本發(fā)明涉及細(xì)胞融合的方法，具體是一種基于復(fù)合脈沖電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞融合能夠?qū)崿F(xiàn)遠(yuǎn)源雜交，其意義在于打破了僅僅依賴有限雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，有可能形成有性雜交方式無法獲得的新型的雜交動物或植物細(xì)胞，擴(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。

細(xì)胞融合是生物制備的基本途徑。細(xì)胞能否有效融合是決定生物制備是否可行的關(guān)鍵，甚至成為制約生物制備技術(shù)發(fā)展的瓶頸。因此，如何發(fā)展和改進(jìn)現(xiàn)有的細(xì)胞融合方法、提升細(xì)胞融合的效果和效率，已成為國內(nèi)外生物制備領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)。

根據(jù)電融合的基本原理，細(xì)胞膜上出現(xiàn)足夠數(shù)量和尺寸的孔洞(即細(xì)胞電穿孔)，是細(xì)胞融合的先決條件。而細(xì)胞要發(fā)生電穿孔，細(xì)胞的跨膜電壓必須大于其細(xì)胞膜穿孔所需的電壓閾值。傳統(tǒng)的微秒脈沖在細(xì)胞融合時存在一定的缺陷，電穿孔的理論研究表明，在微秒脈沖作用下，細(xì)胞跨膜電壓值與細(xì)胞半徑呈顯著正相關(guān)。因此，微秒脈沖對細(xì)胞膜的電穿孔效應(yīng)與細(xì)胞尺寸有直接關(guān)系，當(dāng)融合不同尺寸的細(xì)胞時，作用相同場強(qiáng)的脈沖，半徑較大的細(xì)胞會先發(fā)生穿孔，半徑小的細(xì)胞后發(fā)生穿孔，換言之，當(dāng)小細(xì)胞發(fā)生穿孔的時候，大細(xì)胞可能已經(jīng)處于過度穿孔的死亡狀態(tài)?，F(xiàn)有技術(shù)中，當(dāng)兩種細(xì)胞的半徑相差1.5～5倍時，細(xì)胞難以融合或融合率極低。

納秒脈沖電場以其獨(dú)特的“細(xì)胞內(nèi)電處理”效應(yīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到越來越多的關(guān)注。所謂“細(xì)胞內(nèi)電處理”效應(yīng)，是指在外加納秒脈沖(脈沖寬度為ns級，電場強(qiáng)度為MV/m級)的作用下，細(xì)胞出現(xiàn)一種與前述微秒脈沖電穿孔現(xiàn)象截然不同的生物學(xué)效應(yīng)：細(xì)胞膜表面不會出現(xiàn)明顯的電穿孔現(xiàn)象(即膜表面保持完整)，但細(xì)胞內(nèi)部(如細(xì)胞核、線粒體等)卻出現(xiàn)一系列功能性改變，產(chǎn)生大量微核，同時誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡(也稱之為“凋亡”)。

事實(shí)上，納秒脈沖在透過細(xì)胞外膜作用于胞內(nèi)細(xì)胞器并誘導(dǎo)“細(xì)胞內(nèi)電處理”效應(yīng)的同時，也能作用在細(xì)胞外膜上并在其上產(chǎn)生大量納米級尺寸的微孔。仿真和實(shí)驗(yàn)證明，納秒脈沖對細(xì)胞膜的電穿孔效應(yīng)與細(xì)胞尺寸沒有關(guān)系，納秒脈沖能夠用于不同尺寸細(xì)胞的融合。但是納秒脈沖應(yīng)用于細(xì)胞融合時存在一定的缺陷，納秒脈沖電壓作用于細(xì)胞后，雖然會在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生穿孔，但是穿孔的孔徑很小，并且持續(xù)的時間很短，很可能導(dǎo)致細(xì)胞還未融合，細(xì)胞膜上的穿孔就已經(jīng)復(fù)原。

因此，單純利用納秒或者微秒脈沖進(jìn)行細(xì)胞融合都具有一定的缺陷，如果能結(jié)合利用納秒脈沖與微秒脈沖的優(yōu)勢，采取復(fù)合脈沖電場的形式作用于細(xì)胞融合，對于細(xì)胞電融合領(lǐng)域具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前國際上廣泛使用的將微秒脈沖作用細(xì)胞融合。本發(fā)明的目的是解決微秒脈沖作用不同尺寸細(xì)胞融合時，存在難融合和效率低的問題。微秒脈沖對細(xì)胞膜的電穿孔效應(yīng)與細(xì)胞尺寸有直接關(guān)系，當(dāng)小細(xì)胞發(fā)生穿孔的時候，大細(xì)胞可能已經(jīng)處于過度穿孔的死亡狀態(tài)，針對這種缺陷,提出一種基于復(fù)合脈沖電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法。

具體是將納秒脈沖引入細(xì)胞電融合，使細(xì)胞膜先在納秒脈沖的作用下產(chǎn)生微小的“孔洞”，然后再將微秒脈沖作用細(xì)胞，使“孔洞”進(jìn)一步增大，從而一定程度上提高電融合的成功率。本方法不僅可以用于相同尺寸的細(xì)胞電融合，而且可以用于融合不同尺寸的細(xì)胞。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，基于復(fù)合脈沖電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將不同尺寸的細(xì)胞和融合液置于細(xì)胞培養(yǎng)槽內(nèi)；

融合槽極板的間距無要求，不同間距的融合槽只需要改變所施加脈沖的電壓即可保證得到相應(yīng)的場強(qiáng)。

2)將正弦交流電壓施加于細(xì)胞培養(yǎng)槽的兩極，細(xì)胞將排隊(duì)且彼此緊貼；

3)通過開關(guān)切換，將培養(yǎng)槽兩極上所施加的正弦電壓切換為納秒脈沖電壓，槽內(nèi)細(xì)胞發(fā)生微小電穿孔；

4)繼續(xù)通過開關(guān)切換，將納秒脈沖電壓切換為微秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于穿孔狀態(tài)的槽內(nèi)細(xì)胞，已處于開孔狀態(tài)的細(xì)胞上的孔進(jìn)一步增大，彼此緊貼的兩個細(xì)胞的外膜彼此連接，兩細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)互相融合，最終形成一個完整的融合細(xì)胞。

進(jìn)一步，所述步驟1)中不同尺寸的細(xì)胞包括大細(xì)胞或小細(xì)胞，所述大細(xì)胞的半徑范圍為5～15μm，所述大細(xì)胞的半徑是小細(xì)胞半徑的2～7倍；

所述大細(xì)胞的密度為2×10⁷～5×10⁷個/L，所述小細(xì)胞的密度是大細(xì)胞密度的五倍；

所述步驟1)中的細(xì)胞為植物細(xì)胞或動物細(xì)胞；如選擇的細(xì)胞為植物細(xì)胞，融合前需對植物細(xì)胞進(jìn)行去壁處理再進(jìn)行融合。

進(jìn)一步，所述步驟1)中的融合液包括體積比為(1～3)︰(1～3)︰(2～4)的PM緩沖液、酶液和CPW鹽溶液；

所述PM緩存液由MgCl₂、CaCl₂、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl₂的濃度為0.05～0.4mmol/L，CaCl₂的濃度為0.05～0.5mmol/L，山梨醇的濃度為200～500mmol；

所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成；所述Cellulase OnzukaR-10的濃度為0.5％～3％，Mecerozyme R-10的濃度為0.5％～2％，甘露醇的濃度為10％～30％；

所述CPW鹽溶液：KH₂P0₄、KN0₃、CaCl₂·2H₂0、MgS0₄·7H₂0、KI和CuS0₄·5H₂0配制而成；所述KH₂P0₄的濃度為15～30mg/L，KN0₃的濃度為80.0～110.0mg/L，CaCl₂·2H₂0的濃度為1200.0～1600.0mg/L，MgS0₄·7H₂0的濃度為210.0～260.0mg/L，KI的濃度為O.1～O.5mg/L，CuS0₄·5H₂0的濃度為0.025～0.1mg/L。

進(jìn)一步，所述步驟2)中正弦交流電壓參數(shù)范圍：0～100V，頻率0～1MHz，持續(xù)時間：0～100s。

進(jìn)一步，所述步驟3)中的納秒脈沖是通過電容充放電實(shí)現(xiàn)的。

進(jìn)一步，所述步驟3)中納秒脈沖參數(shù)：0～5000V(場強(qiáng)0～15kV/cm)作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度50ns～500ns。

進(jìn)一步，所述步驟4)中的微秒脈沖參數(shù)：0～3000V(場強(qiáng)0～9kV/cm)，作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度15μs～400μs。

進(jìn)一步，所述步驟4)中得到的融合細(xì)胞除不同尺寸細(xì)胞融合而成外，還能夠是相同尺寸細(xì)胞融合而成。

值得說明的是：

1)正弦交流電壓作用的終止條件：觀察到細(xì)胞排隊(duì)；正弦交流電壓到微秒脈沖電壓的切換時間在5μs內(nèi)。

2)納秒脈沖作用的終止條件：通過施加納秒脈沖的個數(shù)來控制；

例如：預(yù)計施加5個納秒脈沖，當(dāng)施加到5個納秒脈沖后，就立即切換到微秒脈沖)。

3)微秒脈沖作用的終止條件：通過施加微秒脈沖的個數(shù)來控制；

例如：預(yù)計施加5個微秒脈沖，當(dāng)施加到5個微秒脈沖后，就立馬停止施加脈沖)。

本發(fā)明的技術(shù)效果是十分顯著的，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)傳統(tǒng)的細(xì)胞電融合采取的是微秒脈沖電融合，但是微秒脈沖具有一定的缺陷，對于融合不同尺寸的細(xì)胞時，大細(xì)胞會比小細(xì)胞先產(chǎn)生穿孔，因此作用相同強(qiáng)度的電場的情況下，當(dāng)小細(xì)胞發(fā)生穿孔的時候，大細(xì)胞可能早已處于過度穿孔的死亡狀態(tài)。而本發(fā)明中的方案使用的復(fù)合脈沖作用細(xì)胞電融合，利用了納秒脈沖不具有“細(xì)胞尺寸敏感性”的優(yōu)勢，能很好的融合不同尺寸的細(xì)胞。

2)雖然納秒脈沖作用下細(xì)胞膜的電穿孔效應(yīng)與細(xì)胞尺寸沒有關(guān)系，納秒脈沖能夠用于不同尺寸細(xì)胞的融合。但是納秒脈沖應(yīng)用于細(xì)胞融合時存在一定的缺陷，納秒脈沖電壓作用于細(xì)胞后，雖然會在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生穿孔，但是穿孔的孔徑很小，并且持續(xù)的時間很短，很可能導(dǎo)致細(xì)胞還未融合，細(xì)胞膜上的穿孔就已經(jīng)復(fù)原。而本發(fā)明中的方案使用的復(fù)合脈沖作用細(xì)胞電融合，利用了微秒脈沖使細(xì)胞在納秒脈沖作用下產(chǎn)生的“孔洞”繼續(xù)維持并且進(jìn)一步擴(kuò)大，能夠很好的提高細(xì)胞融合的成功率。

3)基于復(fù)合脈沖電融合的方法，相比于傳統(tǒng)的微秒脈沖細(xì)胞電融合，能夠提高細(xì)胞融合的成功率。

附圖說明

圖1為ns脈沖電融合示意圖；

圖2為μs脈沖電融合示意圖；

圖3為ns/μs復(fù)合脈沖電場示意圖；

圖4和為本發(fā)明的工作流程圖；

圖5為細(xì)胞在正弦電壓作用下發(fā)生的雙向電泳排隊(duì)示意圖；

圖6為本發(fā)明的融合過程示意圖；

圖6中：(a)為經(jīng)過細(xì)胞排隊(duì)，細(xì)胞彼此接觸的示意圖；

(b)為由納秒脈沖作用使細(xì)胞連接部位產(chǎn)生穿孔，彼此粘接的示意圖；

(c)為經(jīng)過微秒脈沖使細(xì)胞連接部位的穿孔進(jìn)一步增大的示意圖；

(d)為兩個細(xì)胞彼此融合成一個細(xì)胞的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不應(yīng)該理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實(shí)施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：

基于復(fù)合脈沖電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將不同尺寸的細(xì)胞和融合液置于細(xì)胞培養(yǎng)槽內(nèi)；

1.1)所述不同尺寸的細(xì)胞包括大細(xì)胞或小細(xì)胞，所述大細(xì)胞的半徑范圍為5～15μm，所述大細(xì)胞的半徑是小細(xì)胞半徑的2～7倍；

所述大細(xì)胞的密度為2×10⁷～5×10⁷個/L，所述小細(xì)胞的密度是大細(xì)胞密度的五倍；

1.2)所述細(xì)胞為植物細(xì)胞或動物細(xì)胞；如選擇的細(xì)胞為植物細(xì)胞，融合前需對植物細(xì)胞進(jìn)行去壁處理再進(jìn)行融合過程。

1.3)所述融合液包括體積比為(1～3)︰(1～3)︰(2～4)的PM緩沖液、酶液和CPW鹽溶液；

所述PM緩存液由MgCl₂、CaCl₂、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl₂的濃度為0.05～0.4mmol/L，CaCl₂的濃度為0.05～0.5mmol/L，山梨醇的濃度為200～500mmol；

所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成；所述Cellulase OnzukaR-10的濃度為0.5％～3％，Mecerozyme R-10的濃度為0.5％～2％，甘露醇的濃度為10％～30％；

所述CPW鹽溶液：KH₂P0₄、KN0₃、CaCl₂·2H₂0、MgS0₄·7H₂0、KI和CuS0₄·5H₂0配制而成；所述KH₂P0₄的濃度為15～30mg/L，KN0₃的濃度為80.0～110.0mg/L，CaCl₂·2H₂0的濃度為1200.0～1600.0mg/L，MgS0₄·7H₂0的濃度為210.0～260.0mg/L，KI的濃度為O.1～O.5mg/L，CuS0₄·5H₂0的濃度為0.025～0.1mg/L。

1.4)所述融合槽極板的間距無要求，不同間距的融合槽只需要改變施加的脈沖的電壓即可保證得到相應(yīng)的場強(qiáng)。

2)將正弦交流電壓施加于細(xì)胞培養(yǎng)槽的兩極，細(xì)胞將排隊(duì)且彼此緊貼；

所述正弦交流電壓參數(shù)范圍：0～100V，頻率0～1MHz，持續(xù)時間：0～100s。

3)通過開關(guān)切換，將培養(yǎng)槽兩極上所施加的正弦電壓切換為納秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于排隊(duì)狀態(tài)的細(xì)胞，槽內(nèi)細(xì)胞發(fā)生微小電穿孔；

所述納秒脈沖是通過電容充放電實(shí)現(xiàn)的。

所述納秒脈沖參數(shù)：0～5000V(場強(qiáng)0～15kV/cm)，作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度50ns～500ns。

4)通過開關(guān)切換，將納秒脈沖電壓切換為微秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于穿孔狀態(tài)的槽內(nèi)細(xì)胞，已處于開孔狀態(tài)的細(xì)胞上的孔進(jìn)一步增大，彼此緊貼的兩個細(xì)胞的外膜彼此連接，兩細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)互相融合，最終形成一個完整的融合細(xì)胞。

所述微秒脈沖參數(shù)：0～3000V(場強(qiáng)0～9kV/cm)，作用個數(shù)1～1000個，脈沖間隔0.1S～10S(頻率0.1Hz～10Hz)，波形為脈沖方波，脈沖寬度15μs～400μs。

本步驟得到的所述融合細(xì)胞除不同尺寸細(xì)胞融合而成外，還能夠是相同尺寸細(xì)胞融合而成。

實(shí)施例2：

基于復(fù)合脈沖電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將不同尺寸的細(xì)胞和融合液置于細(xì)胞培養(yǎng)槽內(nèi)；

1.1)選擇細(xì)胞

大細(xì)胞為：鼠源骨髓瘤細(xì)胞，半徑為7.75±0.25μm；

小細(xì)胞為：鼠源B淋巴細(xì)胞，半徑為3.85±0.35μm；

1.2)選擇融合液(培養(yǎng)液)

所述電融合的融合液主要成分是葡萄糖，鈣離子，鎂離子。所述步驟1)中的融合液包括體積比為1︰1︰2的PM緩沖液、酶液和CPW鹽溶液；

所述PM緩存液由MgCl₂、CaCl₂、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl₂的濃度為0.05mmol/L，CaCl₂的濃度為0.05mmol/L，山梨醇的濃度為200mmol/L；

所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成；所述Cellulase OnzukaR-10的濃度為0.5％，Mecerozyme R-10的濃度為0.5％，甘露醇的濃度為10％；

所述CPW鹽溶液：KH₂P0₄、KN0₃、CaCl₂·2H₂0、MgS0₄·7H₂0、KI和CuS0₄·5H₂0配制而成；所述KH₂P0₄的濃度為15mg/L，KN0₃的濃度為80.0mg/L，CaCl₂·2H₂0的濃度為1200.0mg/L，MgS0₄·7H₂0的濃度為210.0mg/L，KI的濃度為O.1mg/L，CuS0₄·5H₂0的濃度為0.025mg/L。

1.3)選擇培養(yǎng)槽

選擇長方體型培養(yǎng)槽，培養(yǎng)槽間距為3.81mm，容積為9mL；

培養(yǎng)槽內(nèi)：大細(xì)胞的細(xì)胞密度約2×10⁷～5×10⁷個/L，小細(xì)胞的密度是大細(xì)胞的五倍。

2)將正弦交流電壓作用于細(xì)胞培養(yǎng)槽的兩極，細(xì)胞將排隊(duì)且彼此緊貼；

所述正弦交流電壓的參數(shù)為：電壓50V，1MHz，持續(xù)時間20s。

如圖5所示，即為細(xì)胞在正弦交流電壓作用下發(fā)生的雙向電泳排隊(duì)示意圖。

正弦交流電壓作用的終止條件：觀察到細(xì)胞排隊(duì)，正弦排隊(duì)電壓到微秒脈沖電壓的切換時間在5μs內(nèi)。

3)通過開關(guān)切換，將培養(yǎng)槽兩極上所施加的正弦交流電壓切換為納秒脈沖電壓，槽內(nèi)細(xì)胞發(fā)生微小電穿孔；

所述納秒脈沖電壓的參數(shù)為：幅值4000V，個數(shù)20個，脈沖間隔0.1s，脈沖寬度100ns；

4)繼續(xù)通過開關(guān)切換，將納秒脈沖電壓切換為微秒脈沖電壓，作用于已經(jīng)處于穿孔狀態(tài)的槽內(nèi)細(xì)胞，已處于開孔狀態(tài)的細(xì)胞上的孔進(jìn)一步增大，彼此緊貼的兩個細(xì)胞的外膜彼此連接，兩細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)互相融合，最終形成一個完整的融合細(xì)胞；

所述微秒脈沖電壓的參數(shù)(頻率、幅值等)：電壓45V,脈沖寬度15μs，作用個數(shù)2個，脈沖間隔時間0.1s(即頻率10Hz)。

整個過程如圖6所示，其中，(a)為經(jīng)過細(xì)胞排隊(duì)，細(xì)胞彼此接觸的示意圖；(b)為由納秒脈沖作用使細(xì)胞連接部位產(chǎn)生開孔，彼此粘接的示意圖；(c)為經(jīng)過微秒脈沖使細(xì)胞連接部位的孔進(jìn)一步增大的示意圖；(d)為兩個細(xì)胞彼此融合成一個細(xì)胞的示意圖。

對比例：

現(xiàn)有技術(shù)中，采用納秒脈沖的方法進(jìn)行細(xì)胞融合；如圖1所示即為納秒脈沖單獨(dú)作用于細(xì)胞融合的孔密度圖；圖中深色部分表示細(xì)胞穿孔的部位，納秒脈沖作用兩個不同尺寸的細(xì)胞融合時，雖然大細(xì)胞與小細(xì)胞的穿孔基本都發(fā)生在細(xì)胞連接處，但是產(chǎn)生的孔徑很小，并且孔持續(xù)時間很短，很可能導(dǎo)致兩細(xì)胞還沒有融合，穿孔就已經(jīng)恢復(fù)了。

現(xiàn)有技術(shù)中，采用微秒脈沖的方法進(jìn)行細(xì)胞融合；如圖2所示即為微秒脈沖單獨(dú)作用于細(xì)胞融合的孔密度圖，圖中深色部分表示細(xì)胞穿孔的部位，微秒脈沖作用兩個不同尺寸的細(xì)胞融合時，大細(xì)胞會先發(fā)生穿孔，當(dāng)小細(xì)胞發(fā)生穿孔的時候，大細(xì)胞可能已經(jīng)死亡。

相對于如圖1和圖2的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明中如圖3和圖4所示的本發(fā)明工作流程圖，采用了：首先脈沖寬度較小的納秒脈沖使細(xì)胞接觸區(qū)域產(chǎn)生微小的穿孔，繼而施加脈沖寬度相對較寬的微秒脈沖使細(xì)胞接觸區(qū)域的穿孔進(jìn)一步增大，以便于細(xì)胞的直接融合。

經(jīng)過對比可以很明顯的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中結(jié)合了納秒脈沖和微秒脈沖的優(yōu)勢，利用納秒脈沖先產(chǎn)生穿孔再微秒脈沖使孔進(jìn)一步增加，通過設(shè)置納秒和微秒的脈沖參數(shù)，可以有效的促使不同尺寸細(xì)胞間發(fā)生融合，提高不同尺寸細(xì)胞的融合效率。