本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種膜蛋白MscL融合載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

生物膜離子通道是各種無機離子跨膜被動運輸?shù)耐?。離子通道的開放和關(guān)閉，稱為門控，根據(jù)門控機制的不同，離子通道分為電壓門控性，配體門控性，和機械門控性。

機械門控性，即機械敏感性離子通道(Mechanosensitive，MS)是指一類感受細胞膜表面應(yīng)力變化，實現(xiàn)胞外機械信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通道，根據(jù)通透性分為離子選擇性和非離子選擇性通道，根據(jù)功能作用分為張力激活型和張力失活型離子通道。當(dāng)活細胞和有機體受到環(huán)境中的機械刺激時，機械信號隨即轉(zhuǎn)化成生物信號，使細胞作出反應(yīng)，此過程被稱為機械轉(zhuǎn)導(dǎo)。生物體對機械刺激產(chǎn)生反應(yīng)和適應(yīng)的能力在許多生理現(xiàn)象中表現(xiàn)重要作用，例如聽覺和平衡的產(chǎn)生、體液平衡和血壓、多精受精的防止、細胞體積和形狀調(diào)控、細胞移動、組織生長和形態(tài)發(fā)生等。機械刺激包括高頻震動、滲透壓的變化、靜水壓和液體的剪切力等。機械信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有多種途經(jīng)，每種途徑都能篩選出相關(guān)的刺激和過濾掉無關(guān)的刺激。在機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，機械敏感性離子通道(mechanosensitive channel)起了很重要作用。

根據(jù)導(dǎo)電能力的大小，機械敏感性離子通道又分為兩種：一是高導(dǎo)電機械敏感性離子通道(The mechanosensitive channel of large conductance，MscL)，二是低導(dǎo)電械敏感性離子通道(The mechanosensitive channel of small conductance，MscS)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種膜蛋白MscL融合載體，所述融合載體中的膜蛋白MscL的表達量及其穩(wěn)定性顯著提高，同時載體中嵌入了GFP蛋白的基因片段，實現(xiàn)了膜蛋白MscL的可視化表達。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

一種膜蛋白MscL融合載體，為依次將MscL蛋白和GFP蛋白的基因片段嵌入pET-28a質(zhì)粒中形成的全長序列為SEQ NO.7的融合載體。

進一步地，本發(fā)明還提供上述膜蛋白MscL融合載體的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

步驟1，構(gòu)建機械敏感通道蛋白MscL融合載體：PCR擴增得到上游含有Nde I限制性核酸內(nèi)切酶位點，下游含有Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶位點的機械敏感通道蛋白MscL的cDNA，雙酶切MscL的cDNA和pET28a載體，連接反應(yīng)得到pET28a-MscL-His載體。

步驟2，構(gòu)建水母綠色熒光蛋白GFP融合載體：PCR擴增得到上游含有Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶位點，下游含有Not Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶位點的綠色熒光蛋白GFP的cDNA，雙酶切GFP的cDNA和pET28a-MscL-His載體質(zhì)粒，連接反應(yīng)得到pET28a-MscL-GFP-His載體；

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下顯著效果：

(1)本發(fā)明的膜蛋白MscL融合載體能夠表達水母綠色熒光蛋白GFP，表達目的蛋白的菌體和常規(guī)菌體在顏色上有明顯差異，能夠?qū)崿F(xiàn)可視化表達，可以直觀看到膜蛋白MscL是否正確表達，簡化后續(xù)的驗證；

(2)與常規(guī)表達相比，膜蛋白MscL的產(chǎn)量有明顯提高，產(chǎn)量提高了近20倍，為后續(xù)研究提供了充足的樣品；

(3)與常規(guī)表達相比，表達得到的膜蛋白MscL的穩(wěn)定性顯著增強。

附圖說明

圖1為MscL PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

圖2為pET28a-MscL-His質(zhì)粒圖譜。

圖3為GFP PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

圖4為pET28a-MscL-GFP-His質(zhì)粒圖譜。

圖5為anti-His Western Blot驗證實驗結(jié)果圖。

圖6為融合表達MscL-GFP菌體(a)和常規(guī)菌體(b)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳述。本發(fā)明實施例中的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識。

實施例中所用材料如下：

1.細胞來源

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)細胞購自武漢靈淼生物公司。

2.表達載體來源

pET28a購自MERK公司

3.引物來源

合成引物均來自上海生工生物有限公司

4.主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Tris-baes均購自Sigma公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自Thermo Fisher公司；rTaq酶、T4連接酶購自Takara公司。質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。兔源Anti-His mAb購自CST公司，兔抗HRP標記二抗購自Jackson公司；顯影液及定影液購自Tanon公司。

實施例1

構(gòu)建機械敏感通道蛋白MscL融合載體：

(1)下游檢索NCBI數(shù)據(jù)庫得到大腸桿菌機械敏感通道蛋白MscL的基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計1對引物。上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。根據(jù)pET28a質(zhì)粒的多克隆位點特點，在MscL上游設(shè)計引入Nde I限制性核酸內(nèi)切酶位點，下游設(shè)計引入Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶位點。以大腸桿菌基因組DNA為模板，經(jīng)過聚合酶鏈式反應(yīng)得到MscL的cDNA。

(2)回收MscL的cDNA，用Nde Ⅰ和HindⅢ雙酶切回收產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒，后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物；將回收的MscL的cDNA和pET28a質(zhì)粒線性片段，按濃度比為3:1比例加入小離心管中，加入T4連接酶，在22℃下連接2h。

(3)以上連接產(chǎn)物取20μL用42℃熱激法轉(zhuǎn)化入100μL DH5α感受態(tài)細胞，加入700μL LB培養(yǎng)基后置于37℃搖床，在200轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)45分鐘。

(4)上述菌液在4000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心1分鐘后，吸去700μL上清；用移液器輕輕吹吸剩余培養(yǎng)基后涂布在含有卡那霉素的LB固體平板上，倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12小時。

(5)挑取上述平板中的單菌落，小量擴增后提取質(zhì)粒，用Nde Ⅰ和HindⅢ單酶切雙酶切所提取質(zhì)粒后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)測序鑒定正確后，得到pET28a-MscL-His載體如圖2所示。酶切驗證結(jié)果如圖1所示。

實施例2

構(gòu)建水母綠色熒光蛋白融合載體：

(1)構(gòu)建水母綠色熒光蛋白GFP融合載體：根據(jù)上步得到的pET28a-MscL-His載體，設(shè)計引物。上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。根據(jù)pET28a-MscL-His載體的多克隆位點特點，在GFP片段的上游設(shè)計引入Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶位點，下游設(shè)計引入Not Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶位點。在GFP末端無終止子的情況下，可引入pET28a本身所帶的His標簽。經(jīng)過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，得到GFP的cDNA。

(2)回收水母綠色熒光蛋白GFP的cDNA，用Hind Ⅲ和Not Ⅰ雙酶切回收產(chǎn)物和pET28a-MscL-His載體，后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物；將回收的GFP的cDNA和pET28a-MscL-His載體線性片段，按濃度比為3:1比例加入小離心管中，加入T4連接酶，在22℃下連接2h。

(3)以上連接產(chǎn)物取20μL用42℃熱激法轉(zhuǎn)化入100μL DH5α感受態(tài)細胞，加入700μL LB培養(yǎng)基后置于37℃搖床，在200轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)45分鐘。

(4)上述菌液在4000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心1分鐘后，吸去700μL上清；用移液器輕輕吹吸剩余培養(yǎng)基后涂布在含有卡那霉素的LB固體平板上，倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12小時。

(5)挑取上述平板中的單菌落，小量擴增后提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和Not Ⅰ單酶切雙酶切所提取質(zhì)粒后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)測序鑒定正確后，得到pET28a-MscL-GFP-His載體如圖4。酶切驗證結(jié)果如圖3所示。

實施例3

表達菌株的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達：

(1)將鑒定正確的pET28a-MscL-GFP-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達宿主BL21(DE)得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的單菌落；接種單菌落到含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在200轉(zhuǎn)/分鐘、37℃下培養(yǎng)過夜，得到過夜菌。將過夜菌接種到TB培養(yǎng)基中，接種比例為1:200，在230轉(zhuǎn)/分鐘，30℃下培養(yǎng)至OD₆₀₀達到0.8-1.0，加入終濃度為0.1mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，后16℃培養(yǎng)18小時。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘收集菌體。將菌體重懸于PBS緩沖液中，后經(jīng)過4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，即得到表達MscL-GFP-His的菌體。

(2)超聲破碎得到的融合蛋白MscL-GFP-His菌體。超聲時間為15分鐘，超聲2秒，間隔4秒，超聲功率為60W。后將超聲后的菌體在10,000g，4℃下離心45分鐘，收集上清，得到全蛋白組分；將上清于100,000g，4℃下離心2小時，收集沉淀就可以得到包含目的蛋白的膜蛋白樣品。

(3)Anti-His Western Blot分析融合蛋白分布：

(a)收集的融合蛋白全蛋白組分和可溶性組分，取10μL樣品，加入10μL 2×上樣緩沖液，于75℃孵育10分鐘，冷卻后于12,000g離心5分鐘，點樣15μL；先在90伏下跑膠30分鐘，后改為150伏，跑膠50分鐘。

(b)濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜使用硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒流0.3A，時間為75分鐘；轉(zhuǎn)膜完成后，將硝酸纖維素膜取出，用TBST潤洗10秒，后置于5％脫脂牛奶中封閉1小時。

(c)封閉后的硝酸纖維素膜置于抗體孵育帶中，4℃孵育過夜；后將膜取出，用TBST潤洗4次，每次5分鐘；將潤洗后的膜置于抗體孵育帶中，加入HRP標記的二抗，室溫下孵育1小時；后取出膜，用TBST潤洗4次，每次5分鐘。等量混合顯影液和定影液，均勻涂布在膜上，在CCD下曝光，得到結(jié)果。如圖5所示，分析驗證目的蛋白的正確表達，目的蛋白大小在40k左右。

結(jié)果表明，得到的融合機械敏感通道蛋白產(chǎn)量與常規(guī)表達相比，提高了近20倍，為后續(xù)研究提供了充足的樣品；樣品的穩(wěn)定性有明顯增強。同時，如圖6所示，A為表達融合機械敏感通道蛋白的菌體，B為常規(guī)菌體，兩者在外觀上有明顯差異，前者顏色淡而綠后者顏色深而黃，說明表達了融合載體的菌體與常規(guī)菌體呈現(xiàn)出顏色差異，可以減少后續(xù)驗證試驗。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京理工大學(xué)

<120> 一種膜蛋白MscL融合載體及其構(gòu)建方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq No.1

<400> 1

aggcatatga tgagcattat taaagaattt c 31

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq No.2

<400> 2

tccaagcttt taagagcggt tattctg 27

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq No.3

<400> 3

aggaagctta gcattattaa agaatttcgc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq No.4

<400> 4

aggaagctta gcattattaa agaatttcgc 30

<210> 5

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MscL

<400> 5

atgagcatta ttaaagaatt tcgcgaattt gcgatgcgcg ggaacgtggt ggatttggcg 60

gtgggtgtca ttatcggtgc ggcattcggg aagattgtct cttcactggt tgccgatatc 120

atcatgcctc ctctgggctt attaattggc gggatcgatt ttaaacagtt tgctgtcacg 180

ctacgcgatg cgcaggggga tatccctgct gttgtgatgc attacggtgt cttcattcaa 240

aacgtctttg attttctgat tgtggccttt gccatcttta tggcgattaa gctaatcaac 300

aaactgaatc ggaaaaaaga agaaccagca gccgcacctg caccaactaa agaagaagta 360

ttactgacag aaattcgtga tttgctgaaa gagcagaata accgctctct ggtgccgcgc 420

ggcagc 426

<210> 6

<211> 716

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP

<400> 6

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaa 716

<210> 7

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MscL-GFP

<400> 7

aggccatgga tgagcattat taaagaattt cgcgaatttg cgatgcgcgg gaacgtggtg 60

gatttggcgg tgggtgtcat tatcggtgcg gcattcggga agattgtctc ttcactggtt 120

gccgatatca tcatgcctcc tctgggctta ttaattggcg ggatcgattt taaacagttt 180

gctgtcacgc tacgcgatgc gcagggggat atccctgctg ttgtgatgca ttacggtgtc 240

ttcattcaaa acgtctttga ttttctgatt gtggcctttg ccatctttat ggcgattaag 300

ctaatcaaca aactgaatcg gaaaaaagaa gaaccagcag ccgcacctgc accaactaaa 360

gaagaagtat tactgacaga aattcgtgat ttgctgaaag agcagaataa ccgctctctg 420

gtgccgcgcg gcagccatat gggatctggt tctggatcca tggtgagcaa gggcgaggag 480

ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 540

ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 600

atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 660

ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 720

gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 780

aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 840

ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 900

agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 960

atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 1020

cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 1080

ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 1140

gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaaggtcg acaagcttgc ggccgcttta 1200