一種乳糖酸的酶法制備及測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及食品加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種乳糖酸的酶法制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Microdochiumnivale還原糖氧化酶可W將末端帶有還原性糖殘基的單糖和低聚 糖氧化成相應(yīng)的酸，沒有其他副產(chǎn)物產(chǎn)生，具有更加有效催化乳糖氧化形成乳糖酸的潛力。 但是Microdochiumnivale還原糖氧化酶在野生菌中的表達(dá)有產(chǎn)量低，酶活低且不易純化 等缺點(diǎn)，而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低、可 W對外源蛋白翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)，因此將Microdochiumnivale還原糖氧化酶基因?qū)氲?載體pPICZαA中，并在畢赤酵母X33中胞外表達(dá)得到重組Microdochiumnivale還原糖氧 化酶。
[0003] 乳糖酸是一種新型多徑基有機(jī)酸，是集抗氧化、修護(hù)、抗衰老、保濕、促進(jìn)機(jī)體更新 等多種功效于一身的最先進(jìn)的果酸。乳糖酸在醫(yī)學(xué)中是器官移植前保護(hù)性緩沖液的重要組 分，可馨合化3+，降低由于離子催化產(chǎn)生的氨氧自由基對組織的損傷，增加了器官的保存性。 在美容行業(yè)中，由于乳糖酸有極強(qiáng)的吸水性，并且能夠促進(jìn)上皮形成，加速傷口愈合，有修 護(hù)肌膚的功效，因此在醫(yī)療或美容整形手術(shù)后，乳糖酸常用于防止皮膚干燥W及肌膚修護(hù)。 此外，乳糖酸在食品中可W做為食品添加劑，并且能夠與礦物質(zhì)鹽形成復(fù)合物，促進(jìn)腸道中 益生菌的生長W及對礦物質(zhì)的吸收。在酸奶的制作過程中，乳糖酸的存在能夠改善酸奶凝 乳的持水力、調(diào)和酸味、促進(jìn)風(fēng)味形成。在肉制品中添加一定量的乳糖酸，可W減少肉制品 在冷凍后產(chǎn)生的水分損失。
[0004] 目前制備乳糖酸的方法有生物制備法、化學(xué)氧化法、電化學(xué)法和催化氧化法等多 種方法，但是都存在著副產(chǎn)物多，產(chǎn)物的分離純化比較復(fù)雜W及化學(xué)污染等問題，其大規(guī)模 生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用均受到極大限制。因此找到一種高效、專一、綠色的并具有工業(yè)化大規(guī)模 生產(chǎn)潛能的乳糖酸的制備方法具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一種乳糖酸的酶法制備及測定方 法。本發(fā)明高效、低成本，且乳糖酸的轉(zhuǎn)化率接近100%，為乳糖酸在工業(yè)中的應(yīng)用提供了技 術(shù)依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供了一種乳糖酸的酶法制備方法，W乳糖為底物，W重組Microdochium nivale還原糖氧化酶催化乳糖制備乳糖酸，并對反應(yīng)得到的乳糖酸進(jìn)行測定。
[0008] 所述制備乳糖酸具體包括W下步驟：
[0009] (1)重組Microdochiumnivale還原糖氧化酶的全基因合成及表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0010] 根據(jù)Microdochiumnivale還原糖氧化酶的lipA基因的核巧酸序列GenBank AccessionNo.BD103535. 1在Bioedit軟件的輔助下推導(dǎo)出該基因的核巧酸序列；
[0011] 在DNAWorks軟件的輔助下，w畢赤酵母密碼子使用頻率表為基準(zhǔn)，對lipA的密 碼子進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)密碼子的內(nèi)在分布情況，在優(yōu)化后的lipA基因序列中引入酶切位點(diǎn) EcoRI和Notl;
[0012] 根據(jù)引入的酶切位點(diǎn)將全基因分成了F1、F2和F3Ξ個(gè)片段；在Gene201iga軟件 的輔助下分別設(shè)計(jì)用于合成F1、F2和F3^個(gè)片段的寡核巧酸；各寡核巧酸序列及組裝見圖 1 ;各寡核巧酸片段在AppliedBiosystem公司381A型DNA合成儀上采用固相亞硝酸胺法 合成寡核巧酸片段，合成片段經(jīng)過脫鹽，PAGE純化后備用；
[001引將純化后的F1、F2和F3ミ個(gè)片段的寡核巧酸進(jìn)行拼接，PCR克隆導(dǎo)入到載 體pPICZαA中，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33,篩選并獲得陽性克隆子，得到重組Microdochium nivale還原糖氧化酶基因工程菌X33-PPICZαA-MnCO;
[0014] 似重組Microdochiumnivale還原糖氧化酶的制備： 陽01引 將菌種X33-pPICZaA-MnCO接種到Y(jié)PD中，25-30 °C，200-220rmp/min培養(yǎng)至 0D 600值為2-4,按照3 %的接種量接種到BMGY中，25-30°C，200-220rmp/min培養(yǎng)至0D600 值為4-5,用無菌管離屯、收集菌體，菌體用BMMY懸浮，加入到含有BMMY的錐形搖瓶中， 25-30°C，200-220rmp/min每隔1化添加甲醇至終濃度0. 5%，誘導(dǎo)表達(dá)72h，離屯、收集上清 液；
[0016] 將上清液放入抑6. 0的20mmol/L的PBS中透析4她，去除培養(yǎng)基中的大分子得 到粗酶液，再通過儀離子親和層析柱化STrapHP純化粗酶液，得到純度大于95%的重組 Microdochiumnivale還原糖氧化酶；
[0017] (3)乳糖酸的制備： 陽0化]取5-20mmol/L的乳糖溶液100-200ml，40°C加熱溶解，用0.Imol/L的胞2〇)3溶液 調(diào)節(jié)抑至5.0-6.0,轉(zhuǎn)移至Ξ口燒瓶攬拌反應(yīng)器中，向該反應(yīng)體系中加入1000U的過氧化氨 酶，通入空氣的量為0. 6-1.OL/min，每隔1化加入500-1500U的重組Microdochiumnivale 還原糖氧化酶，于40-60°C下反應(yīng)48-6化，沸水浴加熱10-15min終止反應(yīng)，4°C、10000;rmp/ min離屯、10-15min后收集反應(yīng)液，即得。
[0019] 本發(fā)明還提供了乳糖酸的檢測方法，采用液質(zhì)聯(lián)用HPLC-MS對乳糖酸樣品進(jìn)行測 定，具體包括W下步驟：
[0020] 將乳糖酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品和制備得到的乳糖酸樣品分別用10ml的超純水溶解配制成 Img/ml的樣品溶液，分別用液相色譜儀和質(zhì)譜儀進(jìn)行測試，測試時(shí)的進(jìn)樣量均為5μL;然 后比對乳糖酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品和制備得到的乳糖酸樣品的液相色譜和質(zhì)譜曲線，兩者一致則表 明制備得到的乳糖酸樣品合格。
[0021] 所述液相色譜條件是色譜儀：WATERSAC卵口ΥUPLC;分析柱：Β邸CS肥.IXlOOmm 1. 7um;采用紫外檢測器；柱溫設(shè)置為40-50°C;流速設(shè)置為0. 3-0. 5ml/min;流動相為 A:100%乙臘，B:0. 1%甲酸；采用梯度洗脫法，程序如下：0-4min達(dá)到5%的A，5-7min達(dá)到 50%A，7-10min達(dá)到 0%A;
[0022] 所述質(zhì)譜條件是用電噴霧電離源ESI;毛血管電壓設(shè)置為3.0-4.OkVolts;錐孔電 壓設(shè)置為30-40Volts;離子源溫度為100-120°C;脫溶劑氣溫度為300-350°C;脫溶劑氣流 量為5001it/虹；質(zhì)量范圍為lOO-lOOOm/z;乳糖酸荷質(zhì)比357m/z。
[0023] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0024] 本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了還原糖氧化酶氧化乳糖制備乳糖酸，且轉(zhuǎn)化率接近100%，并且 對乳糖酸進(jìn)行測定。乳糖酸的高保濕、抗衰老、抗氧化、促進(jìn)機(jī)體更新等特性使得其具有巨 大的應(yīng)用前景，本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)乳糖酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。
【附圖說明】
[00巧]圖1為重組Microdochium nivale還原糖氧化酶各寡核巧酸序列及組裝形式。 陽0%] 圖2為實(shí)施例1制備得到的乳糖酸的高效液相圖；
[0027]圖3為實(shí)施例1制備得到的乳糖酸的質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[002引下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。實(shí)施例中過氧化氨酶，乳糖酸標(biāo) 準(zhǔn)樣品均購自sigma公司，其余試劑皆為市售。其中乳糖酸標(biāo)準(zhǔn)樣品是純度大于97%的乳 糖酸。液質(zhì)聯(lián)用儀用為WATERSMLDISYNAPT Q-T0F MS，液相用的色譜儀為WATERS AC卵ITY IPLC。 陽029] 實(shí)施例1
[0030] (1)重組Microdochium nivale還原糖氧化酶的全基因合成及表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0031] 根據(jù)Microdochium nivale還原糖氧化酶的lipA基因的核巧酸序列Gen Bank Accession No.BD103535. 1在Bioedit軟件的輔助下推導(dǎo)出該基因的核巧酸序列；
[0032] 在DNAWorks軟件的輔助下，W畢赤酵母密碼子使用頻率表為基準(zhǔn)，對lipA的密 碼子進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)密碼子的內(nèi)在分布情況，在優(yōu)化后的lipA基因序列中引入酶切位點(diǎn) EcoRI和Notl ;
[0033] 根據(jù)引入的酶切位點(diǎn)將全基因分成了F1、F2和F3 Ξ個(gè)片段；在Gene201iga軟件 的輔助下分別設(shè)計(jì)用于合成F1、F2和F3^個(gè)片段的寡核巧酸；各寡核巧酸序列及組裝見圖 1 ;各寡核巧酸片段在Applied Biosystem公司381A型DNA合成儀上采用固相亞硝酸胺法 合成寡核巧酸片段，合成片段經(jīng)過脫鹽，PAGE純化后備用；
[0034] 將純化后的F1、F2和F3S個(gè)片段的寡核巧酸進(jìn)行拼接，PCR克隆導(dǎo)入到載 體pPICZαA中，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33,篩選并獲得陽性克隆子，得到重組Microdochium nivale還原糖氧化酶基因工程菌X33-PPICZαA-MnCO;
[0035] (2)重組Microdochium nivale還原糖氧化酶的制備：
[0036]將菌種X33-PPICZαA-MnCO接種到Y(jié)PD中，25°C，200rmp/min培養(yǎng)至 0D600 值為 2,按照3 %的接種量接種到BMGY中，25°C，200rmp/min培養(yǎng)至0D600值為4,用無菌管離屯、 收集菌體，菌體用BMMY懸浮，加入到含有BMMY的錐形搖瓶中，25°C，200rmp/min每隔1化添 加甲醇至終濃度0. 5%，誘導(dǎo)表達(dá)72h，離屯、收集上清液；
[0037] 將上清液放入抑6.0的20mmol/L的PBS中透析4她，去除培養(yǎng)基中的大分子得 到粗酶液，再通過儀離子親和層析柱化STrap HP純化粗酶液，得到純度大于95%的重組 Microdochium nivale還原糖氧化酶； 陽03引 做乳糖酸的制備：取Immol/L的乳糖溶液100ml，40°C加熱溶解，用0.Imol/L的 NazCOs溶液調(diào)節(jié)pH至5.0,轉(zhuǎn)移至Ξ口燒瓶攬拌反應(yīng)器中，向該反應(yīng)體系中加入1000U的過 氧化氨酶，通氣量為0.化/min,每隔1化加入500U的重組Microdochiumnivale還原糖氧 化酶，于40°C下反應(yīng)4她，沸水浴加熱10-15min終止反應(yīng)，4°C、lOOOOrmp/min離屯、15min后 收集反應(yīng)液。
[0039] (4)產(chǎn)物測定：用液質(zhì)聯(lián)用化PLC-M巧對乳糖酸樣品進(jìn)行了測定，操作如下：稱 取0.Olg乳糖酸標(biāo)樣，用10ml的超純水溶解配制成Img/ml的樣品溶液，進(jìn)樣量是5μL。 采用的液相色譜條件是：色譜儀：WATERSAC卵口ΥUPLC;分析柱：Β邸C甜2.IXlOOmm 1. 7um;柱溫：40°C;義用紫外檢測器；設(shè)置流速為0. 2ml/min;流動相義用：A: 100 %乙臘， B:0. 1%甲酸；洗脫條件采用梯度洗脫法，程序如下：0-4min達(dá)到5%的A，5-7min達(dá)到50% A，7-10min達(dá)到0%A。采用的質(zhì)譜條件是：用電噴霧電離源巧SI);毛血管電壓設(shè)置為 3.OkVolts;錐孔電壓設(shè)置為30Volts;離子源溫度為100°C;脫溶劑氣溫度為300°C;脫溶劑 氣流量為5001it/虹；質(zhì)量范圍為lOO-lOOOm/z;乳糖酸荷質(zhì)比357m/z。 W40] 從圖2中可W看出，乳糖反應(yīng)液和乳糖酸標(biāo)樣的出峰時(shí)間均為1. 03min，從圖3中 可W看出，在此出峰時(shí)間下的物質(zhì)的荷質(zhì)比是357m/z，判斷為乳糖酸。 陽〇W 實(shí)施例2
[0042] (1)重組Microdochiumnivale還原糖氧化酶的全基因合成及表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0043] 根據(jù)Mic