本發(fā)明涉及DNA組裝技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種雙鏈DNA分子片段與克隆載體的高效連接方法。
背景技術(shù)：
：在基因工程和蛋白質(zhì)工程中，對(duì)目的基因功能的研究是一個(gè)重要方向：一是確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能；二是建立高效表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行體外基因功能表達(dá)，例如抗體工程；三是將目的基因在體外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，包括人體基因治療；或者其他一些方面。在這些研究中，常常需要獲得大量的目的基因，基因克隆重組是實(shí)現(xiàn)這一研究目的的重要基礎(chǔ)技術(shù)。而目的基因DNA分子片段與克隆載體連接是基因克隆重組重要環(huán)節(jié)之一。在科研實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室使用的TaqDNA聚合酶在平端雙鏈DNA的3’末端加一個(gè)堿基A，獲得的目的基因末端A必須和載體末端T配對(duì)進(jìn)行克隆，雖然有較高的克隆效率，但由于TaqDNA聚合酶缺少保真性及末端T載體不容易制備，常常導(dǎo)致基因克隆突變率較高，使得這一TA克隆方法的應(yīng)用受到限制。大部分實(shí)驗(yàn)室目前使用Pfu、Phusion等PCR產(chǎn)物為平端的高保真聚合酶，這就要求克隆載體必須也是平端線(xiàn)性化制備。而平端連接所要求的實(shí)驗(yàn)條件較為苛刻，影響連接反應(yīng)的因素很多，具體影響因素包括溫度、離子濃度、DNA末端的性質(zhì)和濃度、DNA片段的大小等，往往會(huì)導(dǎo)致連接效率無(wú)法達(dá)到要求的情況發(fā)生。例如常用的T4DNA連接酶的平末端連接效率相比粘性末端連接效率就低的多，主要是在平連過(guò)程中線(xiàn)性化載體的自連效率遠(yuǎn)大于片段連接到載體中的效率，轉(zhuǎn)化后涂布培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿上藍(lán)斑多白斑少且存在假陽(yáng)性克隆，導(dǎo)致后續(xù)的菌落挑選培養(yǎng)鑒定的工作量大、挑取白斑困難、易出現(xiàn)雙克隆、陽(yáng)性克隆率低。中國(guó)專(zhuān)利CN102517316A公開(kāi)了促進(jìn)載體和插入片段連接的方法，其基本內(nèi)容是將插入片段酶切后再使用磷酸化酶處理，而載體直接使用相同的酶酶切，再將限制酶酶切和磷酸化酶處理后的插入片段與相同酶切過(guò)的載體通過(guò)DNA連接酶連接。這個(gè)方法對(duì)于插入片段處理耗時(shí)較久、酶連后有空載出現(xiàn)且不適合平端PCR產(chǎn)物與平端線(xiàn)性化克隆載體的連接及其后續(xù)的菌液PCR鑒定。。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足及科學(xué)研發(fā)過(guò)程中的實(shí)際需求，本發(fā)明提供一種DNA分子片段與載體的高效連接方法，該方法能夠解決平端連接過(guò)程中的平端克隆連接效率低，轉(zhuǎn)化涂布培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿上藍(lán)斑多白斑少且存在假陽(yáng)性克隆，后續(xù)的菌落挑選培養(yǎng)鑒定的工作量大、挑取白斑困難、易出現(xiàn)雙克隆、不適合大樣本測(cè)序分析等問(wèn)題。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種DNA分子片段與載體的高效連接方法，包括如下步驟：（1）酶切連接反應(yīng)：將載體與DNA分子片段混合，加入緩沖液、限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，進(jìn)行酶切、連接反應(yīng)；（2）酶切去磷酸化反應(yīng)：待反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入限制性核酸內(nèi)切酶和堿性磷酸酶，并補(bǔ)加緩沖液，進(jìn)行酶切和去磷酸化反應(yīng)。優(yōu)選地，所述限制性核酸內(nèi)切酶為EcoRV或SmaI；所述DNA連接酶為T(mén)4DNA連接酶；所述載體為具有藍(lán)白斑顯色基因以及EcoRV酶切位點(diǎn)或SmaI酶切位點(diǎn)的環(huán)狀克隆載體，進(jìn)一步優(yōu)選為pUC57、pUC19中的任意一種。優(yōu)選地，所述堿性磷酸酶為蝦堿性磷酸酶、熱敏堿性磷酸酶、小牛腸堿性磷酸酶中的任意一種或幾種，進(jìn)一步優(yōu)選為熱敏堿性磷酸酶。優(yōu)選地，所述步驟（1）的緩沖液為10XT4DNA連接酶緩沖液，步驟（2）的緩沖液為10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液。優(yōu)選地，所述DNA分子片段為PCR產(chǎn)物或經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切得到的平端基因純化產(chǎn)物。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述PCR產(chǎn)物為經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述步驟（1）的反應(yīng)體系為：pUC57或pUC19100ng，PCR產(chǎn)物或經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切得到的平端基因純化產(chǎn)物100ng，10XT4DNA連接酶緩沖液2μl，EcoRV1μl，T4DNA連接酶1μl，用ddH2O補(bǔ)足至20μl；反應(yīng)條件為：37℃、5min，15℃-25℃、10min，共3個(gè)循環(huán)；所述步驟（2）的反應(yīng)體系為：步驟（1）的反應(yīng)體系20μl，EcoRV1μl，堿性磷酸酶1μl，10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液2μl，反應(yīng)條件為：37℃30min。優(yōu)選地，該方法還包括步驟（3）：將步驟（2）的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂板培養(yǎng)，挑斑培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定。優(yōu)選地，步驟（3）的具體操作方法為：A、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)步驟（1）酶切連接和步驟（2）酶切去磷酸化后的連接產(chǎn)物可暫時(shí)保存于4℃（如過(guò)夜需在-20℃保存），或者不經(jīng)保存直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。（a）、將裝載有克隆菌株感受態(tài)的EP管取出后放置在冰上融化，將連接產(chǎn)物用移液槍全部加入融化后的感受態(tài)菌株中，并用移液槍輕輕混勻；（b）、冰上放置30分鐘；（c）、42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；（d）、向EP管中加入0.5mlLB液體培養(yǎng)基（不含相應(yīng)載體抗生素），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使菌株恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。B、菌液涂板培養(yǎng)（a’）、培養(yǎng)后的菌液離心5分鐘，離心速率5000r/min；（b’）、用移液槍去掉多余上清，只保留100ul左右，并使用移液器將菌液重新懸浮、混勻；（c’）、將混勻的菌液全部加入到含有相應(yīng)抗生素和顯色劑的培養(yǎng)皿中，使用涂布器在培養(yǎng)皿均勻涂布后于37℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12小時(shí)。C、挑斑培養(yǎng)12小時(shí)后培養(yǎng)皿生長(zhǎng)出菌落，挑取白色單克隆菌落接入到含有0.2mlLB培養(yǎng)基的96孔深孔板中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2h。D、菌落PCR鑒定對(duì)挑斑培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行PCR鑒定。將基因合成中不同長(zhǎng)度的PCR純化產(chǎn)物與克隆載體連接，根據(jù)載體上正反通用引物和連接的目的基因長(zhǎng)度設(shè)定PCR程序進(jìn)行鑒定，目的是鑒定挑取的菌落是否含有需要連接入的目的基因，以便后續(xù)的測(cè)序和目的基因克隆制備。如果PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的條帶，則可證明DNA分子片段可以高效地連接到克隆載體上，且正確率較高。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述連接方法在基因克隆中的應(yīng)用。更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種用于將DNA分子片段與載體進(jìn)行連接的試劑盒，含有上述連接方法中所涉及的除DNA分子片段外的載體、酶和緩沖液。優(yōu)選地，該試劑盒包含A試劑和B試劑，具體組成為：A試劑：pUC57或pUC19，10XT4DNA連接酶緩沖液，EcoRV，T4DNA連接酶；B試劑：EcoRV，堿性磷酸酶，10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液；使用時(shí)，選取DNA分子片段加入到A試劑中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將B試劑加入，再次進(jìn)行反應(yīng)；進(jìn)一步優(yōu)選地，A試劑和B試劑的組成為：A試劑：pUC57或pUC19100ng，10XT4DNA連接酶緩沖液2μl，EcoRV1μl，T4DNA連接酶1μl；B試劑：EcoRV1μl，堿性磷酸酶1μl，10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液2μl；使用時(shí)，選取DNA分子片段100ng，加入到A試劑中，用ddH2O補(bǔ)足到20μl，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將B試劑加入，再次進(jìn)行反應(yīng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：（1）本發(fā)明的連接方法，載體不需要提前線(xiàn)性化制備，直接和純化的PCR產(chǎn)物混在一起加入酶切連接體系中，實(shí)現(xiàn)邊酶切邊連接。（2）本發(fā)明通過(guò)在步驟2中使用限制內(nèi)切酶將空載體切開(kāi)，，堿性磷酸酶將線(xiàn)性載體片段去磷酸化以防止線(xiàn)性化載體自連，以去除空載體，使得轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)皿上只長(zhǎng)白斑，且陽(yáng)性克隆率明顯提高，便于后續(xù)的菌落挑選培養(yǎng)和菌液PCR鑒定，減少大規(guī)模基因合成中挑選菌落和菌液PCR鑒定的工作量，降低基因合成克隆的成本，特別適合于目的基因的大樣本測(cè)序分析。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明優(yōu)化的DNA分子片段與載體的高效連接方法的流程圖。圖2是HPRT部分基因PCR產(chǎn)物凝膠回收結(jié)果，其中，泳道M：DS5000Marker；泳道1-4：HPRT部分基因PCR擴(kuò)增后片段。圖3是不同連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的長(zhǎng)斑結(jié)果，其中，圖3（a）是使用本發(fā)明的連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的長(zhǎng)斑結(jié)果，圖3（b）是使用分子生物學(xué)常規(guī)的T4酶連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的長(zhǎng)斑結(jié)果。圖4是采用常規(guī)T4酶平連得到的平板菌落中陽(yáng)性克隆的PCR鑒定篩選結(jié)果，其中，泳道M：DS5000Marker；泳道1-24：平板挑取陽(yáng)性克隆菌落PCR鑒定結(jié)果。圖5是采用本發(fā)明連接方法得到的平板菌落中陽(yáng)性克隆的PCR篩選鑒定結(jié)果，其中，泳道M：DS5000Marker；泳道1-72：平板挑取陽(yáng)性克隆菌落PCR鑒定結(jié)果。具體實(shí)施方式為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。實(shí)施例1一種人（HPRT1）部分基因序列通過(guò)基因合成克隆的方法人（Homosapienshypoxanthinephosphoribosyltransferase1HPRT1）部分基因序列如下表所示。（1）HPRT1部分基因引物合成，編號(hào)與序列如下編號(hào)序列（5′-3′）1CCACGCCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGCGGGGGGAGGTTTCAC2CCTGAGGTCAGGAGTTCCAGACCAGCCTTGTCAACATGGTGAAACCTCCCCCCG3CTGGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCACCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTA4AAAAAACAGGCTGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAG5CGCCCAGCCTGTTTTTTTGTTTGTTTGTTTTGTTTTTTTTGAGACAGAGTCTTGCTCT6AAGAATGCGCCACTTCACTCCAGCCTGGGAAACAGAGCAAGACTCTGTCTCAAAAAAA7GAGTGAAGTGGCGCATTCTTGGCTCACTGCAACCTTCACCTCCCAGGTTCAAGTGATT8CCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGT9CCAAGTAGCTGGGACTACAGGCATGTGTCACCACACCCGGCTAATTTTTTTGTATTTT10GCCTGGGCAACACGGTGAAATCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAATTAGCCGGGT11CCGTGTTGCCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGAGCTCAGGCAGTCTGCCTGCCTCAGCC12GGGCGGGTTGGTTCACACGTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGCAGACT13TGAACCAACCCGCCCGGCCTGTTGTTTTCTTACATAATTCATTATCATACCT14ATGATATTAGTAACTGTTAACTTTGTAGGTATGATAATGAATTATGTAAGAA15ACAAAGTTAACAGTTACTAATATCATCTTACACCTAAATTTCTCTGATAGACTA16TGATTGGATTAAGATGTTAAAAAATAACCTTAGTCTATCAGAGAAATTTAGGTGTAAG17AGGTTATTTTTTAACATCTTAATCCAATCAAATGTTTGTATCCTGTAATGCTCTCATT18CACTAATCTGAAAAAGAAATATAGCTGTTTCAATGAGAGCATTACAGGATACAAACAT19GAAACAGCTATATTTCTTTTTCAGATTAGTGATGATGAACCAGGTTATGACCTTGATT20CAAATCCTCAGCATAATGATTAGGTATGCAAAATAAATCAAGGTCATAACCTGGTTCA21CCTAATCATTATGCTGAGGATTTGGAAAGGGTGTTTATTCCTCATGGACTAATTATGG22AACCTCATTTTAAGATCTTACTTACCTGTCCATAATTAGTCCATGAGGAATAAACA23CAGGTAAGTAAGATCTTAAAATGAGGTTTTTTACTTTTTCTTGTGTTAATTTCAAACA24AATAGCAAGTACTCAGAACAGCTGCTGATGTTTGAAATTAACACAAGAAAAAGTAAAA25GCAGCTGTTCTGAGTACTTGCTATTTGAACATAAACTAGGCCAACTTATTAA26TAATAAAGAAGATTTTAGAAAGCATCAGTTATTTAATAAGTTGGCCTAGTTTATGTT27ATAACTGATGCTTTCTAAAATCTTCTTTATTAAAAATAAAAGAGGAGGGCCTTACTAA28AGTCCCACTATACCACAACTGATACTAAGTAATTAGTAAGGCCCTCCTCTTTTATTTT29TTAGTATCAGTTGTGGTATAGTGGGACTCTGTAGGGACCAGAACAAAGTAAACATTGA30AGACTCTGGCTAGAGTTCCTTCTTCCATCTCCCTTCAATGTTTACTTTGTTCTGGTCC31GAAGAAGGAACTCTAGCCAGAGTCTTGCATTTCTCAGTCCTAAACAGGGTAATGGACT32AAAATCTGACCTTGCCTTCATGTGATTCAGCCCCAGTCCATTACCCTGTTTAGGACTG（2）、HPRT1部分基因PCR擴(kuò)增32條引物通過(guò)引物PCR拼接獲得一個(gè)長(zhǎng)片段，PCR結(jié)束后，進(jìn)行電泳凝膠回收。電泳緩沖液為1×TAE，瓊脂糖糖凝膠濃度為2%，電壓為200V，時(shí)間為10min。通過(guò)紫外切膠回收，凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen。從圖2可以看出，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，擴(kuò)增條帶均位于標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker1000bp處，與目的基因（1077bp）大小相當(dāng)。（3）、目的基因與環(huán)狀克隆載體連接（3-1）酶切連接反應(yīng)反應(yīng)體系為：pUC57，PCR產(chǎn)物100ng，10×T4DNA連接酶緩沖液2μl，EcoRV（ThermoScientificER0301）1μl，T4DNA連接酶（ThermoScientificEL0011）1μl，用ddH2O補(bǔ)足至20μl；反應(yīng)條件為：37℃、5min，15℃-25℃、10min，共3個(gè)循環(huán)。（3-2）酶切去磷酸化反應(yīng)反應(yīng)（1）的反應(yīng)體系20μl，EcoRV（ThermoScientificER0301）1μl，堿性磷酸酶（ThermoScientificEF0651）1μl，10×限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液2μl，反應(yīng)條件為：37℃30min。（4）、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞酶切去磷酸化反應(yīng)結(jié)束后得到的鏈接產(chǎn)物放到冰上降溫直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞為T(mén)op10F’菌株。（4-1）Top10F’克隆菌株感受態(tài)取出后放置在冰上融化，將連接產(chǎn)物用移液槍取10ul加入感受態(tài)中，并用移液槍輕輕混勻；（4-2）冰上放置30分鐘；（4-3）42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；（4-4）向管中加入0.5mlLB液體培養(yǎng)基(不含相應(yīng)載體抗生素)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為220r/min。（5）、菌液離心涂板培養(yǎng)（5-1）將步驟（4）中培養(yǎng)好的菌液離心5min，離心速率5000r/min。（5-2）棄去多余的培養(yǎng)基，1.5mlEP管中只保留100ul，并使用移液器混勻。（5-3）將100ul菌液加入帶有氨芐抗性和顯色劑的篩選平板中，加入15-20個(gè)已滅菌的玻璃珠，晃動(dòng)使菌液均勻分布，37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h。（6）、挑斑培養(yǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，使用本發(fā)明的連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的長(zhǎng)斑結(jié)果如圖3（a）所示，白斑分散無(wú)藍(lán)斑，能夠快速挑取陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)和鑒定（簡(jiǎn)略寫(xiě)）；而使用分子生物學(xué)常規(guī)的T4酶連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的長(zhǎng)斑結(jié)果如圖3（b）所示，其上可以挑取培養(yǎng)的白斑數(shù)目較少且藍(lán)斑較為密集，并且有淡藍(lán)斑影響。通過(guò)以上對(duì)比可知，使用本發(fā)明的連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的平板無(wú)藍(lán)斑且易挑取單克隆。（7）菌落陽(yáng)性克隆鑒定載體通用引物用于PCR鑒定：M13F-47：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；M13R-48：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。將步驟（6）中使用分子生物學(xué)常規(guī)的T4酶連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的陽(yáng)性克隆和本發(fā)明的連接方法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR體系與反應(yīng)程序如下：PCR體系:組分反應(yīng)體積(μl)10×buffer3dNTP0.2M13F-47引物0.3M13R-48引物0.3菌液3TaqDNA聚合酶0.2H2O23Totalvolume30PCR反應(yīng)程序：PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1200bp處條帶為目的條帶，與目的條帶大小一致的為正確的陽(yáng)性克隆。圖4是采用常規(guī)T4酶平連得到的平板菌落中陽(yáng)性克隆的PCR鑒定篩選結(jié)果，其中泳道M：DS5000Marker；泳道1-2、6-13、15-17、19-24：陽(yáng)性克隆菌落PCR鑒定與目標(biāo)條帶大小一致，是正確陽(yáng)性克?。挥镜?、5、14：陽(yáng)性克隆菌落PCR鑒定目標(biāo)條帶大小不一致且存在空載是假陽(yáng)性克??；泳道18：陽(yáng)性克隆PCR鑒定目標(biāo)條帶大小一致且存在空載條帶，證明是雙克隆菌落；圖5為采用本發(fā)明連接方法得到的平板菌落中陽(yáng)性克隆的PCR篩選鑒定結(jié)果，其中泳道M：DS5000Marker；泳道1-72：陽(yáng)性克隆菌落鑒定正確擴(kuò)增條帶，結(jié)果全部陽(yáng)性克隆與預(yù)期條帶大小一致。通過(guò)圖4和圖5中PCR鑒定結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)T4酶平連得到的平板菌落陽(yáng)性克隆中存在假陽(yáng)性空載、插入片段與目標(biāo)片段大小不一致的克隆以及由于無(wú)法用眼睛分辨導(dǎo)致的雙克隆菌落；而使用本發(fā)明連接方法得到平板菌落經(jīng)PCR鑒定均為陽(yáng)性克隆。證明在基因合成克隆中采用本發(fā)明所述方法，可使陽(yáng)性克隆率明顯提高，便于后續(xù)的菌落挑選培養(yǎng)和菌液PCR鑒定，甚至可以不需要菌檢，直接培養(yǎng)后測(cè)序分析，顯著縮短大規(guī)?；蚝铣煽寺≈刑暨x菌落時(shí)間，并且在樣本測(cè)序分析中取同樣樣本量的情況下能夠減少由于假陽(yáng)性克隆導(dǎo)致PCR鑒定額外挑取克隆的工作量，節(jié)省基因合成克隆中的成本，適合進(jìn)行大樣本測(cè)序分析。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3