本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種我國(guó)北方荒漠化地區(qū)防風(fēng)固沙樹(shù)種沙地柏(Sabina vulgaris.)有關(guān)氮營(yíng)養(yǎng)及堿脅迫感應(yīng)基因CML9(Q6-1)。本發(fā)明選用內(nèi)蒙古蒙草抗旱股份有限公司苗木基地的樹(shù)種沙地柏為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用Illumina Solexa轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序的方法，獲得該樹(shù)種的氮營(yíng)養(yǎng)及堿脅迫感應(yīng)基因，對(duì)候選氮營(yíng)養(yǎng)及堿脅迫感應(yīng)的基因CML9(Q6-1)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行不同元素的表型分析，更直觀的了解基因的生理學(xué)功能。

背景技術(shù)：

沙地柏(Sabina vulgaris.)，又名叉子圓柏、新疆圓柏，主要分布于內(nèi)蒙古、陜西、新疆、寧夏、甘肅、青海等地。主要培育基地有江蘇、浙江、安徽、湖南等地。沙地柏能忍受風(fēng)蝕沙埋，長(zhǎng)期適應(yīng)干旱的沙漠環(huán)境，是干旱、半干旱地區(qū)防風(fēng)固沙和水土保持的優(yōu)良樹(shù)種。喜光，喜涼爽干燥的氣候，耐寒、耐旱、耐瘠薄，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，不耐澇，在肥沃通透土壤成長(zhǎng)較快。適應(yīng)性強(qiáng)，扦插宜活，栽培管理簡(jiǎn)單，這種生命力堅(jiān)強(qiáng)的常綠植物在北方綠化和造林中具有舉足重輕的作用，所以研究沙地柏，對(duì)于野生植物抗旱相關(guān)基因的開(kāi)發(fā)和利用具有重要意義。目前對(duì)于沙地柏的研究主要集中在生理和生態(tài)特性方面，在關(guān)于其抗旱基因的克隆及利用方面均無(wú)報(bào)道。

我國(guó)植物分子育種能力同發(fā)達(dá)國(guó)家差距巨大，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗逆基因是世界植物分子育種領(lǐng)域競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)。對(duì)于植物抗逆基因的開(kāi)發(fā)及利用，目前的研究主要集中于模式植物擬南芥或水稻、小麥等作物中，缺乏對(duì)野生植物體內(nèi)豐富的抗逆基因的挖掘。本發(fā)明正是利用Illumina公司的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)我國(guó)北方荒漠化地區(qū)防風(fēng)固沙首選樹(shù)種沙地柏進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了一種經(jīng)自然環(huán)境長(zhǎng)期篩選出氮營(yíng)養(yǎng)及堿脅迫感應(yīng)的基因CML9(Q6-1)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是的利用分子克隆技術(shù)，對(duì)有關(guān)氮營(yíng)養(yǎng)及堿脅迫感應(yīng)基因CML9(Q6-1)進(jìn)行克隆，最終得到用于基因表達(dá)的表達(dá)載體，從而使該基因?qū)氲綌M南芥野生植物中并在野生植物體內(nèi)表達(dá)，再通過(guò)表型分析進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能。

本發(fā)明的實(shí)施方案是選用內(nèi)蒙古蒙草抗旱有限公司苗木基地的沙地柏為實(shí)驗(yàn)材料，采用Illumina Solexa轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序的方法，對(duì)其轉(zhuǎn)錄組序列鑒定分析，確定Ca2+結(jié)合蛋白種類和數(shù)量，從而獲得沙地柏有關(guān)氮營(yíng)養(yǎng)及堿脅迫感應(yīng)基因CML9(Q6-1)的核苷酸序列，通過(guò)分子克隆技術(shù)獲得該基因，并將其導(dǎo)入到擬南芥中，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型分析了解基因的生物學(xué)功能。

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供新的沙地柏抗旱相關(guān)基因，定名為CML9(Q6-1)，其序列為SEQ No.1的序列。

本發(fā)明涉及一種在沙地柏根內(nèi)表達(dá)量較高的基因，名稱為CML9(Q6-1)，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1或SEQ NO.2所示，其編碼的67個(gè)氨基酸序列，如序列表中SEQ NO.3所示。

具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了含有下述序列之一的分離的多核苷酸：

(1)序列表中的SEQ NO.1或SEQ NO.2；

(2)與序列表中的SEQ NO.1或SEQ NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；

上述涉及的多核苷酸還包括取代、缺失和插入突變體以及等位變體、剪接變體、片段、衍生物等。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，上述的分離的多核苷酸也包括那些與SEQ NO.1或SEQ NO.2所示序列具有較高同源性的序列，例如同源性大于95％，或90％，甚至85％的序列；還包括那些在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ NO.1或SEQ NO.2所示序列雜交的序列；或者可與SEQ NO.1或SEQ NO.2的序列互補(bǔ)的序列。

本發(fā)明同時(shí)提供了將本發(fā)明的新基因CML9(Q6-1)應(yīng)用于植物抗旱基因工程的技術(shù)方案。

本發(fā)明從沙地柏中成功地分離獲得了一種經(jīng)自然環(huán)境長(zhǎng)期篩選出的抗相關(guān)基因CML9(Q6-1)，這給利用基因工程技術(shù)培育抗旱植物提供了新的方向，對(duì)干旱脅迫下的分子育種工作具有重要意義。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的具體實(shí)施方案之一是將CML9(Q6-1)基因應(yīng)用于植物基因工程以提高植物在干旱脅迫下的生存能力。

以上概括的描述了本發(fā)明，可通過(guò)參照本文提供的某些具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。

附圖說(shuō)明

圖1：實(shí)驗(yàn)總流程圖。

圖2：CML9(Q6-1)五種T₃代純和植株分別在CK、0μM NO₃^-、pH 7.0這三個(gè)濃度梯度生長(zhǎng)條件下葉子的表型圖(A)和鮮重圖(B)，從圖中可以更清晰的看到轉(zhuǎn)基因植物的葉片在0μM NO₃^-上長(zhǎng)勢(shì)比野生型Col-0要好，而在pH 7.0上轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)不如野生型植株。

圖3：CML9(Q6-1)五種T₃代純和植株分別在0μM Ca²⁺、1μM ABA、100mM NaCl這三個(gè)濃度梯度生長(zhǎng)條件下葉子的表型圖(A)和鮮重圖(B)，從圖中可以清晰的看到轉(zhuǎn)基因植株的葉片與野生型植株沒(méi)有差異。

圖4：表型分析中培養(yǎng)皿的種植方式。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、沙地柏樣品采集

為了最大限度的增加其體內(nèi)和抗逆性相關(guān)的RNA的豐富度，選擇在天氣相對(duì)寒冷的12月(2013年)進(jìn)行沙地柏根的取樣，樣品在收集后迅速保存于液氮中備用。

實(shí)施例2、表達(dá)載體的構(gòu)建

1、由于沙地柏植物的RNA較難提取，所以我們前期的目的基因是由南京金斯瑞公司合成的，后續(xù)表達(dá)載體的構(gòu)建是用公司合成好的基因來(lái)完成的。合成基因所用的克隆載體是pUC57抗性是Amp。

2、目的載體的連接和構(gòu)建的完成

本發(fā)明中用到的表達(dá)載體是pRI 101AN，其抗性為Kan。

目的載體的連接是將合成好的的基因片段和目的載體同時(shí)經(jīng)過(guò)5’：Sal I 3′：EcoR I的酶切，經(jīng)過(guò)DNA膠回收，DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過(guò)菌落PCR和提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證的方法，最終獲得連接到的載體基因的質(zhì)粒。

雙酶切反應(yīng)體系：

a、目的片段與表達(dá)載體的連接：

原則：按照目的片段和表達(dá)載體摩爾比是3∶1或1∶3的比例進(jìn)行連接；

T4DNA連接酶(1μl)+buffer(2μl)+17μl(目的片段+表達(dá)載體)；

16℃過(guò)夜連接；

b、轉(zhuǎn)化：取大腸桿菌感受態(tài)于冰上解凍，將連有目的片段和表達(dá)載體的產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)里，混勻，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，立即置于冰上2分鐘；加入500μl無(wú)抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床上200rpm或37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60分鐘后，將菌液涂布與含有相應(yīng)抗生素(Kan 50mg/ml)的固體LB平板上；37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜后觀察其結(jié)果。

c、挑取菌板上的單菌落加入到含有Kan(50mg/ml)抗生素的5ml LB培養(yǎng)液里，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。

d、質(zhì)粒提取：選用TRAN的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1)、取2ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，10000x g離心1分鐘，去上清。如菌液量大，可分多次離心收集。

2)、加入250μl無(wú)色溶液RB(含RnaseA)，震蕩懸浮細(xì)菌沉淀，不應(yīng)留有小的菌塊。

3)、加入250μl藍(lán)色溶液LB，溫和地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍(lán)色透亮的溶液，顏色由半透亮變?yōu)橥噶了{(lán)色，指示完全裂解(不宜超過(guò)5分鐘)。

4)、加入350μl黃色溶液NB，輕輕混合5-6次(顏色由藍(lán)色完全變成黃色，指示混合均勻，中和完全)，直至形成緊實(shí)的黃色凝集塊，室溫靜置2分鐘。

5)、12000x g離心5分鐘，小心吸取上清加入離心柱中。12000x g離心1分鐘，棄流出液。如上清體積大于800μl，可以分成多次加入柱中，并同上離心，棄流出液。

6)、加入650μl溶液WB，12000x g離心1分鐘，棄流出液。

7)、12000x g離心2分鐘，徹底去除殘留的WB。

8)、將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去離子水(PH＞7.0)室溫靜置1分鐘。

9)、10000x g離心1分鐘，洗脫出的DNA于-20℃保存。

e、酶切驗(yàn)證：繼續(xù)選用前面所用的限制性內(nèi)切酶5’：Sal I 3′：EcoR I對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。

雙酶切反應(yīng)體系

37℃恒溫培養(yǎng)箱，溫浴30分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取帶型正確的進(jìn)行保菌(40％黃蓋甘油)。

10、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

1)、取農(nóng)桿菌感受態(tài)，置于冰上融化，加入質(zhì)粒約5μl，混勻后冰上放置30分鐘；

2)、同時(shí)準(zhǔn)備干凈干燥的電轉(zhuǎn)杯，冰上預(yù)冷；

3)、將電轉(zhuǎn)杯表面擦干，把加有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌全部加入電轉(zhuǎn)杯中后放入電轉(zhuǎn)儀，電激轉(zhuǎn)化；

4)、電轉(zhuǎn)杯加入lml無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)液，反復(fù)吹吸，吸入2ml離心管中，28℃搖床200rpm或28℃恒溫培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)1.5小時(shí)后；

5)、取500μl菌液涂布于含有抗生素(Rif50mg/ml和Kan50mg/ml)的固體LB培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1-2天直至單克隆出現(xiàn)；

6)、選取陽(yáng)性農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行搖菌，28℃搖床，250rpm，培養(yǎng)1-2天；

11、農(nóng)桿菌質(zhì)粒提?。哼x用TRAN的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒；

1)、取2ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，10000x g離心1分鐘，去上清。如菌液量大，可分多次離心收集。

2)、加入250μl無(wú)色溶液RB(含RnaseA)，震蕩懸浮細(xì)菌沉淀，不應(yīng)留有小的菌塊。

3)、加入250μl藍(lán)色溶液1B，溫和地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍(lán)色透亮的溶液，顏色由半透亮變?yōu)橥噶了{(lán)色，指示完全裂解(不宜超過(guò)5分鐘)。

4)、加入350μl黃色溶液NB，輕輕混合5-6次(顏色由藍(lán)色完全變成黃色，指示混合均勻，中和完全)，直至形成緊實(shí)的黃色凝集塊，室溫靜置2分鐘。

5)、12000x g離心5分鐘，小心吸取上清加入離心柱中。12000x g離心1分鐘，棄流出液。如上清體積大于800μl，可以分成多次加入柱中，并同上離心，棄流出液。

6)、加入650μl溶液WB，12000xg離心1分鐘，棄流出液。

7)、12000x g離心2分鐘，徹底去除殘留的WB。

8)、將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去離子水(PH＞7.0)室溫靜置1分鐘。

9)、10000x g離心1分鐘，洗脫出的DNA于-20℃保存

12、酶切驗(yàn)證：選用限制性內(nèi)切酶5’：Sal I 3′：EcoR I對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，

雙酶切反應(yīng)體系

28℃恒溫培養(yǎng)箱，溫浴30分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析結(jié)果，選擇條帶正確的農(nóng)桿菌保存甘油菌(40％藍(lán)蓋)，用于轉(zhuǎn)化植物。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因植物的獲取

本實(shí)施例采用花絮侵染法來(lái)獲取轉(zhuǎn)基因植株代號(hào)CML9(Q6-1)。

1、挑取已正確保菌的農(nóng)桿菌進(jìn)行活化(活化目的是確保菌的活力)，將活化好的菌加入到含有抗生素(Rif50mg/ml和Kan50mg/ml)的5ml LB培養(yǎng)液中，28℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，將搖好的菌液放入到離心機(jī)內(nèi)，5000x g，10min，棄去上清液，加入1ml的侵染液(5％蔗糖，0.02％silwet77懸浮液溶于水)，用膠頭滴管輕輕吹吸使菌懸浮。

2、選用三盒長(zhǎng)勢(shì)良好且已開(kāi)花的野生型Col-0植株，剪去植株上的已結(jié)豆莢和已完成授粉的花苞，用膠頭滴管吸取菌液滴在未開(kāi)花的花苞上，并貼標(biāo)簽標(biāo)注，每隔2-3天侵染一次，直至所有植株都開(kāi)花(注：每次侵染前一天給植物澆水)。

3、當(dāng)植株成熟后及時(shí)收取T₁代種子，待種子干燥一周左右將其撒播在含有抗生素(Kan50mg/ml)的抗性固體MQACK培養(yǎng)皿上，先放置到4℃冰箱春化三天，再光照培養(yǎng)一周左右，進(jìn)行陽(yáng)性苗T₁代的篩選。

4、選取抗性培養(yǎng)皿上長(zhǎng)勢(shì)良好的T₁代植株，移土培養(yǎng)并單株標(biāo)號(hào)，待其成熟后及時(shí)單株收取T₂代種子，干燥一周后，繼續(xù)將其單管撒在抗性培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)數(shù)天后，選取符合活死比為3∶1的T₂代植株移土培養(yǎng)，種子成熟后及時(shí)單株收取T₃代種子，干燥一周后，將T₃代種子撒在含有草銨膦抗性的MQACK培養(yǎng)基上，選取全活的純合植株進(jìn)行表型分析。

實(shí)施例4、CML9(Q6-1)在不同元素中的表型分析

本實(shí)例中用到的MQA培養(yǎng)基成分主要有

大量元素：1MKNO₃、1MMgSO₄、1MCaCl₂

微量元素：MS微量(0.5x)、

Fe²⁺鹽：MS Fe²⁺鹽(0.5x)

Mn²⁺鹽：MS Mn²⁺鹽(0.5x)以及0.5M MES緩沖液

碳源：1％蔗糖

a.具體的培養(yǎng)基方案如表1(100ml)。

注：0μM Ca²⁺、0μM NO₃^-、這兩個(gè)梯度加入1.0％的瓊脂糖1g；1mM Ca²⁺、1μM ABA、100mMNaCl、pH 7.0這四個(gè)梯度加入1.2％的瓊脂1.2g；KOH或BTP調(diào)pH為5.7(注：1mM Ca²⁺pH7.0的用KOH調(diào)到pH 7.0，1μM ABA是在高壓滅菌后，培養(yǎng)基溫度降到手可以碰觸的溫度時(shí)加入0.5μl)。

表1各種元素的培養(yǎng)基方案

b.種植方式如圖4所示。

點(diǎn)播種子的過(guò)程是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，點(diǎn)播種子之前先要用75％酒精對(duì)種子進(jìn)行消毒(洗種子時(shí)間不宜超過(guò)30分鐘)，然后，再將種子在無(wú)菌條件下?lián)Q用100％酒精沖洗一下，并將其連酒精一起晾干在無(wú)菌的濾紙上，待種子完全晾干后，用消過(guò)毒的鑷子將種子點(diǎn)播在培養(yǎng)基上。

每種梯度一個(gè)重復(fù)，待種完后用封口膜封口，先在4℃冰箱春化三天，再放置溫度為22℃，濕度為40％RH的培養(yǎng)室豎直光照培養(yǎng)十四天之后觀察CML9(Q6-1)與野生型Col-0的表型，并對(duì)其進(jìn)行根長(zhǎng)和鮮重的數(shù)據(jù)采集和照片拍攝，可以看出CML9(Q6-1)相對(duì)于野生型Col-0在0μM NO₃^-葉子長(zhǎng)得大；在堿性條件下(pH 7.0)表現(xiàn)為葉小。同時(shí)，CML9(Q6-1)相對(duì)于野生型Col-0在100mM NaCl、0μM Ca²⁺、pH 7.0這幾個(gè)濃度梯度上是沒(méi)有明顯區(qū)別的。具體如圖所示(圖2、圖3)。

c.培養(yǎng)皿的擺放

6個(gè)梯度為一組，分為五組

以上實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范疇。