本發(fā)明屬于苦瓜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法。
背景技術(shù)：
苦瓜(Momordica charantia L.)為葫蘆科苦瓜屬一年生攀緣草本植物，具較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食療功效。近年來(lái)，苦瓜種植面積不斷增加，已成為“南菜北運(yùn)”的主要蔬菜品種和特色產(chǎn)業(yè)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)一步加快了育種的進(jìn)程。
苦瓜DNA的提取是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的前提。以苦瓜葉片為材料，利用CTAB進(jìn)行DNA提取，是目前廣泛應(yīng)用的方法，該方法DNA提取量較多、純度也較高，可滿足大部分分子生物學(xué)研究要求。但該方法有機(jī)試劑處理次數(shù)過(guò)多、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。而以苦瓜葉片為DNA提取材料，受到苦瓜生長(zhǎng)季節(jié)的限制，并增加了穴盤(pán)、基質(zhì)以及人工點(diǎn)種的費(fèi)用。
公開(kāi)于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開(kāi)了一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，該方法是取待測(cè)苦瓜種子樣品，單粒提取DNA，每粒種子裝入2mL圓頭離心管中，內(nèi)放兩顆2mm直徑鋼珠，液氮速凍45s，然后采用高通量組織研磨器破碎，頻率設(shè)定75Hz，時(shí)間設(shè)定90s，通過(guò)對(duì)CTAB裂解液、酚-氯仿-異戊醇濃度和處理時(shí)間，增加顛倒混勻次數(shù)、離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速等方面進(jìn)行改進(jìn)，充分提取DNA。
本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是：
一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，包括如下步驟：
(1)取苦瓜種子1粒，去掉種皮后，用滅菌的刀片將其剖成4半，裝入2mL圓頭離心管，離心管內(nèi)置兩顆2mm直徑鋼珠，液氮速凍45s，采用高通量組織研磨器研磨破碎，參數(shù)設(shè)定頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；
(2)加入1.5mL試劑A，混勻后，置于65℃水浴鍋中水浴45-60min，水浴期間每隔5min將離心管上下顛倒混勻1次；
(3)水浴后，用離心機(jī)離心10min；
(4)取上清，加入等體積的試劑B，上下顛倒混勻3-5min，離心管加入苯酚后要?jiǎng)×翌嵉箵u勻50次以上，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心10min；
(5)按照上述步驟(4)重復(fù)操作1次；
(6)離心后，取上清，加入等體積試劑C進(jìn)行抽提，輕輕搖晃15-20min，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min；
(7)按照上述步驟(6)重復(fù)操作1次；
(8)離心后，移液器輕輕地吸取上清夜至1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的試劑D，離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30s，使試劑D與水層充分混合至能見(jiàn)到DNA絮狀物，于4℃下沉淀30min；
(9)待沉淀結(jié)束后，用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10min，棄上清，用無(wú)水乙醇清洗，在通風(fēng)廚里晾干，用1×TE溶解，同時(shí)加入1.5μL RNA酶，再將其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜單粒種子DNA；
(10)將得到的苦瓜單粒種子DNA置于-20℃下保存，備用。
作為優(yōu)選，步驟(1)中苦瓜的品種為桂農(nóng)科3號(hào)、桂農(nóng)科6號(hào)或翠竹。
作為優(yōu)選，步驟(1)中所述的高通量組織研磨器的參數(shù)設(shè)定為：頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述的試劑A在使用前提前預(yù)熱至65℃。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述的試劑A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，質(zhì)量濃度2％的CTAB、質(zhì)量濃度1％的PVP-40和質(zhì)量濃度0.5％的β-巰基乙醇，其余為蒸餾水；pH8.0。
作為優(yōu)選，步驟(3)中所述的離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為12000r/min。
作為優(yōu)選，步驟(4)中所述的試劑B包括：Tris-HCl平衡苯酚與等體積的氯仿/異戊醇(24：1)混合均勻，棕色瓶4℃保存。
作為優(yōu)選，步驟(6)中所述的試劑C包括：將氯仿和異戊醇按照體積比24：1混合均勻，棕色瓶4℃保存。
作為優(yōu)選，步驟(8)中所述的試劑D包括異丙醇和醋酸鈉，二者的體積質(zhì)量比為10:1。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)檢測(cè)速度快：以種子為材料提取DNA可以不受采樣時(shí)間、地點(diǎn)的限制，也解除了提取DNA過(guò)程中需要液氮研磨的麻煩。采用一臺(tái)高通量組織研磨器(寧波新芝Scientz-192)可在90秒內(nèi)完成96個(gè)樣品的研磨，大大縮短研磨時(shí)間，比過(guò)去研磨效率至少提高30倍。
(2)結(jié)果可靠：實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利用本方法提取DNA，速度快，質(zhì)量高。將DNA濃度稀釋至60ng/μL，采用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品OD260/OD280為1.82。說(shuō)明該方法提取的苦瓜基因組DNA純度和完整性較好，可進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。
(3)成本低：由于采用種子進(jìn)行DNA提取，工作量大大降低，節(jié)省時(shí)間和人力物力，加速了苦瓜分子育種的效率和進(jìn)程。
附圖說(shuō)明
圖1為采用本發(fā)明的提取方法得到的苦瓜單粒種子提取DNA的凝膠電泳圖譜；
有關(guān)附圖標(biāo)記的說(shuō)明：
泳道1-6為桂農(nóng)科3號(hào)苦瓜種子DNA；泳道7-12為桂農(nóng)科6號(hào)苦瓜種子DNA；泳道13-18為翠竹苦瓜種子DNA。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1：
一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，包括如下步驟：
(1)取苦瓜種子1粒，去掉種皮后，用滅菌的刀片將種子剖成4半，裝入2mL圓頭離心管，離心管內(nèi)置兩顆2mm直徑鋼珠，液氮速凍45s，采用高通量組織研磨器研磨破碎，參數(shù)設(shè)定頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；所述的苦瓜的品種為桂農(nóng)科3號(hào)；所述的高通量組織研磨器的參數(shù)設(shè)定為：頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；
(2)加入1.5mL試劑A，混勻后，置于65℃水浴鍋中水浴45-60min，水浴期間每隔5min將離心管上下顛倒混勻1次；所述的試劑A在使用前提前預(yù)熱至65℃；所述的試劑A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，質(zhì)量濃度2％的CTAB、質(zhì)量濃度1％的PVP-40和質(zhì)量濃度0.5％的β-巰基乙醇，其余為蒸餾水；pH8.0；
(3)水浴后，用離心機(jī)離心10min；所述的離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為12000r/min；
(4)取上清，加入等體積的試劑B，上下顛倒混勻3-5min，離心管加入苯酚后要?jiǎng)×翌嵉箵u勻50次以上，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心10min；所述的試劑B包括：Tris-HCl平衡苯酚與等體積的氯仿/異戊醇(24：1)混合均勻，棕色瓶4℃保存；
(5)按照上述步驟(4)重復(fù)操作1次；
(6)離心后，取上清，加入等體積試劑C進(jìn)行抽提，輕輕搖晃15-20min，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min；所述的試劑C包括：將氯仿和異戊醇按照體積比24：1混合均勻，棕色瓶4℃保存；
(7)按照上述步驟(6)重復(fù)操作1次；
(8)離心后，移液器輕輕地吸取上清夜至1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的試劑D，離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30s，使試劑D與水層充分混合至能見(jiàn)到DNA絮狀物，于4℃下沉淀30min；所述的試劑D包括異丙醇和醋酸鈉，二者的體積質(zhì)量比為10:1；
(9)待沉淀結(jié)束后，用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10min，棄上清，用無(wú)水乙醇清洗，在通風(fēng)廚里晾干，用1×TE溶解，同時(shí)加入1.5μL RNA酶，再將其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜單粒種子DNA；
(10)將得到的苦瓜單粒種子DNA置于-20℃下保存，備用。
實(shí)施例2：
一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，包括如下步驟：
(1)取苦瓜種子1粒，去掉種皮后，用滅菌的刀片將種子剖成4半，裝入2mL圓頭離心管，離心管內(nèi)置兩顆2mm直徑鋼珠，液氮速凍45s，采用高通量組織研磨器研磨破碎，參數(shù)設(shè)定頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；所述的苦瓜的品種為桂農(nóng)科6號(hào)；所述的高通量組織研磨器的參數(shù)設(shè)定為：頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；
(2)加入1.5mL試劑A，混勻后，置于65℃水浴鍋中水浴45-60min，水浴期間每隔5min將離心管上下顛倒混勻1次；所述的試劑A在使用前提前預(yù)熱至65℃；所述的試劑A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，質(zhì)量濃度2％的CTAB、質(zhì)量濃度1％的PVP-40和質(zhì)量濃度0.5％的β-巰基乙醇，其余為蒸餾水；pH8.0；
(3)水浴后，用離心機(jī)離心10min；所述的離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為12000r/min；
(4)取上清，加入等體積的試劑B，上下顛倒混勻3-5min，離心管加入苯酚后要?jiǎng)×翌嵉箵u勻50次以上，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心10min；所述的試劑B包括：Tris-HCl平衡苯酚與等體積的氯仿/異戊醇(24：1)混合均勻，棕色瓶4℃保存；
(5)按照上述步驟(4)重復(fù)操作1次；
(6)離心后，取上清，加入等體積試劑C進(jìn)行抽提，輕輕搖晃15-20min，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min；所述的試劑C包括：將氯仿和異戊醇按照體積比24：1混合均勻，棕色瓶4℃保存；
(7)按照上述步驟(6)重復(fù)操作1次；
(8)離心后，移液器輕輕地吸取上清夜至1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的試劑D，離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30s，使試劑D與水層充分混合至能見(jiàn)到DNA絮狀物，于4℃下沉淀30min；所述的試劑D包括異丙醇和醋酸鈉，二者的體積質(zhì)量比為10:1；
(9)待沉淀結(jié)束后，用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10min，棄上清，用無(wú)水乙醇清洗，在通風(fēng)廚里晾干，用1×TE溶解，同時(shí)加入1.5μL RNA酶，再將其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜單粒種子DNA；
(10)將得到的苦瓜單粒種子DNA置于-20℃下保存，備用。
實(shí)施例3：
一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，包括如下步驟：
(1)取苦瓜種子1粒，去掉種皮后，用滅菌的刀片將種子剖成4半，裝入2mL圓頭離心管，離心管內(nèi)置兩顆2mm直徑鋼珠，液氮速凍45s，采用高通量組織研磨器研磨破碎，參數(shù)設(shè)定頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；所述的苦瓜的品種為翠竹；所述的高通量組織研磨器的參數(shù)設(shè)定為：頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；
(2)加入1.5mL試劑A，混勻后，置于65℃水浴鍋中水浴45-60min，水浴期間每隔5min將離心管上下顛倒混勻1次；所述的試劑A在使用前提前預(yù)熱至65℃；所述的試劑A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，質(zhì)量濃度2％的CTAB、質(zhì)量濃度1％的PVP-40和質(zhì)量濃度0.5％的β-巰基乙醇，其余為蒸餾水；pH8.0；
(3)水浴后，用離心機(jī)離心10min；所述的離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為12000r/min；
(4)取上清，加入等體積的試劑B，上下顛倒混勻3-5min，離心管加入苯酚后要?jiǎng)×翌嵉箵u勻50次以上，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心10min；所述的試劑B包括：Tris-HCl平衡苯酚與等體積的氯仿/異戊醇(24：1)混合均勻，棕色瓶4℃保存；
(5)按照上述步驟(4)重復(fù)操作1次；
(6)離心后，取上清，加入等體積試劑C進(jìn)行抽提，輕輕搖晃15-20min，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min；所述的試劑C包括：將氯仿和異戊醇按照體積比24：1混合均勻，棕色瓶4℃保存；
(7)按照上述步驟(6)重復(fù)操作1次；
(8)離心后，移液器輕輕地吸取上清夜至1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的試劑D，離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30s，使試劑D與水層充分混合至能見(jiàn)到DNA絮狀物，于4℃下沉淀30min；所述的試劑D包括異丙醇和醋酸鈉，二者的體積質(zhì)量比為10:1；
(9)待沉淀結(jié)束后，用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10min，棄上清，用無(wú)水乙醇清洗，在通風(fēng)廚里晾干，用1×TE溶解，同時(shí)加入1.5μL RNA酶，再將其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜單粒種子DNA；
(10)將得到的苦瓜單粒種子DNA置于-20℃下保存，備用。
將實(shí)施例1-3中得到苦瓜單粒種子DNA濃度稀釋至60ng/μL，采用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)苦瓜單粒種子DNA的純度和完整性，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品的OD260/OD280為1.82。采用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。
如圖1所示，本發(fā)明方法提取的苦瓜基因組DNA純度和完整性較好，可進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。
前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。