)切酶PacI和SacI(NEB)亞克隆到質(zhì)粒pYD-AH vector中：

將3D9輕鏈區(qū)5’端和3’端分別添加限制性內(nèi)切酶位點PacI(序列ttaattaa)和SacI(序列g(shù)agctc)，并送基因合成公司上海捷瑞生物工程有限公司按照常規(guī)方法進行全序列合成，用PacI和SacI限制性內(nèi)切酶(NEB)按照操作說明在37℃條件下分別對質(zhì)粒載體pYD-AH vector和插入片段3D9輕鏈區(qū)酶切2小時，將載體和插入片段進行DNA凝膠電泳以分離酶切后的片段，然后用凝膠回收試劑盒(Mscherey-nagel,MNG-740609.250)按照試劑盒使用操作手冊回收載體和插入片段,并用T4連接酶(NEB，M0202)按照操作說明將二者在16℃條件下連接過夜，接著將該連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化進DH5α細胞(天跟生化科技有限公司，CB101)，挑選克隆接種培養(yǎng)后送鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序，確定正確的克隆，命名為pYD-AH-TpoR Antibody-L chain。繼而在3D9重鏈區(qū)的5’端和3’端分別添加限制性內(nèi)切酶位點XhoI(序列ctcgag)和SpeI(序列actagt)并送基因合成公司上海捷瑞生物工程有限公司按照常規(guī)方法進行全序列合成，利用限制性內(nèi)切酶XhoI和SpeI(NEB)按照操作說明在37℃條件下酶切質(zhì)粒載體pYD-AH-TpoR Antibody-L chain和插入片段3D9重鏈區(qū)，將載體和插入片段進行DNA凝膠電泳以分離酶切后的片段，然后用凝膠回收試劑盒(Mscherey-nagel, MNG-740609.250)按照試劑盒使用操作手冊回收載體和插入片段,并用T4連接酶(NEB，M0202)按照操作說明將二者在16℃條件下連接過夜，接著將該連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化進DH5α細胞(天跟生化科技有限公司，CB101)，挑選克隆接種培養(yǎng)后送鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序，確定正確的克隆，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pYD-AH-TpoR Antibody 3D9。

(2)按照與(1)相同的亞克隆步驟，將3D9輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)克隆到載體pYD-HA中，命名為pYD-HA-TpoR Antibody 3D9；將4D5輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)(4D5輕鏈區(qū)序列為SEQ ID NO:5，重鏈區(qū)序列為SEQ ID NO:6，該抗體記載在US5821337中)分別克隆到載體pYD-AH和pYD-HA中，分別命名為pYD-AH-Her2Antibody 4D5和pYD-HA-Her2Antibody 4D5。

(4)按照文獻描述方法制備釀酒酵母EBY100電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(Ginger Chao，Wai L Lau，Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display,nature protocols,第9到第10頁)。

(5)將(2)獲得的重組質(zhì)粒按照文獻描述的方法分別轉(zhuǎn)化進釀酒酵母EBY100電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。(Ginger Chao，Wai L Lau，Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display,nature protocols,第9到第10頁)。

(6)將電轉(zhuǎn)化后的酵母移至30℃預(yù)熱的YPD培養(yǎng)基(Amreseco,J903)中，200rpm、30℃條件下培養(yǎng)一小時，2500g離心，棄上清，將離心獲得產(chǎn)物重懸于1ml Tpr-營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(Clontech，ST0041)中，取10μl重懸酵母菌液涂布在固體Tpr-營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)平板上30℃條件下靜置培養(yǎng)2天，獲得單克隆酵母株。

(7)將單克隆酵母株在SD培養(yǎng)基(配方見Ginger Chao，Wai L Lau，Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display,nature protocols,第3頁)中30℃、200rpm條件下培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)菌液在2500g條件下離心,去掉上清，繼而將酵母在SG誘導(dǎo)培養(yǎng)基(配方見Ginger Chao，Wai L Lau，Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display,nature protocols,第3頁)中重懸至密度為1OD，體積為5ml。然后將酵母在20℃,200rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時后，各取1*10⁸酵母在1.5mL離心管中以離心力14000g離心，去掉上清，用1ml預(yù)冷至4℃的PBS緩沖液重懸，離心后再次重懸在1ml預(yù)冷至4℃的PBS 緩沖液中，然后分別加入2μl生物素(EZ-Link NHS-PEG4-Biotin,No-Weigh Format,Thermo,Cat.21329)標(biāo)記的TpoR(R&D,Cat.4444-TR)和Her2(R&D,Cat.1129-ER)，即Biotin-TPOR和Biotin-Her2(濃度0.5μg/mL)，在室溫條件下孵育1小時。

(8)將(7)孵育后的產(chǎn)物用預(yù)冷至4℃的PBS緩沖液洗三遍，然后重懸于1ml預(yù)冷至4℃的PBS緩沖液中。加入二抗SAPE(Streptavidin R-PHYCOERYTHRIN conjugated,thermo,21627)，室溫孵育半小時。用預(yù)冷的PBS洗三遍后，重懸于1ml預(yù)冷的PBS中，置于冰上。

(9)用流式細胞儀于561nm激光激發(fā)檢測酵母細胞熒光強度。

如圖2所示，細胞流式結(jié)果顯示，pYD-AH和pYD-HA質(zhì)粒系統(tǒng)均可以使Fab 3D9和Fab 4D5抗體在酵母展示系統(tǒng)中正確表達，并且能夠與對應(yīng)抗原TPOR和Her2特異性的結(jié)合，不會產(chǎn)生非特異性結(jié)合，說明兩套酵母展示質(zhì)粒pYD-AH和pYD-HA均可以正確展示Fab類抗體。

實施例3

構(gòu)建并檢測與pYD-AH/pYD-HA質(zhì)粒系統(tǒng)多克隆位點一致的Fab抗體噬菌體展示質(zhì)粒：

(1)將噬菌體抗體展示文庫常用質(zhì)粒pcome3xss的酶切位點改造成與pYD-AH和pYD-HA質(zhì)粒系統(tǒng)一致的酶切位點，并將Fab 3D9和Fab 4D5分別構(gòu)建進pcomb3xss質(zhì)粒。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進Xl-1blue細胞中，生產(chǎn)出展示有抗體Fab 3D9、ScFv 3D9(圖3.A)、Fab 4D5、ScFv 4D5(圖3.B)的噬菌體；

具體操作是：將0.1-50ngpcomb3xss質(zhì)粒(addgene,Plasmid#63890)轉(zhuǎn)入1管的XL1-BLUE感受態(tài)細胞(XL1-Blue Competent Cells，Agilent Stratagene，200249)，冰上孵育30分鐘，在42℃水浴鍋中熱激45秒，再冰浴超過2分鐘，加預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基(SOC Outgrowth Medium，NEW ENGLAND BioLabs，3681505)0.9ml并在37℃培養(yǎng)箱中以250rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)1小時，將菌液(<200μl)涂到細胞培養(yǎng)板SB-Agar培養(yǎng)基上[該培養(yǎng)基由Super Broth(Teknova,Inc)添加Agar(Amresco,2885c049,按25g/L添加)制得]，37℃靜置培養(yǎng)過夜。挑單克隆并搖5mlSB培養(yǎng)基[該培養(yǎng)基由Super Broth(同上)添加脫水右旋葡萄糖((Amresco,0188-1KG)制得，右旋葡萄糖終濃度為2％)，同時加入50μl羧芐青霉素(Amresco，J358-250MG，工作濃度為100μg/ml)和10μl四環(huán)素(Amersco,E709，工作濃度為10ug/ml)]，在37℃培養(yǎng)箱中以250rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜。第二天轉(zhuǎn)接到5mlSB培養(yǎng)基(配方及抗生素加入情況同上)至OD為0.1，在37℃培養(yǎng)箱中以250rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2-3個小時至OD值為0.5-0.6。加入50μl輔助噬菌體(VCSM13Interference-Resistant HelperPhage Agilent，200251，噬菌體滴度10¹³/ml)并在37℃培養(yǎng)箱中靜置30分鐘，期間每隔10分鐘，輕搖一次。然后在37℃培養(yǎng)箱中搖1.5h，接著以3000rpm的轉(zhuǎn)速4℃條件下離心15分鐘，棄去上清，用SB培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心并棄去上清。加適量SB培養(yǎng)基(同上)重懸，測量OD值。最終培養(yǎng)在5ml SB培養(yǎng)基中[配方同上，另外添加50μl羧芐青霉素(同上)，140μl卡那霉素(KANAMYCIN SULFATE,25MG/ML，Amresco,E710，工作濃度為50ug/mL)，10μl四環(huán)素(同上)]，OD調(diào)為0.8。在30℃條件下，250rpm搖床中培養(yǎng)過夜。次日以5000rpm于4℃條件下離心15分鐘并收集上清，取上清用于ELISA實驗。

(2)以ELISA方法檢測噬菌體是否正確展示了相應(yīng)抗體，并以噬菌體展示ScFv 3D9和ScFv 4D5分別作為各自Fab抗體的對照，具體步驟為：分別取TpoR(A)蛋白(Tpo R,R&D SYSTEM,QXN0416011)，或Her2(B)(Her2,R&D SYSTEM,FXR0915011)兩種抗原50ng及25μl CBS緩沖液(CBS，Sigma,SLBJ-3659V)加入96孔板(Costar Assay Plate,Corning Incorporated，19115015)每種抗原進行三組重復(fù)實驗，另外還有兩組對照，室溫結(jié)合1小時即可。用PBST緩沖液(由PBS與Tween 20混合構(gòu)成，其中Tween 20的濃度為1％,PBS,Amersco,E504,Tween 20,amersco,0777)沖洗三遍，并在紙上拍干。每次洗板要避免孔干導(dǎo)致蛋白變性。每孔加100μL 5％Milk-PBST(Milk,BD,3106120)進行封閉，37℃封閉1小時。然后分別加入45μL的展示有抗體Fab 3D9、ScFv 3D9(A)、Fab 4D5、ScFv 4D5(B)的噬菌體上清并在37℃條件下孵育1小時，兩種噬菌體互為陰性對照，繼而用PBST洗滌未結(jié)合噬菌體，然后每孔加入50μlHRP偶聯(lián)的抗M13抗體(1：5000在Milk-PBST進行稀釋)(HRP/ANTI-M13MONOCLNL CONJUG.GE,9597716)在37℃條件下孵育40分鐘，用PBST洗滌之后加入50μl底物ABTS(ABTS solution,Roche,11734200)顯色并在405nm波長下測定光吸收值(OD405)。**P<0.01vs.對照組；#P<0.05,##P<0.01vs.Fab抗體噬菌體組。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，兩兩比較采取LSD方法。

如圖3所示，ELISA結(jié)果顯示噬菌體都可以正確展示3D9和4D5的Fab抗體，且能夠與相應(yīng)抗原TpoR和Her2結(jié)合，但Fab類抗體與抗原的結(jié)合強度低于ScFv類抗體，特別是Fab 3D9。該結(jié)果說明改造后噬菌體展示質(zhì)粒pcome3xss可以正確展示Fab抗體。

<110>上?？萍即髮W(xué)

<120>一種用于酵母表面展示抗體Fab片段的質(zhì)粒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6955

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240

atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300

aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360

gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420

tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480

atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540

cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600

agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660

atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720

ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780

ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840

actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900

attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960

gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020

atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080

agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140

aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1200

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1260

ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1320

atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1380

gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1440

gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1500

aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1560

ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1620

gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1680

ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1740

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctgaattgga gcgacctcat gctatacctg 1800

agaaagcaac ctgacctaca ggaaagagtt actcaagaat aagaattttc gttttaaaac 1860

ctaagagtca ctttaaaatt tgtatacact tatttttttt ataacttatt taataataaa 1920

aatcataaat cataagaaat tcgcttattt agaagtgtca acaacgtatc taccaacgat 1980

ttgacccttt tccatctttt cgtaaatttc tggcaaggta gacaagccga caaccttgat 2040

tggagacttg accaaacctc tggcgaagaa ttgttaatta atctagaatt aacactctcc 2100

cctgttgaag ctctttgtga cgggcgaact cagggagctc tgctaaaact gaagcaataa 2160

cagaaaatat tgaaaaacag cgaagtaact gcatgaattc gaattttcaa aaattcttac 2220

tttttttttg gatggacgca aagaagttta ataatcatat tacatggcat taccaccata 2280

tacatatcca tatacatatc catatctaat cttacttata tgttgtggaa atgtaaagag 2340

ccccattatc ttagcctaaa aaaaccttct ctttggaact ttcagtaata cgcttaactg 2400

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taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc aaatgtaata aaagtatcaa 2820

caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg agaaaaaacc ccggatccat 2880

gcagttactt cgctgttttt caatattttc tgttattgct tcagttttag cacaggaact 2940

gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt actctttgtc 3000

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gatccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt 3420

tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc 3480

tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg 3540

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ggattagtct catccttcaa tgctatcatt tcctttgata ttggatcata ttaagaaacc 6900

attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 6955

<210> 2

<211> 6961

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2