1.基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)將不同尺寸的細(xì)胞和融合液置于細(xì)胞培養(yǎng)槽內(nèi);
2)將正弦交流電壓施加于細(xì)胞培養(yǎng)槽的兩極,細(xì)胞將排隊(duì)且彼此緊貼;
3)通過開關(guān)切換,將培養(yǎng)槽兩極上所施加的正弦交流電壓切換為納秒脈沖電壓,槽內(nèi)細(xì)胞發(fā)生微小電穿孔;
4)繼續(xù)通過開關(guān)切換,將納秒脈沖電壓切換為微秒脈沖電壓,作用于已經(jīng)處于穿孔狀態(tài)的槽內(nèi)細(xì)胞,已處于開孔狀態(tài)的細(xì)胞上的孔進(jìn)一步增大,彼此緊貼的兩個(gè)細(xì)胞的外膜彼此連接,兩細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)互相融合,最終形成一個(gè)完整的融合細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于:所述步驟1)中不同尺寸的細(xì)胞包括大細(xì)胞或小細(xì)胞,所述大細(xì)胞的半徑范圍為:5~15μm,所述大細(xì)胞的半徑是小細(xì)胞半徑的2~7倍;
所述大細(xì)胞的密度為2×107~5×107個(gè)/L,所述小細(xì)胞的密度是大細(xì)胞密度的五倍;
所述步驟1)中的細(xì)胞為植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞;如選擇的細(xì)胞為植物細(xì)胞,融合前需對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行去壁處理再進(jìn)行融合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于:所述步驟1)中的融合液包括體積比為(1~3):(1~3):(2~4)的PM緩沖液、酶液和CPW鹽溶液;
所述PM緩存液由MgCl2、CaCl2、山梨醇和三蒸水配制而成;所述MgCl2的濃度為0.05~0.4mmol/L,CaCl2的濃度為0.05~0.5mmol/L,山梨醇的濃度為200~500mmol;
所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成;所述Cellulase OnzukaR-10的濃度為0.5%~3%,Mecerozyme R-10的濃度為0.5%~2%,甘露醇的濃度為10%~30%;
所述CPW鹽溶液:KH2PO4、KNO3、CaCl2·2H2O、MgS04·7H2O、KI和CuSO4·5H2O配制而成;所述KH2PO4的濃度為15~30mg/L,KNO3的濃度為80.0~110.0mg/L,CaCl2·2H2O的濃度為1200.0~1600.0mg/L,MgSO4·7H2O的濃度為210.0~260.0mg/L,KI的濃度為O.1~O.5mg/L,CuSO4·5H2O的濃度為0.025~0.1mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于:所述步驟2)中正弦交流電壓參數(shù)范圍:0~100V,頻率0~1MHz,持續(xù)時(shí)間:0~100s。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于:所述步驟3)中的納秒脈沖是通過電容充放電實(shí)現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于:所述步驟3)中納秒脈沖參數(shù):0~5000V(場(chǎng)強(qiáng)0~15kV/cm),作用個(gè)數(shù)1~1000個(gè),脈沖間隔0.1S~10S(頻率0.1Hz~10Hz),波形為脈沖方波,脈沖寬度50ns~500ns。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于:所述步驟4)中的微秒脈沖參數(shù):0~3000V(場(chǎng)強(qiáng)0~9kV/cm),作用個(gè)數(shù)1~1000個(gè),脈沖間隔0.1S~10S(頻率0.1Hz~10Hz),波形為脈沖方波,脈沖寬度15μs~400μs。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,其特征在于:所述步驟4)中得到的融合細(xì)胞除不同尺寸細(xì)胞融合而成外,還能夠是相同尺寸細(xì)胞融合而成。