專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳糖酸的制備方法，具體涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，屬 于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳糖酸(lactobionic acid)是第三代果酸，是集延緩衰老、保濕、抗氧化和促進機 體更新等多種功效于一身的最先進果酸。由于其本身存在于機體中，所以不存在有刺激性 問題，具有優(yōu)異的抗氧化能力，用在器官移植中，可防止器官受到自由基的傷害；乳糖酸還 可避免細胞膜因氧化而受到的破壞，具有極佳的保水性，是化妝品中的重要組分。乳糖酸是 器官移植緩沖液中的重要組分，和金屬螯合后的產(chǎn)物可降低由于離子催化產(chǎn)生的羥基對組 織的損傷。乳糖酸還可增加大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的溶解度，如紅霉素的乳糖酸水溶液的溶解 度比紅霉素高出50-100倍；乳糖酸的鈣鹽的溶解度較高，可用來補充鈣的吸收，也可用來 做葡萄糖酸鈣的過飽和溶液。乳糖酸可以降低酸味，減少成熟時間，在干酪和酸奶的生產(chǎn) 中，可促進風(fēng)味，消除苦味；乳糖酸有很強的甜味，比乳酸具有更溫和、更甜的風(fēng)味，可作為 酸化劑使用。乳糖酸可以促進礦物質(zhì)鹽的吸收，如可通過鐵或銅的乳糖酸鈣螯合物的形式 加入飲料中，且不會增加異味和氣味，當(dāng)這些金屬直接加入時，會產(chǎn)生不良的氣味。乳糖酸 還可作為洗滌劑的組分。在化妝品中加入乳糖酸，可抗氧化、抗衰老。乳糖酸的CAS登錄號 96-82-2。目前乳糖酸的制備有化學(xué)催化合成法以及微生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)催化合成法有許多 不利的因素，例如產(chǎn)生多種副產(chǎn)物和化學(xué)污染物，而形成的眾多副產(chǎn)物又使分離、純化步驟 變得復(fù)雜。近年來研究人員都在尋找微生物轉(zhuǎn)化法來制備乳糖酸。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)乳糖 酸具有高效，低成本，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供利用微生物將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸的方法。具體內(nèi)容涉及利用 微生物轉(zhuǎn)化法制備乳糖酸的方法。本發(fā)明采用的微生物菌種能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為乳糖酸，轉(zhuǎn) 化率高、副產(chǎn)物少，通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化取得了顯著效果。本發(fā)明的技術(shù)方案一株微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的菌株，其分類命名為熒光假單 胞菌(/^WiZoffloaas fIuorescens^ SK 17. 001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編 號 CCTCC NO :M 2010216。一種用所述菌株微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，以CCTCC NO =M 2010216為出發(fā) 菌株，以乳糖為轉(zhuǎn)化底物，采用碳源、氮源及無機鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基，微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖 酸，工藝為
(1)菌種采用CCTCC NO =M 2010216為出發(fā)菌株；
(2)菌種保藏所用菌種保藏在保藏培養(yǎng)基上保存，兩周轉(zhuǎn)接一次； 保藏培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基；(3)種子培養(yǎng)從保藏培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基需活化2次，每次30°C下培養(yǎng)24h ； 種子培養(yǎng)基的組分以g/100mL計為蔗糖3，蛋白胨1，酵母膏1，氯化鉀0. 05，磷酸氫二
鉀0. 1，硫酸鎂0. 02，硝酸鈉0. 3，以雙蒸水配制，pH 5. 5-7 ；
(4)微生物轉(zhuǎn)化將CCTCCNO =M 2010216菌株添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用微生物產(chǎn)的 糖類轉(zhuǎn)化酶將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸；
發(fā)酵培養(yǎng)基的組分以g/100mL計為碳源3. 0-5.0，氮源0. 5-3. 5，磷酸鉀0. 2，硫酸鎂 0. 2，硫酸錳0. 005，以雙蒸水配制，pH 6. 0-6. 2 ；
所述碳源為乳糖，所述氮源為酵母膏和/或蛋白胨；
轉(zhuǎn)化底物乳糖在培養(yǎng)基中的濃度為3%-10%W/V，種子培養(yǎng)液以6%的接種量，接入添 加不同氮源以及無機鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為30mL;在28-30°C， 200-220 rpm的條件下培養(yǎng)24_60h，得到含乳糖酸的發(fā)酵液；
(5)在發(fā)酵過程中需要加入弱堿或碳酸鹽調(diào)節(jié)pH，優(yōu)選的是CaC03。通過添加堿類物質(zhì) CaCO3，使得發(fā)酵過程中pH 6. 0-6. 2保持恒定，以此提高乳糖的轉(zhuǎn)化率。所述微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，轉(zhuǎn)化底物乳糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為 3%-5%W/V，在28-30°C，200-220 rpm的條件下培養(yǎng)時間優(yōu)選為36_60h。乳糖酸應(yīng)理解為乳糖酸及其鹽類，如乳糖酸鈣。檢測乳糖酸的方法如下
取發(fā)酵液離心，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾(0. 22 μ m)，濾液經(jīng)HPLC分析。HPLC條件液相 色譜儀 AgilentllOO ；色譜柱=Shodex SHlOll (8. 0X300 (mm));流動相為 0. OlN H2SO4 ；檢 測器紫外檢測器，210nm，柱溫50°C，流速0. SmL/min，進樣量10 μ L，乳糖酸標樣濃度 1%。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種利用微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，表明 熒光假單胞菌iFseudomonas fIuorescens^ SK17. 001在乳糖濃度為3 %時，培養(yǎng)60h轉(zhuǎn)化 率能達到91%。乳糖濃度為10%時，培養(yǎng)135h，轉(zhuǎn)化率達到90%以上。生物材料樣品保藏?zé)晒饧賳伟?Pseudomonas fluorescens ) SK 17. 001，
已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏日期2010年9月2日，保藏編號 CCTCC NO :M 2010216。


圖1乳糖酸液相色譜圖。
具體實施例方式通過實驗，得到了影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化乳糖酸產(chǎn)率的主要因素 實施例1.發(fā)酵時間對乳糖酸產(chǎn)量的影響
按說明書所述的發(fā)酵條件，發(fā)酵培養(yǎng)基中底物為3%的乳糖，通過對/^^/傭如浙 flurosecence SK17. 001在不同發(fā)酵時間產(chǎn)乳糖酸的檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵60h乳糖酸含量最高， 發(fā)酵時間對產(chǎn)乳糖酸的影響如表1所示。表1、3%乳糖濃度下的發(fā)酵時間對轉(zhuǎn)化產(chǎn)乳糖酸的影響
I時間(h)|24 |36|48 |60
權(quán)利要求
一株微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的菌株，其分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)SK 17.001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM 2010216。
2.一種用權(quán)利要求1所述菌株微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，其特征在于以CCTCC NO =M 2010216為出發(fā)菌株，以乳糖為轉(zhuǎn)化底物，采用碳源、氮源及無機鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基， 微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸，工藝為(1)菌種采用CCTCCNO =M 2010216為出發(fā)菌株；(2)菌種保藏所用菌種在保藏培養(yǎng)基上保存，兩周轉(zhuǎn)接一次； 保藏培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基；(3)種子培養(yǎng)從保藏培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基需活化2次，每次30°C下培養(yǎng)24h ； 種子培養(yǎng)基的組分以g/100mL計為蔗糖3，蛋白胨1，酵母膏1，氯化鉀0. 05，磷酸氫二鉀0. 1，硫酸鎂0. 02，硝酸鈉0. 3，以雙蒸水配制，pH 5. 5-7 ；(4)微生物轉(zhuǎn)化將CCTCCNO =M 2010216菌株添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用微生物產(chǎn)的 糖類轉(zhuǎn)化酶將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸；發(fā)酵培養(yǎng)基的組分以g/100mL計為碳源3. 0-5.0，氮源0. 5-3. 5，磷酸鉀0. 2，硫酸鎂 0. 2，硫酸錳0. 005，以雙蒸水配制，pH 6. 0-6. 2 ；所述碳源為乳糖，所述氮源為酵母膏和/或蛋白胨；轉(zhuǎn)化底物乳糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3%-10%W/V，種子培養(yǎng)液以6%的接種量，接入 添加不同氮源以及無機鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為30mL ；在28_30°C， 200-220 rpm的條件下培養(yǎng)24_60h，得到含乳糖酸的發(fā)酵液；(5)在發(fā)酵過程中通過添加堿類物質(zhì)CaCO3，使得發(fā)酵過程中pH6. 0-6. 2保持恒定，以 此提高乳糖的轉(zhuǎn)化率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化底物乳糖在發(fā) 酵培養(yǎng)基中的濃度為3%-5%W/V，在28-30°C，200-220 rpm的條件下培養(yǎng)36_60h。
全文摘要
一種微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一株微生物轉(zhuǎn)化制備乳糖酸的菌株，其分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)SK17.001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCNOM2010216。用熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescence)SK17.001微生物作為菌種，以乳糖為轉(zhuǎn)化底物，添加氮源及無機鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基，微生物轉(zhuǎn)化法制備乳糖酸。在發(fā)酵過程中通過添加堿類物質(zhì)CaCO3，使得發(fā)酵過程中pH保持恒定，提高乳糖的轉(zhuǎn)化率。優(yōu)選條件下轉(zhuǎn)化率達到90%以上。本發(fā)明所得產(chǎn)品乳糖酸安全可靠，可用作醫(yī)藥中間體、食品添加劑，具有抗氧化、增強難溶礦物質(zhì)的吸收等生理功能。
文檔編號C12R1/39GK101988046SQ20101050128
公開日2011年3月23日 申請日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者江波, 沐萬孟, 白會釵, 繆銘 申請人:江南大學(xué)