本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種酸性脂肪氧合酶及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：三苯甲烷類染料是一種多苯環(huán)化合物，具有“致癌、致畸、致突變”作用。對染料廢水的處理主要是物理和化學(xué)的方法，雖然行之有效，但一般成本較高，且易產(chǎn)生二次污染物。而生物降解染料由于具有成本低，二次污染小，生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。生物降解染料主要通過由微生物分泌胞外氧化酶系統(tǒng)進行脫色，包括漆酶、木素過氧化物酶和錳過氧化物酶等。因此，有效的染料廢水處理方法和技術(shù)是改善生態(tài)環(huán)境，維護人類健康的重要保證。LOX（Lipoxygenase，LOX）是非血紅素、非硫鐵過氧化酶，它能催化具有順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸及其酯類發(fā)生空間及位置特異性的雙加氧反應(yīng)，生成相應(yīng)的氫過氧化物。這些氫過氧化物性質(zhì)活潑，是重要的化學(xué)反應(yīng)中間體。LOX在面粉的加工過程中它能夠?qū)⒚娣壑械亩嗖伙柡椭舅岽呋趸蓺溥^氧化物，能夠起到增強面筋強度和提高面粉白度的作用。另外，LOX在污水處理與環(huán)境保護方面，可用于染料的降解。LOX通過催化氧化亞油酸，生成氫過氧化物，不穩(wěn)定的氫過氧化物將裂解產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，脂質(zhì)自由基具有非常高的反應(yīng)活性，起到破壞三苯甲烷類的染料分子結(jié)構(gòu)的作用。目前，有關(guān)來源于重組橙黃色粘球菌脂肪氧合酶及其在染料脫色中的應(yīng)用研究國內(nèi)外尚未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種酸性的重組橙黃色粘球菌脂肪氧合酶，以及該酶的制備方法和在降解三苯甲烷類染料中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種酸性脂肪氧合酶，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。進一步地，所述的酸性脂肪氧合酶，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一種制備以上所述的酸性脂肪氧合酶所用的擴增引物，包括引物F和引物R，其中引物F序列為5’GGATCCATGACTGTCGAGTACAAACTCACG3’；引物R序列為5’AAGCTTTCAGACGGTGATGCCGC3’。一種以上所述的酸性脂肪氧合酶的制備方法，包括以下步驟：（1）以MyxococcusxanthusDK1622菌株基因為模板，使用權(quán)利要求3提供的引物F和引物R為引物，進行PCR擴增；（2）將步驟（1）得到的擴增產(chǎn)物插入載體pET-28a的BamHI、HindШ酶切位點得到表達(dá)質(zhì)粒；（3）將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌獲得重組大腸桿菌，對重組大腸桿菌進行發(fā)酵，生產(chǎn)所述的酸性脂肪氧合酶；（4）對步驟（3）得到的酸性脂肪氧合酶進行親和層析分離純化，得到純的酶。進一步地，所述的酸性脂肪氧合酶的制備方法，步驟（1）中PCR擴增的反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃5min，解鏈94℃40s，退火60℃30s，延伸72℃110s，30個循環(huán)，72℃10min，4℃反應(yīng)終止。進一步地，所述的酸性脂肪氧合酶的制備方法，（3）中大腸桿菌表達(dá)宿主菌為步驟BL21(DE3)。以上所述的酸性脂肪氧合酶在降解三苯甲烷類染料中的用途。以上所述的酸性脂肪氧合酶在降解苯胺藍(lán)或甲基藍(lán)中用途。本發(fā)明從橙黃色粘球菌DK1622基因組中，克隆獲得一種新型的脂肪氧合酶基因rMxLOX，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建基因工程菌，實現(xiàn)了重組橙黃色粘球菌脂肪氧合酶rMxLOX異源高效生產(chǎn)，經(jīng)親和層析純化，該酶在pH3.0,30℃條件下活性最高，pH2.5-5.0，30℃條件下活性穩(wěn)定，是一種酸性脂肪氧合酶。重組橙黃色粘球菌脂肪氧合酶rMxLOX高效降解三苯甲烷類染料苯胺藍(lán)或甲基藍(lán)。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例2中所述SDS-PAGE電泳分析MxLOX純度圖；圖2為本發(fā)明實施例4中所述pH對MxLOX活力的影響圖；圖3為本發(fā)明實施例6中所述的rMxLOX對苯胺藍(lán)、甲基藍(lán)的降解效果圖；圖4為本發(fā)明實施例6中所述的rMxLOX對苯胺藍(lán)、甲基藍(lán)的降解率圖；圖5為本發(fā)明實施例6中所述的rMxLOX對苯胺藍(lán)降解前后全波長掃描圖圖；圖6為本發(fā)明實施例6中所述的rMxLOX對甲基藍(lán)藍(lán)降解前后全波長掃描圖。具體實施方式：以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例1：MyxococcusxanthusDK1622脂肪氧合酶基因(rMxLOX)的克隆離心收集MyxococcusxanthusDK1622菌體，用上海生工基因組DNA提取試劑盒提取MyxococcusxanthusDK1622的基因組DNA。根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中已登錄的橙黃粘球菌脂肪氧合酶基因(No.CP006832.1)設(shè)計兩個引物：上游引物F-1：5′-ATGAAACGCAGGAGTGTGCTCTTG-3′(SEQIDNO.3)；下游引物R-1：5′-TCAGATATTGGTGCTCGCCGGGATC-3′(SEQIDNO.4)；利用提取得到的MyxococcusxanthusDK1622基因組DNA為模板，使用以上兩個引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系如下：2×GCBuffer25μLMXLOX-F2μLMXLOX-R2μL2.5mMdNTP8μLgenomicDNA1μLPfuDNApolymerase1μLddH2O補齊至50μLPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min，解鏈94℃40s，退火60℃30s，延伸72℃110s，30個循環(huán)，72℃10min，4℃反應(yīng)終止。在50μl體系中，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，確定連接成功后送到上海生工測序，用計算機軟件DNAMAN分析測序結(jié)果，得到一個序列如SEQIDNO.1所示的長度為2028bp的ORF（Genebank上的登錄號是：GenBank:CP000113.12066844-2068871），即橙黃色粘球菌DK1622脂肪氧合酶基因(rMxLOX)，編碼一個由675個氨基酸組成的蛋白質(zhì)（登錄號：WP_011551853.1），序列如SEQIDNO.2所示。實施例2：橙黃色粘球菌DK1622脂肪氧合酶基因(rMxLOX)原核表達(dá)載體的構(gòu)建(附圖1)根據(jù)獲得的rMxLOX基因序列，設(shè)計兩個引物（SEQIDNO.3，SEQIDNO.4），上游引物加上BamHI識別序列，下游引物加上HindШ識別序列:按照下列PCR體系加入各成分，擴增LOX基因:PCR程序為：94℃3min；30×(94℃40s；53℃50s；72℃90s)；72℃10min。用上海生工PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，加BamHI、HindШ雙酶切，與適量的用相同限制酶消化的載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取幾個菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，電泳，以電泳滯后的質(zhì)粒為模板進行PCR驗證，確定連接成功后送到上海生工測序。實施例3橙黃色粘球菌DK1622脂肪氧合酶基因(rMxLOX)在大腸桿菌中發(fā)酵生產(chǎn)的方法：（1）將含有rMxLOX表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-rMxLOX轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌株BL21(DE3)(德國Novagen公司產(chǎn)品)，涂布于含卡那霉素(50μg/ml)固體平板平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12-16小時；（2）挑取單菌落，接入含有卡那霉素(50μg/ml)的50ml種子液培養(yǎng)基，70-90rpm30℃培養(yǎng)過夜；（3）按照1%的體積比取種子液加入到含有卡那霉素(50μg/ml)的100ml發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600約為0.6；（4）調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度至16℃，180rpm振蕩培養(yǎng)16小時。（5）離心收集菌體，加pH3.0的檸檬酸緩沖液，超聲破碎菌體，離心收集上清液，獲得重組橙黃色粘球菌DK1622脂肪氧合酶(rMxLOX)的粗酶液。實施例4：重組脂肪氧合酶的分離純化及其性質(zhì)研究采用NTA(鎳柱，GE公司產(chǎn)品)親和層析法對實例3中獲得的rMxLOX粗酶液進行分離純化。樣品中加10mM咪唑(終濃度)，增強吸附柱。上樣前，用20mM咪唑平衡層析柱。樣品過三次柱材料，達(dá)到rMxLOX與親和柱材料充分結(jié)合的目的。上樣結(jié)束后，用200mM咪唑洗脫(分別用10個柱床體積)，收集洗脫液測酶活，電泳鑒定。重組酶的最適pH及pH穩(wěn)定性：將酶液分別加入pH2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的50mmol/L緩沖液中，測定LOX活力，以最高酶活為相對酶活100%。其中pH2.5-6.0使用檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液，pH7.0-9.0使用磷酸鹽緩沖液，pH10.0使用硼砂-氫氧化鈉緩沖液。將20μL酶加入不同pH的80μL緩沖液中，4℃放置10h，取100μL測酶活，計算處理前后的相對酶活，分析pH對酶穩(wěn)定性的影響(見圖2)。實施例5：重組脂肪氧合酶活力測定采用紫外分光光度法測酶活，反應(yīng)體系3ml，取pH3.0的檸檬酸緩沖液2.79mL，酶液10μL，亞油酸鈉底物200μL混合均勻后放入30℃水浴中并開始計時，以1min內(nèi)3mL反應(yīng)體系在234nm的吸光度增加0.001做為一個酶活力單位U。實施例6：rMxLOX對染料的降解以甲基藍(lán)與苯胺藍(lán)作為研究MxLOX對三苯甲烷染料降解效果的樣本。于pH3.0檸檬酸緩沖液中分別配制20μg/ml甲基藍(lán)，30μg/ml苯胺藍(lán)溶液，添加底物亞油酸鈉至終濃度0.079mM，添加600U的MxLOX，總反應(yīng)體系3mL，反應(yīng)置于30℃培養(yǎng)箱中，每隔一定時間取樣檢測最大吸收波長，苯胺藍(lán)585nm，甲基藍(lán)596nm。依據(jù)公式：計算降解率，A1=初始吸光值，A2=實時測定吸光值。降解率達(dá)到最大后全波長掃描分析苯胺藍(lán)，甲基藍(lán)的降解情況（見圖5和圖6）。如圖3所示，在最適pH3.0及最適溫度30℃下研究染料的降解，當(dāng)反應(yīng)進行5min，苯胺藍(lán)和甲基藍(lán)降解率超過30%，30min以后最大降解率分別超過70%和60%（見圖4）。序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種酸性脂肪氧合酶及其制備方法與應(yīng)用<130>1<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>2028<212>DNA<213>酸性脂肪氧合酶核苷酸序列<400>1atgactgtcgagtacaaactcacgattcggacgggcacgaagctcggcgcggggacggat60gccgacatttccatcgtcctcgtgggcacgcgaggagagagcgccccccgcgtgctggac120aagcacttccacaacgacttcgaggcgggcgcggaggacgtctacgccctctcctccgag180gacctcggtgacctggtcctgttgcgcttcagcaacgcgggcggcgtggcggccgactgg240ctgctcgactgggcaatcgtcacggccggagagaagcagtggcacttccctttctaccgg300tgggtgctgagtggcgccacggtcgacgtgctcgaggggaccgcgaagctcgctcgccag360gcaagcagcgagcgcgagtccacggcgcggcgcgagctgctcgaggcccgccagcggatg420tacccgtggcgcgcgcctgagatgaccgaggggcttcccggcgcgctcgacctccgtgag480gggaggccgctgccgaaggacgagctctaccggggcctgacggagggcagctacgaagtg540gtcatcgcgaagacgctggcggccatcaagctgaacctgcccatgctgacccgcgcctgg600aacgggctggtggacatcttcgacttcttcaaacacctggaggtgccccagctcgcccag660cgctggaaggacgacctcgagttcgcgcggcaggccgtccagggcatcgcccccctccac720atcacgctcgtccccagtctgccgcagggcatgccgctcaccgacgacgacgtccggggc780ctcttgtcgcccggcaccacgctggccagggcgctcgacgccaagcgcatcttcctgatc840gacttcgaaatcctcgacgacatcaggatgtaccggaaggtcggcgaggacggagtcgag900gagcggcgctgggctcccgcggcgcgctgcctgctgtacctggatgaccagcgtcaactg960cgacccctggccatccagctcgggcgggacgcccagaaggaccctgtcttcacgccgaac1020gacgacgcgtacgactggctcgccgcgaaaatctacctccggtgcagcgagggcaactcg1080caccagatggtgtcgcacgcgctgcgcacacacttcgtggcggagccgttcgtcatggcg1140acgatgcgcaacctgccggacccgcaccccgtctacaaactgctgcggcggcacttccgc1200tacacgctcgccatcaacgagggcgcacgcaagggcctgctcgacgcaggcggggtgttc1260gacgacttcatcgcgacaggcggccccgacaagggccacctccagttgggcaagaagggc1320ttccagcgctggacgctggcggacaacaagccccgtgctgacctggagcggcggggcgtg1380ctggaccctgccgtgctccccaactacccgtaccgggacgacgccctgcccttgtgggac1440gcgttcgaggagtacgtcggcggcgtcctcaggcacttctaccggaccgatgccgacctc1500gaggccgacaccgagatgcagcaatggtggaaggacctcaccgagcacgggctgcccgtg1560gacaagctgccctgccgggagctgcgccgcgtcgacgacctggtcgacatcctcaccacc1620gtcctcttcacggtcagcgtgcagcacgcggcggtgaactacctgcaatacgagcactac1680gccttcgtaccgaatgcgcccctgagcatgcgccgggagccaccccgccagaaggggacg1740ctgcgtgcagaggacatccccgagatgattcccaccaagtcccagatgctctggcaggtc1800gccatcggccgggcgctctccagcttcggagacgacgaggagtacctgctgcacgagggc1860ggctggcgcgaggagtacttccacgaaccggagctggtggccatccgccagcggttccag1920gagcgcctgcgcgcccagcgcgaggcggtggaggcgcgcaacgcgggcgccgaggtgccc1980tacaccatcctgcgtcccgaccggattccctgcggcatcaccgtctga2028<210>2<211>675<212>PRT<213>酸性脂肪氧合酶氨基酸序列<400>2MetThrValGluTyrLysLeuThrIleArgThrGlyThrLysLeuGly151015AlaGlyThrAspAlaAspIleSerIleValLeuValGlyThrArgGly202530GluSerAlaProArgValLeuAspLysHisPheHisAsnAspPheGlu354045AlaGlyAlaGluAspValTyrAlaLeuSerSerGluAspLeuGlyAsp505560LeuValLeuLeuArgPheSerAsnAlaGlyGlyValAlaAlaAspTrp65707580LeuLeuAspTrpAlaIleValThrAlaGlyGluLysGlnTrpHisPhe859095ProPheTyrArgTrpValLeuSerGlyAlaThrValAspValLeuGlu100105110GlyThrAlaLysLeuAlaArgGlnAlaSerSerGluArgGluSerThr115120125AlaArgArgGluLeuLeuGluAlaArgGlnArgMetTyrProTrpArg130135140AlaProGluMetThrGluGlyLeuProGlyAlaLeuAspLeuArgGlu145150155160GlyArgProLeuProLysAspGluLeuTyrArgGlyLeuThrGluGly165170175SerTyrGluValValIleAlaLysThrLeuAlaAlaIleLysLeuAsn180185190LeuProMetLeuThrArgAlaTrpAsnGlyLeuValAspIlePheAsp195200205PhePheLysHisLeuGluValProGlnLeuAlaGlnArgTrpLysAsp210215220AspLeuGluPheAlaArgGlnAlaValGlnGlyIleAlaProLeuHis225230235240IleThrLeuValProSerLeuProGlnGlyMetProLeuThrAspAsp245250255AspValArgGlyLeuLeuSerProGlyThrThrLeuAlaArgAlaLeu260265270AspAlaLysArgIlePheLeuIleAspPheGluIleLeuAspAspIle275280285ArgMetTyrArgLysValGlyGluAspGlyValGluGluArgArgTrp290295300AlaProAlaAlaArgCysLeuLeuTyrLeuAspAspGlnArgGlnLeu305310315320ArgProLeuAlaIleGlnLeuGlyArgAspAlaGlnLysAspProVal325330335PheThrProAsnAspAspAlaTyrAspTrpLeuAlaAlaLysIleTyr340345350LeuArgCysSerGluGlyAsnSerHisGlnMetValSerHisAlaLeu355360365ArgThrHisPheValAlaGluProPheValMetAlaThrMetArgAsn370375380LeuProAspProHisProValTyrLysLeuLeuArgArgHisPheArg385390395400TyrThrLeuAlaIleAsnGluGlyAlaArgLysGlyLeuLeuAspAla405410415GlyGlyValPheAspAspPheIleAlaThrGlyGlyProAspLysGly420425430HisLeuGlnLeuGlyLysLysGlyPheGlnArgTrpThrLeuAlaAsp435440445AsnLysProArgAlaAspLeuGluArgArgGlyValLeuAspProAla450455460ValLeuProAsnTyrProTyrArgAspAspAlaLeuProLeuTrpAsp465470475480AlaPheGluGluTyrValGlyGlyValLeuArgHisPheTyrArgThr485490495AspAlaAspLeuGluAlaAspThrGluMetGlnGlnTrpTrpLysAsp500505510LeuThrGluHisGlyLeuProValAspLysLeuProCysArgGluLeu515520525ArgArgValAspAspLeuValAspIleLeuThrThrValLeuPheThr530535540ValSerValGlnHisAlaAlaValAsnTyrLeuGlnTyrGluHisTyr545550555560AlaPheValProAsnAlaProLeuSerMetArgArgGluProProArg565570575GlnLysGlyThrLeuArgAlaGluAspIleProGluMetIleProThr580585590LysSerGlnMetLeuTrpGlnValAlaIleGlyArgAlaLeuSerSer595600605PheGlyAspAspGluGluTyrLeuLeuHisGluGlyGlyTrpArgGlu610615620GluTyrPheHisGluProGluLeuValAlaIleArgGlnArgPheGln625630635640GluArgLeuArgAlaGlnArgGluAlaValGluAlaArgAsnAlaGly645650655AlaGluValProTyrThrIleLeuArgProAspArgIleProCysGly660665670IleThrVal675<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3ggatccatgactgtcgagtacaaactcacg30<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4aagctttcagacggtgatgccgc23當(dāng)前第1頁1 2 3