本發(fā)明涉及一種用于鑒定牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒的引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牛支原體(Mycoplasma bovis，MB)和牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea，BVDV)是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。兩種病原體均能引起牛呼吸道疾病，臨床癥狀態(tài)相似，難以區(qū)分，且常以混合感染形式存在，感染后都會(huì)引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此急需建立牛支原體和牛病毒性腹瀉的快速檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)MB和BVDV的防控提供技術(shù)支持。

牛支原體可引起犢牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和關(guān)節(jié)炎，以引起呼吸系統(tǒng)疾病最為多見。2008年我國(guó)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，此后陸續(xù)報(bào)導(dǎo)我國(guó)部分地區(qū)發(fā)生了牛支原體肺炎疫情，給肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于MB具有在牛體持續(xù)存在和條件性致病等特點(diǎn)，50年來(lái)其引起的疾病在獸醫(yī)臨床上一直缺乏有效的防控手段，既無(wú)有效疫苗，也無(wú)特效藥物，且隨著抗生素的不合理使用，使其耐藥株出現(xiàn)的頻率逐年增加，給該病的防控增加了困難。

牛病毒性腹瀉病毒是一種牛的“呼吸道病毒”，可在牛的下呼吸道和肺泡巨噬細(xì)胞中分離到。所有的BVDV毒株都是免疫抑制的，使感染的牛繼發(fā)細(xì)菌性或病毒性肺炎。1型的BVDV毒株(1a和1b,生物非細(xì)胞致病基因)常在牛肺中分離到，且常與呼吸道性疾病發(fā)生有關(guān)，2型的BVDV毒株會(huì)導(dǎo)致犢牛出現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎、血小板減少、骨髓壞死和腹瀉，持續(xù)感染BVDV的犢牛或母牛一旦發(fā)病會(huì)迅速形成細(xì)菌性肺炎。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒的引物組及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先保護(hù)一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物對(duì)甲和引物對(duì)乙組成；

(a2)所述引物對(duì)甲；

(a3)所述引物對(duì)乙；

所述引物對(duì)甲由引物F1和引物R1組成；

所述引物F1為如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R1為如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物對(duì)乙由引物F2和引物R2組成；

所述引物F2為如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(c2)將序列3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R2為如下(c3)或(c4)：

(c3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(c4)將序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鑒別牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒；

(d2)鑒定待測(cè)病原微生物是否為牛支原體或牛病毒性腹瀉病毒；

(d3)鑒定待測(cè)樣本是否感染了牛支原體和/或牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鑒別牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒；

(d2)鑒定待測(cè)病原微生物是否為牛支原體或牛病毒性腹瀉病毒；

(d3)鑒定待測(cè)樣本是否感染了牛支原體和/或牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鑒別牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒；

(d2)鑒定待測(cè)病原微生物是否為牛支原體或牛病毒性腹瀉病毒；

(d3)鑒定待測(cè)樣本是否感染了牛支原體和/或牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒別待測(cè)病原微生物為牛支原體還是牛病毒性腹瀉病毒的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)病原微生物的核酸；

(2)以步驟(1)得到的核酸為模板，采用所述引物對(duì)甲和所述引物對(duì)乙進(jìn)行二重二溫式PCR，然后進(jìn)行如下判斷：如果得到大小為412bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病原微生物為牛支原體；如果得到大小為170bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病原微生物為牛病毒性腹瀉病毒。

所述待測(cè)病原微生物為牛支原體或牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)病原微生物是否為牛支原體或牛病毒性腹瀉病毒的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)病原微生物的核酸；

(2)以步驟(1)得到的核酸為模板，采用所述引物對(duì)甲和所述引物對(duì)乙進(jìn)行二重二溫式PCR，然后進(jìn)行如下判斷：如果得到大小為412bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病原微生物為或候選為牛支原體；如果得到大小為170bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病原微生物為或候選為牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)樣本是否感染牛支原體和/或牛病毒性腹瀉病毒的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣本的核酸；

(2)以步驟(1)得到的核酸為模板，采用所述引物對(duì)甲和所述引物對(duì)乙進(jìn)行二重二溫式PCR，然后進(jìn)行如下判斷：如果得到大小為412bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)樣本感染或疑似感染牛支原體；如果得到大小為170bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)樣本感染或疑似感染牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒別待測(cè)病原微生物為牛支原體還是牛病毒性腹瀉病毒的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)病原微生物的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特異DNA分子或是否具有序列表的序列6所示的特異RNA分子，如果待測(cè)病原微生物的核酸中具有序列表的序列5所示的特異DNA分子、待測(cè)病原微生物為牛支原體，如果待測(cè)病原微生物的核酸中具有序列表的序列6所示的特異RNA分子、待測(cè)病原微生物為牛病毒性腹瀉病毒。所述待測(cè)病原微生物為牛支原體或牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)病原微生物是否為牛支原體或牛病毒性腹瀉病毒的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)病原微生物的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特異DNA分子或是否具有序列表的序列6所示的特異RNA分子，如果待測(cè)病原微生物的核酸中具有序列表的序列5所示的特異DNA分子、待測(cè)病原微生物為或候選為牛支原體，如果待測(cè)病原微生物的核酸中具有序列表的序列6所示的特異RNA分子、待測(cè)病原微生物為或候選為牛病毒性腹瀉病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)樣本是否感染牛支原體和/或牛病毒性腹瀉病毒的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)樣本的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特異DNA分子和/或是否具有序列表的序列6所示的特異RNA分子，如果待測(cè)樣本的核酸中具有序列表的序列5所示的特異DNA分子、待測(cè)樣本感染或疑似感染牛支原體，如果待測(cè)樣本的核酸中具有序列表的序列6所示的特異RNA分子、待測(cè)樣本感染或疑似感染牛病毒性腹瀉病毒。

以上任一所述待測(cè)病原微生物為牛支原體、牛病毒性腹瀉病毒、傳染性牛鼻氣管炎病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、藍(lán)舌病病毒、牛輪狀病毒或小反芻獸疫病毒。所述傳染性牛鼻氣管炎病毒為傳染性牛鼻氣管炎病毒Nu/67株。所述口蹄疫病毒為口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒O型或口蹄疫病毒AsiaⅠ型。所述水泡性口炎病毒為水泡性口炎病毒NJ型或水泡性口炎病毒IND型。所述藍(lán)舌病病毒為藍(lán)舌病病毒血清4型、藍(lán)舌病病毒血清8型、藍(lán)舌病病毒血清9型、藍(lán)舌病病毒血清15型、藍(lán)舌病病毒血清17型或藍(lán)舌病病毒血清18型。所述牛輪狀病毒為牛輪狀病毒NCDV株或牛輪狀病毒014株。所述小反芻獸疫病毒為小反芻獸疫病毒Nigeria75/1株。

以上任一所述牛支原體為牛支原體GL-1株或牛支原體BS-1株。以上任一所述牛病毒性腹瀉病毒為牛病毒性腹瀉病毒Oregon株、牛病毒性腹瀉病毒NADL株或牛病毒性腹瀉病毒牦牛株。

以上任一所述待測(cè)樣本為離體的動(dòng)物組織，例如牛肉、牛肉加工制成的食品、牛內(nèi)臟，牛內(nèi)臟加工制成的食品等等。

以上任一所述核酸為DNA和RNA的混合物。

以上任一所述提取待測(cè)樣本的核酸為使用RNA/DNA共提試劑盒提取得到的核酸。

以上任一所述二重二溫式PCR的反應(yīng)體系中具有反轉(zhuǎn)錄酶，例如AMV反轉(zhuǎn)錄酶。

以上任一所述二重二溫式PCR的退火延伸溫度為52℃～68℃，優(yōu)選為67℃。以上任一所述二重二溫式PCR的最優(yōu)反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。

以上任一所述二重二溫式PCR的初始反應(yīng)體系為(25μL)：AMV反轉(zhuǎn)錄酶1～5U、MgCl₂ 1～10mmol/L、Taq DNA Polymerase 1～5U、dNTP 0.1～0.8mmol/L、每條引物1～10pmol/μL。以上任一所述二重二溫式PCR的最優(yōu)初始反應(yīng)體系為(25μL)：AMV反轉(zhuǎn)錄酶5U、MgCl₂ 1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase 2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量為水。

反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶AMV，可高效反轉(zhuǎn)錄RNA，且不影響DNA的擴(kuò)增。多重PCR是一種高效的PCR，可在同一個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)，同時(shí)鑒別檢測(cè)多種病原體，在多種病原混合感染的鑒別診斷上具有很高的優(yōu)勢(shì)和臨床實(shí)用價(jià)值。二溫式PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而成的更簡(jiǎn)便的PCR檢測(cè)技術(shù)，二溫式PCR將退火和延伸在同一溫度下完成，退化溫度比常規(guī)三溫式PCR的高，因此不僅提高了PCR的特異性，且二溫式PCR省略了反復(fù)升溫降溫的時(shí)間消耗，節(jié)省時(shí)間，提高疾病的診斷效率。本發(fā)明提供的方法，全程只需一次抽提、一次PCR、一次電泳即可檢測(cè)兩種病原，非常適合混合感染的樣品，省時(shí)省力。

近幾年養(yǎng)牛飼業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，疫病防治工作正面臨著前所未有的壓力，需要簡(jiǎn)便、快速、高通量檢測(cè)技術(shù)以保證養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。本發(fā)明提供了用于鑒定牛支原體(MB)的引物對(duì)甲和用于鑒定牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的引物對(duì)乙，并基于兩個(gè)引物對(duì)開發(fā)了二重二溫式PCR方法。采用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙，通過(guò)二重二溫式PCR檢測(cè)牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒，具有特異性好、靈敏度高、普適性好、方便快速等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。本發(fā)明為牛病的防控提供了新的技術(shù)方法，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例4的結(jié)果。

圖2為實(shí)施例5的結(jié)果。

圖3為實(shí)施例6的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。RNA/DNA共提試劑盒：大連寶生物公司。pEASY-T1載體：大連寶生物公司。實(shí)施例中用到的各個(gè)毒株見表1。

表1

實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)

對(duì)牛支原體的基因組DNA以及牛病毒性腹瀉病毒的總RNA對(duì)應(yīng)的DNA進(jìn)行序列分析，在序列分析的基礎(chǔ)上選擇靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，得到由數(shù)千個(gè)引物對(duì)組成的引物對(duì)庫(kù)。對(duì)引物對(duì)庫(kù)中的各個(gè)引物對(duì)一一進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)引物對(duì)的靈敏度、特異性和普適性，最終得到用于鑒定牛支原體的引物對(duì)甲和用于鑒定牛病毒性腹瀉病毒的引物對(duì)乙。

引物對(duì)甲由如下引物F1和引物R1組成(5’→3’)：

F1(序列表的序列1)：GCAACATGAAACCTTATACGA；

R1(序列表的序列2)：ATCCTCATAGAATTGTTCAAAGA。

引物對(duì)乙由如下引物F2和引物R2組成(5’→3’)：

F2(序列表的序列3)：CCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAG；

R2(序列表的序列4)：GGCCTCTGCAGCACCCTAT。

引物對(duì)甲的靶序列為412bp。引物對(duì)乙的靶序列為170bp。

實(shí)施例2、參數(shù)優(yōu)化

引物對(duì)甲和引物對(duì)乙進(jìn)行二重二溫式PCR的參數(shù)優(yōu)化。被優(yōu)化的參數(shù)包括反應(yīng)體系的參數(shù)和反應(yīng)程序的參數(shù)。反應(yīng)體系的參數(shù)包括(25μL)：初始反應(yīng)體系中，AMV反轉(zhuǎn)錄酶的含量、MgCl₂的濃度、Taq DNA Polymerase的含量、dNTP的濃度、各條引物的濃度。反應(yīng)程序的參數(shù)包括：退火延伸溫度。

建議初始反應(yīng)體系為(25μL)：AMV反轉(zhuǎn)錄酶1～5U、MgCl₂ 1～10mmol/L、Taq DNA Polymerase 1～5U、dNTP 0.1～0.8mmol/L、每條引物1～10pmol/μL。最優(yōu)初始反應(yīng)體系為(25μL)：AMV反轉(zhuǎn)錄酶5U、MgCl₂ 1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量為水。

建議退火延伸溫度為52℃～68℃。最優(yōu)退火延伸溫度為67℃。最優(yōu)反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。

實(shí)施例3、方法的建立

1、采用RNA/DNA共提試劑盒提取待測(cè)樣本的核酸。

2、取步驟1得到的核酸，作為模板，進(jìn)行二重二溫式PCR。

初始反應(yīng)體系為(25μL)：AMV反轉(zhuǎn)錄酶5U、MgCl₂ 1.5mmol/L、TaqDNAPolymerase2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量為水。

反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。

3、取步驟2的產(chǎn)物，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。

實(shí)施例4、特異性實(shí)驗(yàn)

待測(cè)樣本為：表1中的所有毒株，以及牛支原體BS-1株和牛病毒性腹瀉病毒Oregon株的混合物。

按照實(shí)施例3建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。

設(shè)置用牛肉作為待測(cè)樣本的陰性對(duì)照。

部分結(jié)果見圖1。圖1中，M對(duì)應(yīng)DNA marker(100bp ladder)，1對(duì)應(yīng)牛病毒性腹瀉病毒Oregon株，2對(duì)應(yīng)牛支原體BS-1株，3對(duì)應(yīng)混合物，4對(duì)應(yīng)口蹄疫病毒A型，5對(duì)應(yīng)水泡性口炎病毒NJ型，6對(duì)應(yīng)藍(lán)舌病病毒血清4型，7對(duì)應(yīng)傳染性牛鼻氣管炎病毒Nu/67株，8對(duì)應(yīng)牛輪狀病毒NCDV株，9對(duì)應(yīng)小反芻獸疫病毒Nigeria75/1株，10對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照。

牛支原體GL-1株和牛支原體BS-1株均在300bp-500bp之間顯示一條特異性條帶，經(jīng)測(cè)序均為412bp。牛病毒性腹瀉病毒Oregon株、牛病毒性腹瀉病毒NADL株和牛病毒性腹瀉病毒牦牛株均在100bp-200bp之間顯示一條特異性條帶，經(jīng)測(cè)序均為170bp?；旌衔镲@示兩條特異條帶，經(jīng)測(cè)序，一條為412bp，另一條為170bp。其他各個(gè)毒株均不顯示任何條帶。

結(jié)果表明，采用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙通過(guò)二重二溫式PCR檢測(cè)牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒具有如下優(yōu)點(diǎn)：對(duì)其它病毒不存在非特異性擴(kuò)增，對(duì)宿主動(dòng)物(牛)不存在非特異性擴(kuò)增，特異性優(yōu)良；對(duì)牛支原體具有良好的普適性，各個(gè)毒株均得到412bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)牛病毒性腹瀉病毒具有良好的普適性，各個(gè)毒株均得到170bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；可以實(shí)現(xiàn)對(duì)混合含有牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒的樣本的檢測(cè)，并同時(shí)讀出結(jié)果。

實(shí)施例5、敏感性實(shí)驗(yàn)

將序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子，克隆入pEASY-T1載體，得到標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。

制備序列表的序列6所示的標(biāo)準(zhǔn)品RNA。

以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA為溶質(zhì)，以雙蒸水為溶劑，得到各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液1中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1×10⁸拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液2中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1×10⁷拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液3中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1×10⁶拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液4中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1×10⁵拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液5中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1×10⁴拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液6中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1×10³拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液7中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1×10²拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液8中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為10拷貝/μL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液9中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度均為1拷貝/μL。

以標(biāo)準(zhǔn)品溶液為模板，按照實(shí)施例3建立的方法(步驟2和步驟3)進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見圖2。圖2中，M對(duì)應(yīng)DNA marker(100bp ladder)，1至9依次對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液1至標(biāo)準(zhǔn)品溶液9。

結(jié)果表明，采用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙通過(guò)二重二溫式PCR檢測(cè)牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒具有如下優(yōu)點(diǎn)：對(duì)牛支原體的的最低檢測(cè)限為10000個(gè)拷貝，對(duì)牛病毒性腹瀉病毒的最低檢測(cè)限為10000個(gè)拷貝。

實(shí)施例6、干擾性實(shí)驗(yàn)

以實(shí)施例5制備的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和實(shí)施例5制備的標(biāo)準(zhǔn)品RNA為溶質(zhì)，以雙蒸水為溶劑，得到各個(gè)樣品溶液。樣品溶液A中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度為10⁵拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度為10⁷拷貝/μL。樣品溶液B中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度為10⁷拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度為10⁵拷貝/μL。樣品溶液C中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度為10⁸拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度為10⁴拷貝/μL。樣品溶液D中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度為10⁴拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度為10⁸拷貝/μL。樣品溶液E中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度為10⁴拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)品RNA的濃度為10⁵拷貝/μL。

以樣品溶液為模板，按照實(shí)施例3建立的方法(步驟2和步驟3)進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見圖3。圖3中，M對(duì)應(yīng)DNA marker(100bp ladder)，1至5依次對(duì)應(yīng)樣品溶液A至樣品溶液E。

結(jié)果表明，采用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙通過(guò)二重二溫式PCR檢測(cè)牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒具有如下優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)一個(gè)引物對(duì)的靶標(biāo)物濃度較高，而另一個(gè)模板的靶標(biāo)物濃度較低時(shí)，依然可以同時(shí)檢測(cè)到兩種靶標(biāo)物，不影響擴(kuò)增效率，相互不受干擾。

實(shí)施例7、方法的實(shí)際應(yīng)用

待測(cè)樣本分別為：3株牛支原體廣西分離株、14株牛病毒性腹瀉病毒廣西分離株。

按照實(shí)施例3建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。

3株牛支原體廣西分離株均在300bp-500bp之間顯示一條特異性條帶，經(jīng)測(cè)序均為412bp。14株牛病毒性腹瀉病毒廣西分離株均在100bp-200bp之間顯示一條特異性條帶，經(jīng)測(cè)序均為170bp。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120> 用于鑒定牛支原體和牛病毒性腹瀉病毒的引物組及其應(yīng)用

<130> GNCYX170638

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaacatgaa accttatacg a 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcctcatag aattgttcaa aga 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgagtaca gggtagtcgt cag 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcctctgca gcaccctat 19

<210> 5

<211> 412

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaacatgaa accttatacg aaaatggctt gttaataaaa aacaaagact ataacttttg 60

gattaatcag tttaataaaa ttaaagaaat tttaagtttc aaaaacaata attatattaa 120

tgaactaact aacaaaatgc atcaagcagc caataatatg caatttgaac ttgcattatt 180

tttgcgtgat ggcttaacat atttaaaaaa gttaaaagaa agtcaaatta tagagctaag 240

tcaatataaa aatattgacg tatttgctta taaaacagac gaaaaattaa tttttgctac 300

agttttgttc tatcgctatg gaatattaat caacaaggtt aatttaacaa ttccactagg 360

tttaagtgtt gatgaatcac ttagagtttt ctttgaacaa ttctatgagg at 412

<210> 6

<211> 170

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccugaguaca ggguagucgu cagugguucg acgcuuugug cgacaagccu cgagaugcca 60

cguggacgag ggcaugccca cagcacaucu uaaccugagc gggggucguu caggugaaaa 120

cgguuuaacc aaccgcuacg aauacagccu gauagggugc ugcagaggcc 170