本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與卵巢癌相關(guān)的環(huán)狀RNA PUM1的shRNA和應(yīng)用。

技術(shù)背景

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)死亡率最高的惡性疾病，發(fā)病率居婦科腫瘤第三位，其較高的死亡率由于大多數(shù)患者確診時已為晚期，手術(shù)治療后常發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移，遠期預(yù)后差。因此，探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制對于卵巢癌的早期診斷、預(yù)后判斷及個體化靶向治療具有重要意義。

近年來隨著高通量測序等技術(shù)的不斷進展，環(huán)狀RNA（circRNA）越來越多地進入研究者的視野，環(huán)狀RNA是一種高度保守的閉合的非編碼RNA，富含微小RNA（miRNA）結(jié)合位點，能夠吸附并解除miRNA對靶基因的抑制作用，調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展通路中癌基因或抑癌基因的表達，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。PUM（Homo sapiens pumilio）基因已被證實能夠影響細胞周期、增殖與分化、調(diào)控癌癥相關(guān)基因的表達，在腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮著重要作用，但目前并沒有關(guān)于PUM1基因轉(zhuǎn)錄形成的circPUM1結(jié)構(gòu)在卵巢癌組織中表達情況及作用機制的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供PUM1基因在卵巢癌的診斷、治療及預(yù)后評估的應(yīng)用，尤其是一種與卵巢癌相關(guān)的環(huán)狀RNA PUM1的shRNA和應(yīng)用。該環(huán)狀RNA與癌細胞的增殖能力相關(guān)，針對其設(shè)計的shRNA可應(yīng)用于抗腫瘤的藥物的制備。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種與卵巢癌相關(guān)的circPUM1基因，其DNA序列如SEQ.ID. NO.1所示；針對circPUM1基因設(shè)計的shRNA，具體為shRNA1或shRNA2；針對circPUM1設(shè)計shRNA1，所述的shRNA1的top strand和bottom strand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；針對circPUM1設(shè)計的 shRNA2，所述的shRNA的top strand和bottom strand的核苷酸序列分別SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示。

SEQ.ID.NO.2：GATTCTCAACAACAGGGCCCAAGGGATTCAAGAGATCCCTTGG

GCCCTGTTGTTGAGAATTTTTTT。

SEQ.ID.NO.3：AAAAAAATTCTCAACAACAGGGCCCAAGGGATCTCTTGAATCCCT

TGGGCCCTGTTGTTGAGAATC。

SEQ.ID.NO.4：GAACAACAGGGCCCAAGGGATGCAGATTCAAGAGATCTGCAT

CCCTTGGGCCCTGTTGTTTTTTTT。

SEQ.ID.NO.5：AAAAAAAACAACAGGGCCCAAGGGATGCAGATCTCTTGAATC

TGCATCCCTTGGGCCCTGTTGTTC。

所述的環(huán)狀RNA PUM1可作為卵巢癌診斷和治療的重要靶點。

所述的與卵巢癌相關(guān)的環(huán)狀RNA PUM1的shRNA可以用于制備抗卵巢癌藥物。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)circPUM1在卵巢癌組織中高表達，通過轉(zhuǎn)染shRNA能夠下調(diào)circPUM1的表達，顯著抑制癌細胞活性，為卵巢癌相關(guān)circRNA的臨床治療和科學研究提供了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1利用qRT-PCR檢測circPUM1在卵巢癌及正常組織中的表達情況。

圖2 circPUM1 shRNA轉(zhuǎn)染后，卵巢癌細胞circPUM1表達情況的QRT-PCR。

圖3 利用MTT法檢測干擾circPUM1對卵巢癌細胞活性的影響。

圖4檢測干擾circPUM1對卵巢癌細胞凋亡的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，以下實施例將有助于對本發(fā)明的了解，但這些實施例僅為了對本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。在實施例中未作特殊說明的操作方法均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)操作方法。

實施例1。

一、 circPUM1在卵巢癌組織、正常卵巢組織中的表達情況。

1.標本采集。

在患者知情的情況下，于術(shù)中采集卵巢癌、正常卵巢組織標本，生理鹽水清洗后，保存于液氮或-80℃超低溫冰箱中，備用；組織標本于2014年6月-2016年6月，在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)室，由陳醫(yī)生采集。

2.引物設(shè)計。

circPUM1 RT-PCR引物序列如SEQ.ID.NO.6-7所示。

上游引物（SEQ.ID.NO.6）：AGTGTACTGGGAGGAGG。

下游引物（SEQ.ID.NO.7）：ATAAGTCCGTGCGTCC。

3.應(yīng)用qRT-PCR方法分別檢測circPUM1在卵巢癌、正常卵巢組織的表達量。

3.1總RNA抽提。

使用RNA抽提試劑RNAiso Plus試劑（寶生物工程有限公司）從正常卵巢組織、卵巢癌組織分離總RNA。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5分鐘；4℃條件下12,000r離心處理5分鐘；小心吸取上清液，移入新的離心管中；加入RNAiso Plus的1/5體積量的氯仿，劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化后，室溫靜置5分鐘；4℃條件下，12,000r離心處理15分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個新的離心管中，向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在30℃下靜置10分鐘；4℃條件下12,000r離心處理10分鐘，棄去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下顛倒洗滌離心管管壁，4℃條件下12,000r離心處理5分鐘后，棄去乙醇，室溫干燥沉淀2-5分鐘，加入適量的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度（定量RNA濃度1ug/ul， OD260/OD280 1.8-2.0之間表示RNA純度較高）。

3.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits購自Invitrogen公司，定量PCR試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix購自Invitrogen公司。

采用 GoScript 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（A5000、A5001），按照以下操作步驟進行反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA。

第一步：取一定量模板 RNA 加入引物。

RNA ( 1μg/ ul) 5μl。

Random Primers (0.5 μg / ul) 1 μl。

Oligo(dT)15 Primer (0.5 μg/ ul) 1 μl。

Nuclease-Free Water (加至 10 μl) 3μl。

第二步：將模板 RNA 與反轉(zhuǎn)錄引物（ Random Primers和Oligo(dT)15 Primer）的混合物進行 70℃、5 min 預(yù)變性，完成后取出置于冰上。

第三步：配制 RT -Mix，向每個樣品管加入 10 μl。

組分 反轉(zhuǎn)錄混合液 終濃度。

Nuclease-Free Water 1.6 μl。

GoScript? 5X Reaction Buffer 4 μl 1X。

MgCl2 (25 mM) 2 μl 2.5mM。

PCR Nucleotide Mix 1 μl 0.5mM。

Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.4 μl 20units。

GoScript? Reverse Transcriptase 1 μl。

第四步：設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火、延伸、逆轉(zhuǎn)錄酶失活三步（退火25℃ 5min，延伸42℃ 60 min，失活70℃ 15 min，4℃ + ∞。

程序完成后得到 cDNA。

3.3 Real-time PCR。

（1）按下列配置PCR反應(yīng)混合液（反應(yīng)液配置可在室溫進行），并分至各反應(yīng)管，然后加入2ul模板。

組分 體積（20ul反應(yīng)體系） 終濃度。

Nuclease-Free Water 7 μl。

上游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

下游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

GoTaq?qPCR Master Mix,2X 10ul 1X。

CXR 100X 0.2ul 1X。

（2）采用ABI PRISM?7500 Real-Time PCR System，兩步法進行PCR標準擴增程序。

（3）導出數(shù)據(jù)，Realtime PCR結(jié)果用2-△△CT法進行分析。用Graphad Prism軟件分別繪制出卵巢癌和正常卵巢組織癌的圖表，結(jié)果如圖1表示相比正常組織，circPUM1(circ_100133)在卵巢癌組織中高表達（p<0.05）。

二、體外細胞功能實驗。

1．細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染。

在含10%胎牛血清（FBS）DMEM（購自HyClone公司）培養(yǎng)液中，加入100 U/mL青霉素和鏈霉素在飽和濕度，5%二氧化碳，37℃孵箱中，按照常規(guī)培養(yǎng)方法進行細胞傳代培養(yǎng)卵巢癌細胞系 A2780（購自中科院細胞庫）。根據(jù)制造商的說明書使用Lipofectamine 2000將 circPUM1 shRNA轉(zhuǎn)入細胞中，進行培養(yǎng)。shRNA干擾片段序列由上海漢恒生物科技有限公司合成，circPUM1基因和管家基因18S引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.干擾效率檢測：轉(zhuǎn)染效率結(jié)果采用QRT-PCR檢測。

QRT-PCR結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示卵巢癌細胞系circPUM1 shRNA轉(zhuǎn)染降低了circPUM1表達水平(P <0.05)。

3．MTT細胞增殖活性測定。

將細胞以3,000個細胞/孔的密度接種在96孔板中。瞬時轉(zhuǎn)染后分別孵育0h、24h、48h、和72h；然后加入20ul MTT（5毫克/毫升）在37℃ 孵育4小時；棄掉上清液，再加入150ul DMSO，使用分光光度計在490nm下測OD值；每個實驗設(shè)置三個復孔。

結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示，與對照組和空載體轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染后48h、72h的卵巢癌細胞活性明顯受到抑制(P < 0.05)；即shRNA1、2處理后，circPUM1表達下調(diào)，抑制了卵巢癌細胞的生長增殖活性。

4.細胞凋亡實驗。

實驗前將細胞在6cm盤培養(yǎng)，加入處理因素(circPUM1 RNA干擾質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染48小時后，進行實驗。細胞用不含EDTA胰蛋白酶消化，1500r離心處理5分鐘后收集細胞，預(yù)冷的PBS洗滌兩次，離心后，收集細胞約5×10 5個，加入1×Binding Buffer，重懸細胞100ul，加入5μL Annexin V-FITC和5uL PI Staining Solution，輕輕混勻，室溫避光孵育10分鐘，再加入400μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻；樣品在1小時內(nèi)流式細胞儀檢測。

結(jié)果顯示circPUM1干擾后的卵巢癌細胞系凋亡實驗結(jié)果見圖4；其中圖4-1表示利用shRNA1沉默circPUM1后，卵巢癌細胞A2780凋亡率顯著增加(P <0.05)；圖4-2表示利用shRNA2沉默circPUM1后，卵巢癌細胞A2780凋亡率顯著增加(P <0.05)。

因此，circPUM1可以作為卵巢癌的治療靶點，采用特異性的shRNA、PUM1特異性的抗體或者小分子藥物，沉默或者降低腫瘤組織中的circPUM1的表達，可用于卵巢癌的臨床治療。

序列表

＜110＞中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

＜120＞一種與卵巢癌相關(guān)的環(huán)狀非編碼RNA-PUM1的shRNA和應(yīng)用

＜160＞7

＜210＞1

＜211＞438

＜212＞DNA

＜213＞環(huán)狀RNA PUM1的核苷酸序列

＜400＞1

ggcccaaggg atgcagacag tgatgaaaac gacaaaggtg aaaagaagaa caagggtacg 60

tttgatggag ataagctagg agatttgaag gaggagggtg atgtgatgga caagaccaat 120

ggtttaccag tgcagaatgg gattgatgca gacgtcaaag attttagccg tacccctggt 180

aattgccaga actctgctaa tgaagtggat cttctgggtc caaaccagaa tggttctgag 240

ggcttagccc agctgaccag caccaatggt gccaagcctg tggaggattt ctccaacatg 300

gagtcccaga gtgtcccctt ggaccccatg gaacatgtgg gcatggagcc tcttcagttt 360

gattattcag gcacgcaggt acctgtggac tcagcagcag caactgtggg actttttgac 420

tacaattctc aacaacag 438

＜210＞2

＜211＞66

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞2

gattctcaac aacagggccc aagggattca agagatccct tgggccctgt tgttgagaat tttttt 66

＜210＞3

＜211＞66

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞3

aaaaaaattc tcaacaacag ggcccaaggg atctcttgaa tcccttgggc cctgttgttg agaatc 66

＜210＞4

＜211＞66

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞4

gaacaacagg gcccaaggga tgcagattca agagatctgc atcccttggg ccctgttgtt tttttt 66

＜210＞5

＜211＞66

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞5

aaaaaaaaca acagggccca agggatgcag atctcttgaa tctgcatccc ttgggccctg ttgttc 66

＜210＞6

＜211＞17

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞6

agtgtactgg gaggagg 17

＜210＞7

＜211＞16

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞7

ataagtccgt gcgtcc 16